ヤヌシュケ研究所での作業は、ウェルカム信託助成金100031/Z/12/Aと1000032/Z/12/Aによってサポートされています。組織イメージング機能は、ウェルカムからの助成金WT101468によって支えられている。

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila.">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture.">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588 (2013).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts.">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

D.メラノガスター幼虫脳全体のライブイメージングは、生理学的文脈に近い状態で非対称神経幹細胞分裂を観察する機会を提供する。私たちのプロトコルの最初の部分は、幼虫の脳の解剖に関する私たちのアプローチを紹介します。すでに述べたように13,準備の重要な側面は、脳を損傷を避けることです..この最も困難な側面は、脳を過度に引っ張ることなく、隣接する想像力ディスクから脳を分離することです。「引っ張らずに切断する」という当社のアプローチは、1対の鉗子の先端を持つ粉砕運動を行うか、組織間の接続を保持する他の2つの鉗子チップに沿って鉗子の先端をスライドさせることであるのに対し、Leritらは解剖ピンでのソーのような動きを説明する。私たちは、すべてのアプローチを試してみて、自分自身のために最も適したものを採用するために実験者に助言します。また、分離された脳を移動するための解剖ツールではなく、BSAまたはFCSコーティングされたピペットチップを使用することをお勧めします。コーティングはティッシュがプラスチックに付着するのを防ぎ、彼らが移管の間に解剖用具に付着する可能性のある一過性変形にそれらを従うことなく、常にそれらを完全に浸したまま組織の安全な移動を可能にする。コーティングされた先端は、一度にいくつかの脳の転送を可能にする他の利点を有し、これは特定の媒体内のサンプルの居住時間を制御することが重要である場合に特に有用である。それらは他の組織の移動に適しており、例えば脂肪体のような脆弱なものでさえも、それらは、他の組織の移動に適している。大きなチップを使用するか、先端の先端を切断することで、さまざまなサンプルサイズに対応できます。
次に、このプロトコルは、培養皿のカバースリップに幼虫の脳を固定化するためのフィブリノーゲン凝固の使用を記述する。脳は、培養培地+フィブリノーゲンの一滴以内に配向され、その後、凝固はトロンビンの添加によって誘発される。フィブリン形成は緩やかであり、必要に応じてサンプルの向きを微調整できる時間枠を設ける(図2C)。幼虫の脳の場合に対して助言するサンプルのわずかな圧縮が必要な場合は、ステップ3.4.4と3.5.2の間に多かれ少なかれサンプルの近くに血栓を押すことによって細かく調整することができます。このフィブリノーゲン凝固の主な利点は、ガス透過膜とカバースリップの間に脳が取り付けられるLeritららで説明されているプロトコルに対する、ライブイメージング中に培養培地を交換する能力である。私たちのプロトコルよりもガス透過性膜を使用する可能性のある利点は、脳が血栓といくつかの媒体によって空気から分離されるため、サンプルの最適な酸素化を提供できることです。このため、培養皿内の培養培地の量の影響を評価しなかったが、血栓を完全に浸漬したまま血栓の上に培養培地の量を制限することを提案する。
血栓の操作は実験的に困難で時間がかかるため、実験者はサンプルなしで血栓を操作する最初の練習をすることをお勧めします。カバースリップ上の培養培地+フィブリノーゲンの滴の体積を調節すると、フィブリノーゲンの濃度またはトロンビンの体積と濃度は、準備を容易にするのに役立ち、プロトコルを他のタイプの組織に適応させる際に重要である可能性がある。血栓を操作する十分な経験を持つ複数の脳は、必要に応じて1つの血栓に固定することができますが、方向の微調整を複雑にします。いくつかの血栓は、例えば、異なる遺伝子型のサンプルを画像化することを可能にする、カバースリップ上に形成することができる。同じカバースリップ上の異なる血栓を異なる培養培地に露出させることも可能であるが、異なる血栓を覆う培養培地の滴を混ぜることは決して注意する必要が有る。幼虫の脳が固定化され、ライブイメージングの準備ができたら、過度の光損傷を避けるためにLeritら13 の勧告に従うことをお勧めします。これらの推奨事項に加えて、ステージインキュベーターでのライブイメージング中に脳を25°Cで維持するだけでなく、イメージング開始前に少なくとも30分間この段階を予熱します。私たちの手の中では、体系的にそうしないと、強い焦点ドリフトが生じます。
