Name: in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

ジャン = バティスト ・ Sibarita とダニエル ・ ショケ (会社の IIN、CNRS/ボルドー大学) の単一分子解析とフレンドリーな対応感謝します我々 は特に、ニック Valmas を感謝し、ジェシカ Mcgaw (下さい QBI、クイーンズランド大学) ビデオの録画、ナレーションと同様、グラフィック デザインを図します。この仕事に支えられたオーストラリアの研究評議会 (AR) 発見プロジェクト (F.A.M. DP170100125)、オーストラリアの研究評議会 (F.A.M にリーフ グラント LE0882864)、未来の交わり (B.V.S.、FT100100725)、オーストラリア研究会議 (リーフ グラントF.A.M に LE130100078。)・ NHMRC プロジェクト (B.V.S.、APP1103923) を付与します。F.A.M NHMRC 主任研究員 (ONT1060075) であります。

1. mEos2 付けられた蛋白質を表現する遺伝子組換えショウジョウバエのデザイン
<ol><li>MEos2 タンパク質とタグに蛋白質を選択します。画像処理の成功率を上げるには、膜貫通ドメインを持つタンパク質で選択神経膜14 (例えば、変異シンタキシン 1 a)、シナプス小胞またはオートファゴソーム26,27 (例えば、蛋白質Synaptobrevin-2)、または神経の膜蛋白質 (例えばMunc18 1) と密接な相互作用と細胞質蛋白質。</li>
	<li>MEos2 タグ付きタンパク質 (図 1) をエンコードする遺伝子を構築します。蛋白質および mEos2 のための前方および逆のプライマーを設計します。 注: mEos2 コーディング シーケンスは興味の蛋白質の C 末端に融合するように設計された pmEos2 N1 プラスミッドから増幅することができます。クローニングなど、酵母pFL44S を使用して体内組換えによって行うことが-attB-MCS-w +14,28のベクトル、ギブソンなど他のクローンの作成方法を使用できる代わりにアセンブリ プロトコル29。<ol>
<li>病原と XbaI ベクトルを線形化し、共同ura3 mEos2 および興味の蛋白質を符号化する PCR のフラグメントと酵母細胞に変換します。トランスジェニック フライ ライン30を生成する構築とショウジョウバエの胚を注入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リアの標準酵母、糖蜜培地またはプラスチック バイアルに含まれているいくつか他の適切な代替のトランスジェニック フライ文化。確実に健康的なかなり大規模なシナプス研究31をバイアル、過密のハエや毎日産卵; の後新しい瓶にハエを反転これにより第 3 齢幼虫も供給し、彼らは媒体の徘徊開始時間によって適切なサイズに達する。室温 (25 ° C) でトランスジェニック フライを上げます。 注: 大きなシナプス ボタン イメージの中に可視化蛋白質の大きい量を生成する傾向があります。</li>
</ol>2. 第 3 齢幼虫の郭清
<ol><li>円柱状または凹形ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基本引時間: 20 mm 径と引時間: 20 mm の高さの適切なシリコーン エラストマー キット (図 2 a) を使用して。硬化剤 10:1 の比率でシリコーンとシリコーン ・ エラストマーをミックスします。<ol>
<li>5 分、dimsensions と金型に混合物が上記を注ぐのため徹底的に混合物をかき混ぜなさい。45 分間 100 ° C のオーブンで強化しましょう。PDMS のベースは、郭清を行う基盤として機能します。ガラス底培養皿のよく収まる PDMS ベースを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バイアル壁から放浪の 3 令幼虫を選択します。4.5 倍率光学ステレオ顕微鏡を使用して、幼虫を背側と PDMS 円筒底面配置を視覚化します。</li>
	<li>使用する曲線し、口フック、前気門を拡張する 2 つの頭と 2 つの後部気門の間、肛門の上尾 minutien ピンを固執するピンセットします。固定化の幼虫に室温でシュナイダーの昆虫媒体の 40 μ L を追加します。 注: (HL3 または HL6) Hemolyph のようなソリューションは、シュナイダーのソリューション32,33の代わりにも使用可能性があります。</li>
	<li>壁の正中に切開に minutien ピンの使用によって幼虫の腹部体壁の背側でアクセスを提供します。</li>
	<li>体壁を切るに使用春はさみを切開ポイントから開きます。前後方向34で正中線に沿ってカットします。</li>
