慢性HBV感染では、CD4 T細胞はウイルスクリアランスと帰還者の両方において重要な役割を果たす。この方法により、HBV特異的CD4 T細胞応答を評価し、HBV特異的CD4 T細胞エピトープを同時に同定することができます。この手順のデモンストレーションは、研究アシスタントの建明暁です。
そして、ビラオ出身の技術者、シン・ワン。まず、末梢血単核細胞、またはPBMCを血液から単離し、800倍GでFicoll密度勾配遠心分離を20分間使用する。次いで、パスツールピペットを用いて、赤血球層ととの間の顆粒球を収集する。
解凍した細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管に移し、あらかじめ温めたベンゾナーゼRPMI 1640の1ミリリットルを加え、賢明に落とし、ゆっくりと6ミリリットルを加える。キロイオビアルをベンゾナーゼRPMI 1640の2ミリリットルでリンスし、残りの細胞を回収する。その後、チューブをGの400倍に10分間遠心する。
上清を取り出し、チューブをタップしてペレットを緩めます。温かいベンセナーゼNACE RPMI 1640の1ミリリットルにペレットを静かに再中断します。細胞を穏やかに混ぜ、細胞の塊が見えるならば、70マイクロメートルの細胞のストレーナーを通してそれらをフィルターする。
トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して生存細胞を数えます。PBMCsおよび完全な培養培地を、1ミリリットルIL2あたり10単位、および1ミリリットルIL7あたり10ナノグラムを含む。1ミリリットル当たり6細胞に1.5x10に細胞密度を調整します。
その後、ウェルあたり5番目の細胞に3x10の密度で96ウェルフラットボトムプレートに細胞をプレートします。B型肝炎ウイルスまたはHBV由来ペプチドプールを各ウェルに追加します。バックグラウンドとポジティブコントロールウェルズの場合は、同じ量の溶媒を追加します。
プレートを摂氏37度と炭酸ガス5%でインキュベートします。3日目に、IL2の1ミリリットル当たり50単位、IL7のミリリットル当たり10ナノグラムで培養培地を補う。7日目には、培養培地の半分を、1ミリリットルペプチド当たり4マイクログラム、1ミリリットルIL2あたり100単位、および1ミリリットルIL7あたり20ナノグラムを含む新鮮な培地に置き換えます。
10日目に、各ウェルの細胞を7~9回そっとピペットして細胞クラスターを分解する。生存細胞の数を数え、HPV特異的CD4 T細胞応答解析のために96ウェル丸底板の各ウェルに2x10を第5の細胞に移します。96ウェル平底板の残留細胞については、過剰な培地を廃棄して培地の体積を100マイクロリットルに調整する。
次に、100マイクロリットルの新鮮な完全な培養培地で培養を補い、1ミリリットルペプチド当たり4マイクログラム、1ミリリットルIL2あたり100単位、1ミリリットルIL7あたり20ナノグラムを含む。12日目にエピトープ同定のために摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞を培養し続けます。96ウェル丸底板で細胞を洗浄するには、RPMI 1640を200マイクロリットル加え、550倍Gでプレートを3分間遠心し、上清を捨てます。
最後の洗浄のために完全な培養培地を使用して洗浄を2回繰り返します。特定のペプチドプールで刺激された細胞のウェルごとに、同じペプチドプールを添加した完全な培養培地の200マイクロリットルを加える。バックグラウンドコントロールウェルのために、DMSOのミリリットルあたり1マイクロリットルで補った完全な培養培地を追加します。
ポジティブコントロールウェルでは、1ミリリットルDMSOあたり1マイクロリットル、1ミリリットルPMAあたり150ナノグラム、イオノマイシン1リットル当たり1マイクロモルを添加した完全な培養培地を追加します。5%の二酸化炭素で37°Cでプレートを6時間インキュベートします。1時間のインキュベーションの後、培養物に1ミリリットルモネンシンあたり1.37マイクログラムを加える。
6時間のインキュベーションが完了した後、プレートを550倍Gで3分間遠心する。上清を取り除き、先に示したように、200マイクロリットルのDDPで細胞を1回洗います。表面マーカーCD3、CD4およびCD8、および生存マーカーの染色。
