hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは複雑で時間がかかります。この最適化されたプロトコルは、高い再現性と無コストで、レチナル組織を生成することができます。このプロトコルの利点は、hPSCからのレチナル誘導の効率と再現性を大幅に高めるために、EBサイズとめっき密度を定量化することです。
この方法では、すべての主要なレチン細胞が順次現れ、レチンの主な段階を再現します。それは、疾患のモデリングと、疾患の変性疾患の細胞治療を促進します。この手順をデモンストレーションすると、博士課程の学生である元元光と、研究室の技術者であるビンビン・シーと一緒です。
DMEMの50 mLに3番目の50回のストック溶液の1 mLを加えることによって、50 mLのECM溶液を調製することから始めます。次に、6ウェルプレートのウェルにこの調製ECM溶液の1mLを加え、摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間インキュベートします。hPSCメンテナンス媒体は、メーカーの指示に従って準備し、室温まで30分間プリウォームします。
液体窒素タンクからhPSCの極低温バイアルを30秒間摂氏37度の水浴でインキュベートして注ぎます。75%のアルコールスプレーを使用して慎重に消毒し、バイオセーフティキャビネットに入れます。バイアルから15ミリメートルのチューブにセルサスペンションを移します。
その後、5 mL ピペットを使用して、5 mL の予温メンテナンスメディアを滴下してチューブに加え、チューブを軽く振ってhPSCをブレンドします。チューブを170回Gで5分間遠心する。慎重に細胞を失うことを避けるために上清の約50マイクロリットルを残して、1 mLピペットを使用して上清のほとんどを除去します。
ペレットを1 mLの維持媒体で再懸濁し、上下にピペット処理します。事前にコーティングされたウェルからECMを取り出し、各井戸に1.5ミリリットルのメンテナンス媒体を加えます。その後、各ウェルに細胞懸濁液の0.5ミリリットルを配布します。
プレートを軽く振ってhPSCを均一に分配します。プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、少なくとも24時間は5%の二酸化炭素を入れて細胞の付着を促進します。毎日培地を交換し、通過hPSCを80%合流で変更します。
Day-0では、6ウェルプレートの1つのウェルから80%合流細胞を除去して分化を開始します。テキスト原稿に記載されているように、EDTA解離解液を有する細胞を収集する。EDTA溶液を取り出し、10マイクロモルフルバスタチンを含む維持培地1mLを加えて細胞解離を停止します。
1 mL ピペットで細胞を収集します。セル懸濁液を100ミリメートル超低いペトリ皿に移し、10マイクロモルフルバスタチンを含むメンテナンス培地の9mLを皿に加えます。皿を2回軽く振って細胞を均一に分配します。
その後、37°Cと5%の二酸化炭素でインキュベーターに入れます。細胞を少なくとも24時間培養した後、顕微鏡下でそれらを観察する。15 mLチューブに9mLのメンテナンス媒体と3mLのNIMを加えます。
細胞培養物を15 mL遠心チューブに移し、あらかじめ温めたNIM混合物を10mL加えます。凝集体を集めるために3分間Gの60倍でチューブを遠心分離する。その後、5 mL ピペットを使用して上清を除去し、約 500 マイクロリットルを残して細胞を失うことを避けます。
チューブに2mLの混合物を加え、サスペンションを同じペトリ皿に戻します。皿を軽く振って、細胞の凝集体を均一に分配します。その後、皿をインキュベーターに戻します。
5日目には、あらかじめコーティングされた料理からECMを取り出し、各料理に10 mLの事前温めたNIMを追加します。Ebsを含む料理を取り出し、顕微鏡の下でEBの品質を確認し、明るく丸いかどうかを確認します。15 mLチューブにすべてのEBを収集し、5分間の決済を許可します。
次に、上清の大部分を取り出し、約2mLの培地を残した。EBを数えた後、10 mLのNIMを含むコーティングされた皿に1平方センチメートルあたり約2〜3 EBの密度でドロップバイドロップします。皿を軽く振ってEJBを均一に分配し、少なくとも24時間保育器に入れます。
タングステン針または1mLシリンジ付きの針を使用して、28日から35日目に隣接する網膜色素上皮と共に、形態学的に識別可能な眼小胞を機械的に取り外します。サスペンションでそれらを培養します。レチナルオルガノイド形成のためのRDMの15 mLを含む各100ミリメートル低い取り付け培養皿に50-60の光学小胞を入れてください。
日-42まで2〜3日ごとに媒体を変更します。レチナル分化を開始するために、hPSCは小さな塊に解き分け、懸濁液中で培養され、1日目からEBを形成した。5日目にECMコーティングされた培養皿にメッキされ、細胞は徐々にEBから移行した。
16日目、誘導培地をRDMに置き換え、神経失調ドメインを形成し、徐々に皿から突き出て、またRPE細胞に囲まれた光学的小胞様構造を形成する細胞を引き起こした。日-28〜35の間に、神経性レチナからなるレチナルオノイドは、RPE球に結合した。片側に、細胞が形成される。
また、ヒトのネイティブな人のレティナの建築的特徴を模倣して、徐々に層に並ぶ神経性の亜型を作り出した。レチナルガングリオン細胞は、まず、神経性前駆細胞から生成され、神経性の腎の基底側に蓄積された。このプロトコルにより、レチナルオルガノイドは、豊かなロッドとコーンの両方を備えた高度に成熟した感光体に発展しました。
感光体細胞は、アマセリン細胞、水平細胞、双極細胞およびミュラーグリア細胞の間に位置し、全ては神経のレチナの中間層に位置していた。このプロトコルの重要なポイントは、Ebsの高品質を作成し、適切な密度でそれらをシードすることです。