ライブイメージング後にサンプルをサンプルに対して相関顕微鏡および固定および免疫染色を行うことができる場合もある文脈において有利であり得る。しかし, Fibrin 血栓を使用する制限は、機械的に損傷を与えることなく、血栓から脳を分離することはほぼ不可能です。.この制限を克服する方法としては、プラスミンでフィブリン血栓を分解する方法を開発するか、フィブリン重合を可能にするノブを模倣したペプチドを添加して血栓分解を誘導する方法を開発することができる。私たちは通常、単一細胞から200μMの長い組織までのサンプルにFibrin血栓を使用しますが、幅3mm以上の成人バンブルビーの血栓や画像脳に固定化することに成功しました。血栓中で固定化できるサンプルサイズの上限は未定である。同様に、通常は4〜5時間の固定化サンプルを画像化したが、一次培養における神経芽細胞の画像化に最大3日間成功し、血栓が少なくとも長期的な生存率を妨げないことを示した。それどころか、血栓は、この目的のために蠕動ポンプなどの装置を必要とせずに、培地の定期的な交換を容易にすることができ、より長期的なイメージングの要件である。フィブリン血栓の透過性パラメータは測定されていませんが、血栓の繊維状のゲル状の性質は、細胞透過性分子によって浸透可能であるように見えます。我々は、ラトルンクリンA、コルセミドまたは1-NAPP1、HALOタグリガンドおよび細胞生物学に使用される他の標準的な染料が問題なくフィブリン凝固体の細胞に到達し、これまでのところ血栓によって保持される分子に遭遇していないことを発見した。
結論として、Fibrin血栓を使用すると、生きたイメージングのために生体組織を固定する方法を実装する信頼性が高く、比較的容易になります。横方向漂流を制限する上での有用性を超えて、生画像中に培養培地を変化させる能力は 、D.メラノガスター 神経芽細胞21の非対称細胞分裂を研究するための我々の化学遺伝学アプローチにとって非常に貴重であることが証明された。我々は、この技術は、特に化学遺伝学または例えばタンパク質自己標識29を含む場合、さまざまな組織の広い範囲での研究に有益であると予想される。
MultiHyperStackReg マクロは、スタックの連続したフレームまたはスライスを整列する TurboReg ImageJ プラグインと、他のスタックに変換を適用できる MultiStackReg ImageJ プラグインに依存しています。MultiHyperStackRegは、単にハイパースタック(少なくとも4次元のスタック)にこれらの変換を適用することができます。MultiHyperStackRegの使用は、我々が説明しているように、多くのアクションを必要とし、非常に時間がかかる可能性があります、また、自動的にステップ6.2と6.3で説明されているすべての手順を実行するAutoHyperStackRegマクロを書きました。しかし、マルチハイパースタックレグに反して、AutoHyperStackRegは現在、このスタックのサブ領域に基づいてスタックのアライメントを計算する可能性を欠いている、我々は満足のいくアライメントのために時々重要であることがわかったオプション。AutoHyperStackReg のもう 1 つの制限は、その使用は変換に制限され、TurboReg と MultiStackReg によって提案される他の変換ではなく、MultiHyperStackReg は、ユーザーが必要とする変換型をハイパースタックに適用できるということです。今後のリリースではこれらの機能が実装され、GitHub30で利用できるようになります。最後に、私たちの回転ラインカンマクロは、皮質が時間の経過とともにその位置または向きを変更した場合でも、時間経過中の皮質信号を迅速に測定する簡単な方法を提供します。追跡モードか非トラッキングモードかは、分析に最適かは、皮質信号の品質と一貫性に依存します。トラッキングモードは、ユーザーが時間ポイントごとに皮質がどこにあるかを考慮する必要がなく、時間の経過とともに位置と向きの大きな変化に対応できるため、より使いやすくなります。しかし、皮質信号が映画全体の間に検出するのに十分な強さのままである場合にのみ適しています:皮質以外のものを検出できなかった(例えば、皮質に近い明るい細胞質コンパートメント)は、次のタイムポイントごとに検出を損なう可能性があります(例えば、細胞質コンパートメントは皮質から離れ、皮質ラインスキャンは残りの時間のためにそれを追う)。非追跡モードでは、検出がユーザーによって最初に描かれた線に限定されています(例えば、明るい細胞質コンパートメントは、検出ゾーンから離れて移動すると、皮質の位置や方向が時間の経過とともに大きく変化する場合、検出が失敗する可能性があります)。トラッキングモード用に開発される次の機能(GitHub30で利用可能)は、指定されたタイムポイントのみを分析し、(最初のタイムポイントではなく)基準タイムポイントを定義するオプションであり、その後に検出が実行され、ユーザーは少なくとも問題のあるタイムポイントを避けられるようにします。