	<li>微細鉗子を使用し、春の幼虫を独特にはさみ: 唾液腺、気管や腸など内臓を削除します。シュナイダーの昆虫の中で 2 回幼虫を洗います。</li>
	<li>微細鉗子で 2 体壁フラップを保持、穏やか、それらをストレッチして、それぞれの側に 2 つの minutien ピンをスティックします。これは六角形の準備 (図 2 a) を生成する必要があります。</li>
	<li>イメージ投射; 中に筋肉の動きの可能性を減少する春のはさみを使用して腹側神経索から脳をデタッチします。これはまた平らなイメージングの料理準備を保持するために提供しています。PDMS ベースにすべての六つの minutien ピンをプッシュするのに、ピンセットを使用します。 注: 腹壁内のピンの小さな部分だけを埋め込む必要があります。</li>
	<li>幼虫が、術を生存していることを確認は、やや腹側神経索を突く、これは幼虫の腹部壁の蠕動収縮を引き出す必要があります。</li>
</ol>3. やや斜め照明単一粒子追跡顕微鏡
<ol><li>ガラス底培養皿に切り裂かれた幼虫 PDMS ベースを反転します。室温シュナイダー昆虫媒体 (図 2 b) の 2 mL でイメージングの皿を満たし。</li>
	<li>腹筋 6 と 735 63 x を使用してシナプスの 2 番目と 3 番目のセグメントの運動ニューロンを検索/1.2 蛍光の全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡の NA 水浸対物レンズです。</li>
	<li>顕微鏡の接眼レンズを使用して切り裂かれた幼虫; を検索明視野照明の使用によって筋 6 を識別します。</li>
	<li>顕微鏡取得ソフトウェアを使用 (材料の表を参照)、全反射構成で浸透深さを増加する、それ以外の場合全反射臨界角から斜めの照明を達成するために移動を 1 ° コリメータ カメラ アングルまでスライドさせます。</li>
	<li>緑の mEos2 を視覚化する 488 nm レーザーをオンに。低いレーザー力を使用 (22.8 の 5% 未満 mW) 緑の蛍光性を漂白を避けるために。(これは文字列のビーズのように見える) 神経筋接合部を検索し、全反射する、低解像度の画像を取得します。</li>
	<li>同時に 405 nm レーザーのスイッチ (緑から赤の種の photoconverts の mEos2) 561 nm のレーザー (画像 photoconverted 赤 mEos2) 確率的単一 mEos2 蛍光蛋白質を集中させる。 注: 405 nm レーザの低消費電力の使用は推奨 (4.78 の 0.9% に 0.005 mW) 映画集録時に比較的一定光電率のことができます。50 と 75 %561 nm レーザーの間 (20.1 mW)、これは周囲の神経筋接合部、筋肉組織の形態に悪影響せず赤 mEos2 種からの蛍光性を取得するための十分な。</li>
	<li>各神経筋接合部チェーン シリーズ以上で構成される 15,000 フレーム 33 Hz」下車 as.czi 形式保存可能な参照の付属メタ データを保存するために時間を取得します。</li>
	<li>'.Czi' 映画ファイルを「.tiff」ファイルに変換するのに ImageJ を使用します。</li>
	<li>フィジー/ImageJ37トラッキング解析ソフトウェア11,14,36 TrackMate など適切な分子を取得した映画を分析 (材料の表を参照してください)。'X' と 'y' を検索各ローカライズ強度ポイントのガウスのフィットでの座標分布関数 (PSF)。 注:トラブルシューティング: 緑色蛍光を観測されていないか、または 488 nm レーザーへの露出に神経筋接合部が暗すぎる場合は簡単に、photoconverting とレーザー イメージングをオン (405 nm と 561 nm) これは赤いのより多くを作り出すを助けるように、mEos2 の種。488 nm レーザーに切り替えてし、TIRF 画像を取る。</li>
</ol>4. 単一分子局在固定幼虫
<ol><li>パームを介してタンパク質ナノクラ スターのサイズを測定、定着剤 - リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈した 4% パラホルムアルデヒドで郭清後シュナイダーの昆虫媒体を交換してください。</li>
	<li>室温で 30 分間幼虫を孵化させなさい。</li>
	<li>削除解剖ピンし、固定の幼虫が、1.7 mL クリア スナップ ロック遠心チューブです。</li>
	<li>解剖し、修正は他の多くの幼虫、必要に応じて、それら 3 回 PBS で洗浄します。</li>
	<li>PBS をブロック バッファー (PBS、0.1% トリトン X-100 および 3% のヤギ血清のソリューション) に置き換えます。</li>
