El proceso de inducción de las hPSC a las células de la retina es complicado y requiere mucho tiempo. Este protocolo optimizado puede generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y sin costo. La ventaja de este protocolo es la cuantificación del tamaño de EB y la densidad de recubrimiento para mejorar significativamente la eficiencia y repetibilidad de la inducción retiniana a partir de hPSC.
Con este método, todas las principales células de la retina aparecen secuencialmente y recapitulan los principales pasos del desarrollo de la retina. Facilitará el modelado de enfermedades y la terapia celular para enfermedades degenerativas de la retina. Demostrando el procedimiento, estamos con Yuanyuan Guan, un estudiante de doctorado, y Bingbing Xie, un técnico del laboratorio.
Comience preparando 50 ml de solución de ECM agregando 1 ml de la tercera solución de stock 50 veces a 50 ml de DMEM. Luego, agregue 1 ml de esta solución de ECM preparada a cada pozo de una placa de seis pozos e incube durante una hora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Prepare el medio de mantenimiento hPSC de acuerdo con las instrucciones del fabricante y precalentarlo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Vierta un vial criogénico de hPSCs de un tanque de nitrógeno líquido incubándolo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 segundos. Desinfecte cuidadosamente con un aerosol de alcohol al 75% y colóquelo en un gabinete de bioseguridad. Transfiera la suspensión celular del vial a un tubo de 15 milímetros.
Luego, agregue 5 ml de medio de mantenimiento precalentado gota a gota al tubo con una pipeta de 5 ml, mientras agita suavemente el tubo para mezclar las hPSC. Centrifugar el tubo a 170 veces G durante cinco minutos. Retire cuidadosamente la mayor parte del sobrenadante con una pipeta de 1 ml, dejando aproximadamente 50 microlitros de sobrenadante para evitar la pérdida de las células.
Vuelva a suspender el pellet con 1 ml de medio de mantenimiento mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Retire el ECM de los pozos pre-recubiertos y agregue 1.5 mililitros de medio de mantenimiento a cada pozo. Luego distribuya 0.5 mililitros de suspensión celular en cada pozo.
Agite suavemente la placa para distribuir las hPSC de manera uniforme. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante al menos 24 horas para promover la adherencia celular. Cambie de medio todos los días y pase hPSCs al 80% de confluencia.
En el día 0, inicie la diferenciación eliminando el 80% de las células de confluencia de un pozo de la placa de seis pozos. Recoja las celdas con la solución de disociación EDTA como se describe en el manuscrito de texto. Retire la solución de EDTA y agregue 1 ml de medio de mantenimiento que contenga 10 fluvastatina micromolar para detener la disociación celular.
Recoge las celdas con una pipeta de 1 ml. Transfiera la suspensión celular a una placa de Petri ultra baja de 100 milímetros y agregue 9 ml de medio de mantenimiento que contenga 10 fluvastatina micromolar a la placa. Agite suavemente el plato dos veces para distribuir las células de manera uniforme.
Luego, colóselo en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de que las células se cultan durante al menos 24 horas, obsérese bajo el microscopio. Agregue 9 ml de medio de mantenimiento y 3 ml de NIM a un tubo de 15 ml.
Transfiera los cultivos celulares a un tubo centrífugo de 15 ml y agregue 10 ml de la mezcla NIM precalentada al plato. Centrifugar el tubo a 60 veces G durante 3 minutos para recoger los agregados. Luego retire el sobrenadante con una pipeta de 5 ml, dejando aproximadamente 500 microlitros para evitar la pérdida de células.
Agregue 2 ml de la mezcla al tubo y transfiera la suspensión a la misma placa de Petri. Agite suavemente el plato para distribuir uniformemente los agregados celulares. Luego, vuelva a colocar el plato en la incubadora.
El día 5, retire el ECM de los platos precubiertos y agregue 10 ml de NIM precalentados a cada plato. Saque el plato que contiene Ebs y verifique la calidad de los EB bajo el microscopio, asegurándose de que sean brillantes y redondos. Recoge todos los EBs en un tubo de 15 mL y deja que se asienten durante 5 minutos.
Luego, retire la mayor parte del sobrenadante, dejando atrás aproximadamente 2 ml de medio. Después de contar los EBs, sembrarlos gota a gota a una densidad de aproximadamente 2-3 EBs por centímetro cuadrado en platos recubiertos que contengan 10 mL de NIM. Agite suavemente los platos para distribuir los EBs de manera uniforme y colótelos en la incubadora durante al menos 24 horas.
Use una aguja de tungsteno o una aguja con una jeringa de 1 ml para separar mecánicamente las vesículas ópticas morfológicamente identificables, junto con el epitelio pigmentario retiniano adyacente en los días 28 a 35. Cultivarlos en suspensión. Coloque 50-60 vesículas ópticas en cada plato de cultivo de baja fijación de 100 milímetros, que contenga 15 ml de RDM para la formación de organoides retinianas.
Cambie el medio cada 2 a 3 días hasta el día 42. Para iniciar la diferenciación retiniana, las hPSC se disociaron en pequeños grupos y se cultivaron en suspensión, que formaron EBs desde el día 1. En el día 5, los EBs se colocaron en los platos de cultivo recubiertos de ECM y las células migraron gradualmente fuera de los EBs.
En el día 16, el medio de inducción fue reemplazado por RDM, haciendo que los dominios de la retina neural se formaron y sobresaliendo gradualmente del plato, así como estructuras similares a vesículas ópticas formadoras de células rodeadas de células RPE. Durante los días 28 a 35, los organoides retinianas que consisten en la retina neural, unidos a una esfera de RPE. En un lado, se formaron células.
A medida que avanzaba la diferenciación y especificación de la retina, las hPSC produjeron subtipos de retina neural que gradualmente se alinearon en capas, imitando las características arquitectónicas de una retina humana nativa. Las células ganglionares de la retina se generaron por primera vez a partir de progenitores retinianas y se acumularon en el lado basal de la neurotiniana. Con este protocolo, los organoides de la retina se convirtieron en fotorreceptores altamente maduros con bastones y conos ricos.
Las células fotorreceptoras se localizaron en el lado apical, mientras que las células amacrinas, las células horizontales, las células bipolares y las células gliales muller se localizaron en la capa intermedia de la retina neural. Los puntos clave de este protocolo son crear Ebs de alta calidad y sembrarlos a la densidad correcta.