ショウジョウバエは、生物学的な問題の広大な範囲を研究するための重要なモデルシステムであり続け、何十年もの間、多くの分野で知識を進める上で優れています。特に目立つ機能の1つは、ライブイメージングに特に適していることです。細胞内のプロセスや細胞や組織の挙動をリアルタイムで監視する能力は、細胞生物学や発生生物学に関連する重要な概念の生成に貢献し続けています。多くの成功したプロトコルは、このようなショウジョウバエサンプルを生きて健康に保つために、異なるグループによって開発され、標本および蛍光分子の挙動を研究しています。例えば、イマジナルディスク1、2、幼虫脳3、4、5、6、または成人女性の卵室から器官および組織は、例えば、経過顕微鏡でイメージング用の培養物中に保存することができる。ライブイメージングの重要な課題は、機械的衝撃に敏感なサンプルの完全性を損なうことなく、最適な分解能と不動性のために、試料をイメージング表面の近くに保つということです。例えばショウジョウバエ幼虫脳の神経芽細胞またはニューロンと呼ばれる神経幹細胞を研究するために、サンプルを被覆画像体11、12、13の培養培地で覆うことによって、画像表面の近くにサンプルを保持させることが可能である。しかし、このアプローチでは、メディア交換が容易に行えないため、実験室の操縦が制限されます。あるいは、サンプルを調製し、細胞の接着を増加させ、開いた培養皿におけるマルチポイント訪問顕微鏡および拡張ライブセルイメージングを可能にするために処理されたカバースリップに置くことができるが、それは潜在的に媒体交換を可能にするが、メディア交換中のサンプルのドリフトまたは損失を防ぐ容易な手段を提供しない14、15。
もともと生きているクレーンフライ精子細胞16における明治の病原生を研究するために開発されたフィブリン血栓法は、これらの問題を克服するために特に適している。フィブリノーゲンは、関連する培養培地に溶解し、トロンビンが添加される前に適切なガラス表面イメージングチャンバー上にこの溶液の滴に配置および配向したサンプルは、不溶性フィブリン凝固の迅速な形成をもたらし、サンプルを培養培地への試料のアクセスを確保しながらガラス表面および試料に付着する粘着性の線維性メッシュをもたらす。その後、血栓またはサンプル位置を摂動させることなく、培地を交換することができる。例えば、イメージング時の培地交換は、阻害剤が元の方法のように添加される場合や、洗い流しやパルス追跡実験のために、または細胞および組織を所定の位置に保ちながら生細胞イメージング中に蛍光色素を添加する場合に望ましい。フィブリン血栓は、ショウジョウバエ組織のイメージングに適しているだけでなく、個々の細胞13、17。フィブリン血栓は、フィブリン血栓内のサンプル位置と血栓自体の形状を調節することによって、その形状または他の特性のために、通常は望ましい方向に向けることができないという、サンプルを配向するのに役立つさらに使用することができる。
ここでは、現在のFibrin血栓ベースのイメージング方法に関する最新情報を提供し、セグメンテーションベースの画像分析のためのツールを提供し、この方法を使用して発達中のハエ脳の神経芽細胞分裂を研究することに焦点を当てています。私たちは、同じ培養皿の異なる血栓の複数のサンプルに従うためにFibrin血栓法を日常的に使用しています。これにより、i)マルチポイント訪問を使用して同じイメージング設定で異なる遺伝子型の薬理学的治療時にサンプルの挙動を監視する、セントロソーム挙動やmRNA局在化生18、19、iiなどの細胞内イベントのイメージングが可能になります。 顕微鏡20、iii)酵素21およびivの急性阻害の影響を研究する)標的レーザーアブレーション22に対する生理的環境内の細胞分裂の細胞の向きの変化を研究するために漂流を最小限に抑える。トロンビンとフィブリノーゲンとフィブリン血栓の望ましくない効果は、各サンプルについて経験的にテストする必要がありますが、 この方法は、生細胞イメージングによって分析されるあらゆる種類のサンプルを固定化するのに適しており、ショウジョウバエでは神経芽細胞生物学5、19、20の複数の側面を研究するのに成功しているが、また、女性生殖細胞系幹細胞23の細胞センサー突起のダイナミクスおよび急性APKCの卵胞阻害時の極性の変化も研究に成功している。
タイムラプス蛍光イメージングは、この定量的情報を抽出する方法を必要とする複雑な時間分解3Dデータセットの生成をもたらします。ここでは、ショウジョウバア幼虫脳の神経芽細胞または一次細胞培養中の個々の神経芽細胞の皮質タンパク質を定量化するために開発された細胞皮質におけるマルチチャネル蛍光の半自動定量を可能にするハイパースタックおよびカスタムメイドのImageJマクロの漂流を修正するために使用できるImageJベースの24マクロのさらなる開発について説明する。