	<li>3 回は、PBS で幼虫を洗浄し、(ブロック緩衝液で希釈した) 必要な一次抗体とインキュベートします。</li>
	<li>4 oc. で一晩インキュベートします。</li>
	<li>PBS に幼虫を 3 回洗浄し、(ブロック緩衝液で希釈した) 必要な二次抗体とインキュベートします。</li>
	<li>PBS に幼虫を 3 回洗いは、PDMS ベース、およびイメージの単一分子追跡のため前述のように幼虫を取り付けます。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、ショウジョウバエの 3 令幼虫の神経筋接合部で mEos2 タグ付きタンパク質の単一分子追跡について説明します。遺伝子組換え蛋白質の過剰発現を避けるためには、変異シンタキシン 1 a mEos2 式は内因性変異シンタキシン 1 a プロモーターによって駆動されました。シナプス蛋白質の移動性に関する研究はほとんど体外培養細胞と大脳皮質ニューロン9,11,12,13の調査に限られています。これらの蛋白質が生きている動物のようなモビリティ署名を展示かどうかは、あまり知られていません。単一蛋白質の移動性生体内可視化するには、光学的透明性、アクセシビリティ、および浸透深さなど制限が克服しなければならないあります。幼虫の準備を解剖と神経筋接合部、筋肉の表面に埋め込まれたを可視化、光透過性とアクセシビリティの問題を避けてください。通常の全反射設定イメージ分子移動しようは失敗を証明しました。ただし、貫通深さ増加励起レーザーのやや斜めの照明の使用ができます。さらに、幼虫を固定するために使用 minutien ピンは蛋白質の移動性に麻酔使用の可能な影響を避けるために貢献。高い倍率の目的、油浸漬目標 × 100 などを使用して、単一分子の生体内を視覚化することが可能です。ただし、拡大率が焦点の外のドリフトの発生を高める可能性があります。さらに、我々 は低強度 (30%) を使用しています。561 nm レーザー画像単一分子運動神経終末に正常に。追加のテストより低いレーザー力を使用する必要があります。
このプロトコルは、神経細胞の細胞膜の近さ内のシナプス蛋白質の移動性を視覚化に適しています。このアプローチを使用する - 変異シンタキシン 1 a とタンパク質 Atg18a をバインドされたオートファゴソーム - スネア蛋白質の移動性は正常にイメージで vivo14,26をされています。運動ニューロン軸索することができます蛋白質の移動性は、27を検討しました。しかし、脳の腹側神経索蛋白質の移動性の調査により、基になる組織作り出された高いバック グラウンド信号を評価することは困難証明するかもしれないさらに、蛍光 (replicability ように) 脳構造のタグ付けが必要になります同じ脳構造の蛋白質の移動性の可視化とデュアル カメラ画像の使用が必要になります。
ショウジョウバエの超解像顕微鏡に使用できる現在の方法より開発第 3 齢幼虫38,39ではなくほとんどイメージング胚に限定。これらのプロトコルの主な問題は彼らがイメージ領域における軌道の数が少ないをもたらす、したがって移動状態22,40の詳細な分析を防ぐ。私たち生体内単一分子追跡プロトコルは軌道の数が多いを生成する能力を持っているし、 Caenorhabiditis 線虫ゼブラフィッシュなど他の動物モデルのため、可能性があります。確かに、すべて NMJ チェーンは、さまざまなモバイル状態やこれらの状態14,27間の遷移分析に適して 〜 2,400 軌道を生成しました。さらに、多く生体内単一分子イメージング戦略は、イメージングの実行される生理学的な機能を変更するか、動物20,22を動けなく麻酔薬の使用に依存します。ここで我々 は minutien のピンを使用して幼虫を固定する '麻酔無料' プロトコルを最適化されています。
このプロトコルの潜在的な使用は、3 つの次元で蛋白質の移動性を可視化するかもしれません。超解像顕微鏡の最近の進歩により蛋白質の移動性を可視化する生体外で'x' で 'y' と 'z' 寸法41,42。私たちの現在のメソッドは、'z' 軸の蛋白質の移動性については考慮しません。まだショウジョウバエモーター神経ターミナルは球状構造を三次元ボリューム43蛋白質の移動性を定量化する貴重な将来のアプローチになります。Z 次元のイメージングは、乱視のレンズを使用して実現可能です。また、全反射モード44,45, z 座標精度が増加もします。しかし、実験では、乱視のレンズなし syntaxin1A mEos2 の分子を可視化するのにやや斜めの照明を使用している私たち。
結論としては、両方を遺伝子組換えショウジョウバエはえ在庫の蛋白質を表現するが付いた蛍光タンパク質ベース PDMS の変更の可能性を搭載した全反射蛍光顕微鏡と同様、遺伝子組換えの幼虫を解剖する、照明の角度は、このプロトコルで説明されているように単一蛋白質を可視化するために必要な最も重要なツールです。