ビブラーで細胞を懸濁した後、30分間摂氏4度でプレートを冷蔵します。200マイクロリットルのDPBSでプレートを1回洗浄した後、細胞を固定して透過し、細胞内サイトカイン、TNFアルファおよびインターフェロンガンマの染色を行い、45分間摂氏4度でプレートを冷蔵します。細胞をもう一度洗い、150マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。
次いで、フローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーデータを取得する。T-75フラスコで、アレルギー性Bリンパ芽球体細胞株(BLCLs)を維持する。PBMC拡張の12日目に、実行可能なBLLSの数を数え、15ミリリットル遠心管に移します。
細胞をGの350倍に10分間遠心し、上清を取り除く。細胞ペレットを再懸濁し、培地を完全に培養した。その後、BLLSを4x10で96-ウェル丸底板に、ウェル当たり4番目の細胞、および80マイクロリットルの完全な培養培地にアリコートする。
1つのペプチドのミリリットルあたり10マイクログラムを加え、2つのバックグラウンドコントロールを設定します。HLADRブロッキングを伴うペプチド脈動、およびDMSO脈動。プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%で2時間インキュベートします。
ミトマイシンCあたり100マイクログラムを加え、37°Cでプレートをインキュベートし、1時間5%の二酸化炭素をインキュベートします。プレートを200マイクロリットルのRPMI 1640で3回洗浄し、無パルスペプチドとミトマイシンCを除去し、バイブレーターを使用して完全な培養培地の120マイクロリットルで細胞を再懸濁させた。PBMC拡張の12日目に、PBMCを96ウェルの丸底板に移します。
プレート内の細胞を遠心分離し、上清を取り除き、先に示したように200マイクロリットルのRPMI 1640で2回洗浄します。完全な培養培地の210マイクロリットルで各ウェルのPBMCを再中断します。エピトープ同定のために選ばれたPBMCウェルズのために、細胞懸濁液のアリコート70マイクロリットルおよび2つの背景制御を含む3つのウェルのペプチドパルスBLLSと混合する。
プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%で6時間インキュベートします。1時間のインキュベーションの後、培養物に1ミリリットルモネンシンあたり1.37マイクログラムを加え、完全な培養培地で各井戸の最終体積を200マイクロリットルに引き上げてください。この代表例では、ペプチドプールCore11に対するTNFアルファおよびインターフェロンガンマ分泌CD4 T細胞応答は、背景値の2倍未満であり、したがって、陰性と考えられる。
一方、ペプチドプールCore09に対する応答は、バックグラウンドの2倍以上であり、陽性と考えられる。灰色の背景は、正のCD4 T細胞応答を有するウェルズを示し、エピトープ同定のための候補ペプチドは赤色で示され、Core01はカラムペプチドプール内のTNFアルファおよびインターフェロンガンマの両方から判断して最も高い応答率を有する。ペプチドC1〜15、C31〜45、C61~75、およびC91~105をこのペプチドプールにおいて、それらのペプチドを含むペプチドプールの列として候補ペプチドとして設定され、陽性の結果も示す。
ペプチドプールを用いて拡大したPBMCCore07,08,09,10は、これらのペプチドのエピトープ同定に用いられる。同様に、Core09は、行ペプチドプールにおいて最も高い応答率を有する。このプール内のすべてのペプチドは、ペプチドプールで拡張された候補ペプチドおよびPBMCとして設定されています:Core01、02、03、04、05および06は、これらのペプチドのエピトープ同定に使用されます。
ペプチドプールCore08拡張PBMCの場合、ペプチドC31から45パルスBLLSで刺激した後、TNFアルファおよびインターフェロンガンマ分泌CD4 T細胞の周波数はバックグラウンドコントロールの2倍高くなります。従って、ペプチドC31〜45は、CD4 T細胞エピトープに制限されたHLADRを検証した。そこにあったが、エピトープ同定後に残存する追加の拡大されたPBMC。
同定されたエピトープの細かいマーキングは、短いペプチドのパネルを用いて行うことができる。