<table><tbody><tr><td>Albumin bovine serum, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from human plasma</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex spot plate with nine depressions</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

ショウジョウバエ は、生物学的な問題の広大な範囲を研究するための重要なモデルシステムです。イマジナルディスク、成体女性の幼虫の脳や卵室、または成人の腸などの異なる発生段階の様々な器官および組織を抽出し、タイムラプス顕微鏡でイメージングするために培養中に保持することができ、細胞および発生生物学に関する貴重な洞察を提供する。ここでは、 ショウジョウバエ 幼虫脳の解剖に関する現在のプロトコルを詳細に説明し、フィブリン血栓を使用してガラスカバースリップに幼虫脳および他の組織を固定化および配向させる現在のアプローチを提示する。この固定化法は、培養培地にフィブリノーゲンおよびトロンビンを添加するだけで済む。同じ培養皿内の複数サンプルの反転顕微鏡での高解像度タイムラプスイメージングに適しており、マルチポイント訪問顕微鏡で顕微鏡ステージの動きによって頻繁に引き起こされる横漂流を最小限に抑え、イメージングの過程で試薬の添加および除去を可能にします。また、ドリフトの修正や、タイムラプス分析から特定の定量的情報を抽出して処理するために日常的に使用するカスタムマクロも紹介します。