神経細胞のコミュニケーションは、伝達物質の放出、細胞膜1神経伝達物質を含むシナプス小胞の規制の融合による発生するに依存します。エキソサイトーシス2,3,4,5,6と呼ばれるこのプロセスは、非常にダイナミックな刺激7のレートの変動に従ってアップまたはダウンの調整をすることができます。これらのプロセスに関わるたんぱく質ブラウン運動、及びしたがってバインドこれらの生理機能を支える行動の範囲を維持できるナノ組織が表示されます。膜蛋白質は非常にダイナミックな細胞膜7,8,9,10、11、ナノクラ スターに分子の外側トラップを許可します。 12。など、アクション8の彼らのモードを明らかにすることができますこれらの蛋白質の移動性を調査します。可溶性 N-エチルマレイミド敏感な要因添付ファイル蛋白質の受容器 (スネア)、たとえば変異シンタキシン 1 a などのシナプス蛋白質が分子として役立つかもしれないナノクラ スター内のトラップを横し同様、横の高速移動を展示に現在知られています。デポと小胞融合9,13,14,15のためのサイト。
蛍光蛍光タンパク質、単量体 (m) Eos16,17楓18, などの最近の開発を許可しているアプローチを使用して神経細胞膜タンパク質のナノ分解能など光重合のローカリゼーション顕微鏡 (パーム) と確率論的光再建顕微鏡 (嵐)14,15,19。これらの開発は、モビリティと培養細胞とニューロンの生物の蛋白質の nanoclustering 調査を有効にしています。最近では、研究を行ったこのようなハツカネズミ、線虫とダイナミクスとそのまま生物の神経細胞にこれらの膜タンパク質の組織 (と同様の高解像度) で明らかにするショウジョウバエ14,20,21,22。
しかこのような障害を克服するために能力も (やし、嵐、および蛍光 fluorophores) など最近開発された超解像イメージング ツールの使用だけでなく、蛋白質の生体内組織の動態・必要です。タンパク質とイメージングのレーザーの浸透深さのアクセシビリティとしてそのまま動物細胞内タンパク質のイメージングは、そのままマウスの海馬など、そのままの動物の生体組織内に深く埋め込まれた構造のタンパク質が、画像として本質的に困難です。それ故に、蛋白質または組織の表面近くにはイメージより簡単に。生体内イメージングと別の難しさは、動物間での再現性を確保するためにです。もう 1 つのサンプルから解剖学が異なることがありますとそのまま動物の異なるサンプルで複製の容易さと構造を選択するも挑戦を証明します。シナプスのようにステレオタイプの構造の使用、これらの問題のいくつかを克服するを助けます。
一方、他の調査は、たとえば組織・臓器の表面にタンパク質の組織をイメージして、最近の研究は動物線虫22など光学的に透明な表皮で蛋白質の移動性をイメージしてライブ マウス21の頭蓋骨を介して大脳皮質ニューロンにおけるアクチン画像。不動; 動物を維持するいくつかのケースで麻酔薬を使用されています。ただし、特定の麻酔薬が興味の蛋白質に悪影響を与える可能性があります。生体内でイメージ投射の間不動の動物を維持する代替手段は、エラーを最小限に抑えるため検討必要があります。
超解像イメージング体内に別の注意点は興味の蛋白質を照らすに使用されるレーザーが周囲の組織に悪影響を与える可能性したがって励起強度を可能な限り低く保つことをお勧めします。レーザーで周囲の組織の照明はまた背景信号を増加させる傾向があります。低励起強度の使用背景を減らすことができます、それをされていることに注意が蛍光タンパク質光子収率の減少につながる可能性も。イメージ分析の前にバック グラウンド信号を削減する代わりの手段として、分析中に背景差分をされる可能性があります。
ショウジョウバエは、生体内イメージング機能の特定の蛋白質の調査を提供する確立された遺伝的ツールとしての理想的な生物を提示します。上流活性化シーケンス (UAS)-Gal4 システムでタンパク質発現の時空と神経伝達23を操作するため、ことができますようなショウジョウバエ過渡熱遺伝的刺激受容体の潜在的な家族 A1 (dTRPA1)24または遠赤色シフト CsChrimson25を使用して光遺伝的刺激は14のイメージングと併用できます。我々 はこのシステムで生体内単一分子イメージングを実行する複雑さの多くを克服しているし、今ショウジョウバエ第 3 齢幼虫単一粒子追跡することができます実行する方法を説明します。