ライブイメージング中にフィブリン血栓および培養培地交換を伴うショウジョウバエ組織の固定化 ステップ2で示した手順に従って解剖された後(図1)、ステップ3(図2)で示した手順に従って同じカバースリップ上のフィブリン血栓に固定化された後、極性タンパク質Par-3のフライオルソログであるGFPタグ付きバズーカ(Baz::GFP)を発現する幼虫脳を、時間多位共像画像で30分間イメージングした。Baz::GFPはapkcas4と組み合わされ、小さなATPアナログ1-NAPP120を添加することにより非定型タンパク質キナーゼC(aPKC)の急性阻害を可能にするアレルである。したがって、ステップ4で提示した手順に従って培養培地に1-NAPP1を添加し、2.5時間ライブイメージングを再開した。野生型のキナーゼaPKCを運ぶ制御脳はATPアナログに反応しなかったが、APKCのアナログ感受性突然変異(apkcas4)を付加的に運ぶ脳は、神経芽細胞およびそれらの子孫におけるバズの神経エピテリウムおよび明るいクラスターの収縮を示した(図6、ビデオ1)。神経芽細胞はタイムラプスを通して分裂し続け、組織が健康であり続けることを示し、脳は培養培地の変化にもかかわらずほとんどドリフトを示さなく、それらが十分に固定されていることを示す。同様に、27で示された手順に従って解剖された後、Bazを発現する卵巣は、同じカバースリップ上のフィブリン血栓に固定化され、8分間イメージングされ、その後1-NAPP1の適用はapkcas4変異濾胞細胞の収縮を誘発したが、コントロールは誘導しなかった(図7、ビデオ2)。
マルチハイパースタックRegを使用して横およびフォーカスドリフトの補正。 横向きとフォーカスドリフトの両方を表示するハイパースタック(ビデオ3、左パネル)は、まず横ドリフト(ステップ6.2、図3、ビデオ3、中央パネル)を補正し、MultiStackRegプラグインとMultistackHyperRegマクロを使用してフォーカスドリフト(ステップ6.3、図4、ビデオ3、右パネル)を補正し、元のハイパースタックで観察された動きを大幅に減少させました。
回転ラインスキャンを用いた皮質信号測定 Baz::GFP(緑色)と赤外線蛍光タンパク質でタグ付けされた膜貫通タンパク質CD4(CD4:mIFP、赤)を1回の有糸分裂の間にイメージングした。CD4::mIFPシグナルは、ラインカンを用いて神経芽細胞の様々な部分で皮質を検出するための基準として使用された(ステップ7、図5、図8A–C)とBaz::GFP信号を検出された位置で測定した図8D)。分裂の間、神経芽細胞は、尖極と基底極という明確で反対の皮質ドメインを確立することによって一過性に分極した。Bazは、補助極を定義し、一貫して、Baz::GFP信号は神経芽細胞の尖極で増加し、分裂中に基底極で減少した(図8C,D)。皮質の位置は、タイムラプスを通して満足して追跡された(図8C、ビデオ4)。ショウジョウバエ線と遺伝子型は補足表1–2で参照されている。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> 図6:ライブイメージング中に固定化された幼虫脳にATPアナログを適用する。(A) Bazを発現する2つの幼虫脳のライブイメージング::GFPは、同じカバースリップに固定化。培養培地は、0分でATPアナログ1-NAPP1の10μMの濃度に変化する。コントロール脳はATPアナログに目に見えて反応しないのに対し、APKC(aPKCAS4)の類似の敏感突然変異を運ぶ脳は、神経芽細胞とその子孫における神経エピテリウム(矢印)およびバズの明るいクラスターの収縮を示す。23 μMの深さのための33のスライスの最大強度の投射はスケール棒:20μM.(B)神経エピテリウムの拡大。スケールバー:10 μM.<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> 図7:ライブイメージング中に固定化された卵室にATPアナログを適用する。Bazを発現する2つの卵巣のライブイメージング::GFPは同じカバースリップに固定化。培養培地は、0分でATPアナログ1-NAPP1の10μMの濃度に変化する。コントロール卵室はATPアナログに目に見えて反応しないのに対し、aPKC(aPKCAS4)の類似の敏感な突然変異を運ぶ卵室は、最終的に付着接合の明らかな崩壊につながる上皮(矢印)の収縮を示す。27 μMの深さのための33スライスの最大強度の投影: 20 μM:<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">この図のより大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> 図8:回転ラインスキャンを用いた皮質信号の測定。(A) Bazを発現するライブD.メラノガスター神経芽細胞::GFP(緑)とCD4::mIFP(赤)。シアンライン:測定する様々な皮質ゾーンに垂直にトレースされた最初のスキャンライン。スケールバー:5μM.(B)皮質ラインカンとCD4::mIFP(赤)を基準チャンネルとして使用した皮質(濃い青色の線)の同定。シアンライン:「周りを測定する」パラメータ(ここでは2ピクセル)によって定義される領域で、ここで、信号は皮質検出後に測定される。スケールバー:2μm(C)シアン:(A)に表示される最初の走査線から、(A)に表示される回転ラインスキャン法によって神経芽細胞分裂中に同定される皮質領域を、基準チャンネルとしてCD4::mIFP(赤)を用いた。スケールバー:5 μM.矢印:尖極。矢印:基底極。(D) で表示される回転ラインスキャンによって識別される 2 つの対応するゾーンにおける Baz:::GFP信号強度の時間経過に伴う測定有糸分裂の間、Baz::GFPは神経芽細胞の尖極で一過性に濃縮され、反対側の基底極から枯渇する。<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ1:ライブイメージング中に固定化された幼虫脳にメディア交換を適用して阻害剤を追加し、図6、スケールバー:20μmを<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">追加します。</a>
ビデオ2:ライブイメージング中に固定化された卵室でのメディア交換の適用は、インヒビターを追加するために、図7、スケールバー:20 μmを<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">追加します。</a>
ビデオ3:マルチハイパースタックレグを使用して横向きとフォーカスドリフトの補正。 膜プローブPH::GFPを発現する神経芽細胞のライブイメージング。Xy:単一焦点面。Xz:直交リスライス。左:ドリフトの補正前。中央:横ドリフトの補正後。右:補正後、横向きとフォーカスドリフト、スケールバー:10 μmを <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">クリックしてください。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ4:回転ラインカンを使用した皮質の検出、図8、スケールバー:5 μmを<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">使用して、このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表 1: ショウ ジョウバエ 組織の画像化された遺伝子型。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
補足表 2: 使用されるトランス遺伝子の起源。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
補足コーディングファイル 1:使用されるトランス遺伝子の起源。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル 2:使用されるトランス遺伝子の起源。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル3:使用されるトランス遺伝子の起源。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