<table><tbody><tr><td>PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed Culture Dish</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D29-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Optical Stereo-microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Curved Tweezers (Style 5/45)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0208-5AC-PO</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins (0.1mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma, Life Sciences</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>PS.1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black acquisition software</td><td>Carl Zeiss, 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph software</td><td>Molecular Devices</td><td>7.7.8</td><td>PALM Tracer Plugin</td></tr><tr><td>Fly strain</td><td></td><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;; HA-Sx1A-mEos2</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal

超解像顕微鏡技術の増加する数は、ナノスケールの携帯電話の世界を支配するメカニズムを明らかに貢献しています。単一分子イメージングは、生きている細胞の個々 の分子の可視化への例外的なアクセスを提供するので、勢いを増しています。ここでは、我々 はショウジョウバエ幼虫における単一粒子追跡写真活性局在顕微鏡 (sptPALM) を実行する開発手法について述べる。シナプスを通じてコミュニケーションはシナプス前の主要なタンパク質ドッキング、プライミング、および神経伝達物質含有の融合を推進して、活動するに依存している細胞膜と小胞。タンパク質間およびタンパク質-脂質相互作用の範囲は、しっかりとこれらのプロセスを調節してシナプス蛋白質は、したがって各キー イベントに関連付けられている移動性の変化を展示します。どのこれらの蛋白質の移動性がそのまま生きている動物の生理機能と関連の調査は、その正確な作用機序を理解することに不可欠です。高解像度生体内で蛋白質の移動性を抽出には、光透過性、アクセシビリティ、および浸透深さなどの制限事項を克服する必要があります。蛍光蛍光タンパク質変異シンタキシン 1 a を若干斜光を介して可視化およびモーター神経ターミナルまたは第三の運動ニューロン軸索に沿って追跡できるシナプス前のタンパク質にタグがショウジョウバエに齢期について述べる幼虫。