このプロトコルは、Fibrin血栓を使用したサンプル固定化のアプリケーション、ドリフトの制限、およびライブイメージング中の試薬の追加と洗い流しを可能にするアプリケーションを記述します。試料は、カバースリップの表面に培養培地を含むフィブリノーゲンの滴に移され、その後、トロンビンを加えることによって重合が誘導される。

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによる ショウジョウバエ 組織固定化の応用

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K ビュー.  University of Dundee. このプロトコルは、Fibrin血栓を使用したサンプル固定化のアプリケーション、ドリフトの制限、およびライブイメージング中の試薬の追加と洗い流しを可能にするアプリケーションを記述します。試料は、カバースリップの表面に培養培地を含むフィブリノーゲンの滴に移され、その後、トロンビンを加えることによって重合が誘導される。

ビデオ: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

生物工学

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

ライブの視覚化ショウジョウバエ</em蛍光色素で>グリア - 神経筋接合部

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

生物学

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

の調製ショウジョウバエ</emハンギングドロッププロトコルを使用してライブイメージングのための>胚

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

神経科学

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによるショウジョウバエ組織固定化の応用

要約

さらに動画を探す

この動画の章

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用

ライブの視覚化ショウジョウバエグリア - 神経筋接合部

の調製ショウジョウバエ胚

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

開発と大人の準備ショウジョウバエ脳と網膜

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる

長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによる ショウジョウバエ 組織固定化の応用

要約

さらに動画を探す

この動画の章

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用

ライブの視覚化ショウジョウバエグリア - 神経筋接合部

の調製ショウジョウバエ胚

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

開発と大人の準備ショウジョウバエ脳と網膜

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる

長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによるショウジョウバエ組織固定化の応用