上記、変異シンタキシン 1 a mEos2 トランスジェニックキイロショウジョウバエされたプロトコルを使用すると、(図 1) が生成されます。遺伝子組換え第三令ショウジョウバエ幼虫は PDMS 円筒ベース (図 2 a-f) の解剖されました。変異シンタキシン 1 a の単一の分子を可視化、やや斜めレーザー照明14全反射顕微鏡にパームを使用しました。
変異シンタキシン 1 a の分子は、2 番目の腹節の筋 6 シナプスの運動神経終末に追跡されました。タイプ 1 b 研究 488 nm レーザー (図 3 a) を使用して興奮しているときに変異シンタキシン 1 a mEos2 の低解像度の画像で示すように、mEos2 の緑色の蛍光を検出できます。イメージングの実験、405 nm と 561 nm 励起レーザー イメージング深さ 133.5 であった nm と比 165.6 nm、それぞれ。緑のイメージは、16 の個々 のフレームの平均として買収されました。この緑のイメージは、単独でのシナプスの運動神経終末に photoconverted 映画のローカライズの極限解析に使用される対象地域を作成に使用されました。
取得 photoconverted sptPALM 映画の分析が超解像の強度、拡散係数を生成され、軌道マップ (図 3 a)。変異シンタキシン 1 a mEos2 モビリティのさらに個々 の軌道 (図 3 b) の平均二乗変位 (MSD) の解析による定量化を行った。統計上の比較を行うことができます (図 3 b) MSD 曲線下の領域を使用します。モビリティのさらなる分析シンタキシンがはたす-1 a-mEos2 の拡散係数の分布が得られます、これは統計的に不動の集団 (図 3) に携帯の比較によって評価できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> 図 1: MEos2 タグ構造を生成します。PFL44S-attB-MCS-病原と XbaI w + ベクトルが線形化されます。重複するポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の断片 (ポイ) の蛋白質を符号化と mEos2、それぞれ、クローンを作成できます、たとえば、 ura3 -酵母細胞の生体内での再結合、ギブソン アセンブリ。我々 の内因性変異シンタキシン 1 a プロモーターとターミネーター シーケンスが並ぶ構成クローン変異シンタキシン 1 a mEos2 遺伝子を生成するために注意してください。結果としての構築はその後 (ポイ) の mEos2 に融合蛋白を発現するトランスジェニック フライラインを作成するショウジョウバエの胚に注入することができます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> 図 2:ショウジョウバエ幼虫の郭清と斜光。ショウジョウバエ幼虫郭清の半円筒の PDMS ベースの実施を示す (A) スキーマ。フィレットの幼虫に開催されました、PDMS ゲル minutien ピンの使用によって。(B ・ C)幼虫 PDMS 準備は、シュナイダーの昆虫媒体を含んでいるガラス底培養皿の中に置かれました。やや斜めの照明構成で全反射顕微鏡は、運動神経終末における変異シンタキシン 1 a mEos2 を視覚化に使用されました。(D F)切り裂かれたショウジョウバエ幼虫の半円筒 PDMS ベース。シュナイダーの中でいっぱい画像皿に置かれた幼虫 PDMS 準備と幼虫を超解像パーム顕微鏡をイメージしました。スケール バー、10 mm。 (この図は、14から変更されている)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> 図 3:生体内でシンタキシンがはたす-1 a-mEos2 シナプス前のモーター神経ターミナルでの追跡をします。(A) A 低解像度全反射のイメージ変異シンタキシン 1 a mEos2 タイプ 1 b モーター神経ターミナルに。光電映画の分析はマップ生成 33 Hz sptPALM 超解像強度、拡散係数および軌道でイメージ。5,309 個々 の軌道がイメージ以上 16,000 フレーム取得。スケール バー、3 μ m。(B ・ C)6 別のモーター神経ターミナルからプロットした変異シンタキシン 1 a mEos2 の平均二乗変位 (MSD)(AUC) MSD 曲線下面積は、モビリティのレベルを定量化に使用されました。拡散係数の分布を明らかにする; 他の比として定量化することができます携帯電話や不動の変異シンタキシン 1 a 集団モーター神経ターミナルあたり 〜 2,400 軌道の平均値が得られた (n = 3 の幼虫)。平均の平均の標準誤差として表示されるデータ。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

ここで我々 は説明の幼虫が 3 令単一分子光重合ローカリゼーション顕微鏡することができますライブキイロショウジョウバエのモーター神経ターミナルに実施されるどのように。

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

in-vivo-single-molecule-tracking-at-drosophila-presynaptic-motor

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

8.4K ビュー.  The University of Queensland. ここで我々 は説明の幼虫が 3 令単一分子光重合ローカリゼーション顕微鏡することができますライブキイロショウジョウバエのモーター神経ターミナルに実施されるどのように。

ビデオ: In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

神経科学

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

発生生物学

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

生物学

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

研究のための単純な神経細胞学的損傷法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;運動ニューロン変性

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

ショウジョウバエの神経筋接合部および筋細胞における微小管ネットワークの表示

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

著者スポットライト:ショウジョウバエの神経筋接合部における微小管ネットワークの理解 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

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