Name: visualization of pseudomonas aeruginosa within the sputum of cystic fibrosis patients
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
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著者らは、この研究に資金を提供してくれた嚢胞性線維症財団と、抗Psl0096抗体を惜しみなく寄付してくれたMedImmuneに感謝の意を表したいと思います。この研究では、トロント大学のCAMiLoDイメージング施設でイメージングを実施しました。

研究倫理委員会(REB)の承認は、被験者から喀痰サンプルを収集して保管するために必要です。本論文で紹介する研究は、Hospital for Sick Children REB#1000058579によって承認されました。
1.痰の収集
<ol><li>喀痰を滅菌コレクションカップに保管し、固定前に4°Cで最大24時間直ちに保管します。. 注:固定せずに4°Cで喀痰を長時間放置すると、細胞の分解、特に白血球の分解につながる可能性があります。できるだけ早く固定することが望ましいです。</li>
	<li>喀痰サンプルを滅菌15mLチューブに移します。</li>
	<li>等量の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を喀痰サンプルに加えます。例えば、喀痰サンプルが0.5 mLの場合、0.5 mLの4%PFAを加えます。穏やかな反転で混ぜます。</li>
	<li>喀痰を4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>固定喀痰2 mLそれぞれに5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えてサンプルを洗浄します。 注:この洗浄ステップに必要な遠心分離はありません。</li>
	<li>ピペットで上澄みを慎重に取り除きます。 注意: 先端を痰から遠ざけてピペットで痰を吸い上げないようにし、表面の液体を非常にゆっくりと吸引します。洗浄ステップは遠心分離を伴わないため、喀痰栓の構造的完全性を損なわない。</li>
	<li>手順1.6〜1.7をさらに2回繰り返します。</li>
	<li>0.01%(w/v)のアジ化ナトリウムを含むPBSの2倍の容量でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>喀痰を4°Cで保管します。</li>
</ol>2. 喀痰のMiPACT(ティッシュクリアリング技術)処理
<ol><li>ハイドロゲル成分(30%29:1アクリルアミド:ビスアクリルアミド、硬化剤、PBS)を嫌気性パックを含む密閉容器で72時間脱気します。 注:酸素はアクリルアミドの重合を阻害するため、嫌気性パックと密閉容器が必要です。あるいは、嫌気性フード内でこのステップを実行するか、密閉容器に真空を適用するか、またはアクリルアミド混合物を通してN2 ガスをバブリングすることによって、酸素を除去することができる。<ol><li>密封された嫌気性容器内でキャップを外した状態で、30% 29:1 アクリルアミド:ビスアクリルアミド溶液 2 mL を 15 mL チューブに加えます。</li>
		<li>15 mL チューブ中の PBS 5 mL に 0.5 g の硬化剤を添加して、10% (w/v) 硬化剤の濃縮ストックを作成します。キャップをチューブから外し、密閉された嫌気性容器に保管してください。</li>
		<li>数 mLの滅菌PBSを、キャップを外した状態でチューブに入れ、嫌気性容器内に残します。</li>
	</ol></li>
	<li>最終濃度が0.2%硬化剤、4%の29:1アクリルアミド:ビスアクリルアミドをPBSに溶かしたハイドロゲルの溶液を15 mLのチューブで5 mLの溶液にします。反転して混合し、フィルター滅菌します。</li>
	<li>喀痰サンプルを冷蔵庫から取り出し、メスで無菌状態で小さなセクション(直径約5 mm)に切断します。 注:喀痰が非常に流動的な場合でも、このステップを実行できますが、メスを使用して目的の画分を分離する前に、ピンセットで保存溶液から喀痰を取り除くには、忍耐力と練習が必要です。</li>
	<li>カットした喀痰サンプルを8チャンバーのカバーガラススライドのウェル内に置きます。</li>
	<li>ステップ2.2のフィルター滅菌したヒドロゲル溶液300μLを、喀痰を含む各ウェルに加えます。</li>
	<li>嫌気性パックが入った密閉容器内に8チャンバーのカバーガラスを置き、37°Cで3時間放置します。 注:喀痰が埋め込まれたヒドロゲルを重合すると、固いゲルの粘稠度になるはずです。</li>
	<li>凝固したヒドロゲル喀痰サンプルを、pH 8の8%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)5 mLを含む15 mLの培養チューブに移し、喀痰が透明になるまで、37°C(振とうの有無にかかわらず)で3〜14日間サンプルを透明にします。 注:クリアリング時間は喀痰の組成に依存し、一般的に振とうで短縮できます。ただし、サンプルの完全性を損なうほど振とう速度を上げないように注意してください。DNAに富むサンプルが多いほど、粘液に富むサンプルに比べて透明化に時間がかかります。</li>
	<li>8%SDS溶液を廃棄物収集容器にデカントします。滅菌ピンセットを使用して、ハイドロゲルに包埋した各サンプルを滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移します。50 mLのコニカルチューブのそれぞれに10 mLのPBSを加えてハイドロゲルを洗浄し、溶液を30分から1時間放置してからデカントします。これをさらに2回繰り返します。 注意: この洗浄ステップには遠心分離は含まれていません。余分な水分と上澄み液はピペットで慎重に取り除かれます。</li>
	<li>洗浄したサンプルを、0.01%(w/v)アジ化ナトリウムと1x RNase阻害剤を含むPBSで4°Cで保存します。</li>
</ol>3. ヒドロゲル蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)プロトコル
<ol><li>滅菌ピンセットを使用して保存溶液からハイドロゲルサンプルを取り出し、サンプルを滅菌表面(スライドガラスやペトリ皿など)に置きます。</li>
	<li>滅菌メスを使用して、ハイドロゲルを~1mmの厚さのスライスに切断します。</li>
	<li>ハイドロゲルの1 mm切片を滅菌1.5 mLチューブに入れます。</li>
	<li>1.5 mLのチューブに1 mLのハイブリダイゼーションバッファー(25%ホルムアミド、0.9 M NaCl、20 mM Tris-HCl [pH 7.6]、0.01% SDS、精製および脱イオンH2O)を調製します。</li>
	<li>蛍光標識したPseaerAプローブ(150.7 nM12)をハイブリダイゼーションバッファーに添加し、逆位で混合します。 注意: ホルマリン溶液は直火から遠ざける必要があります。ハイブリダイゼーション緩衝液は、事前に調製し、-20°Cでアリコートで保存することができる13。</li>
	<li>200〜500μLのハイブリダイゼーションバッファーをハイドロゲルの各~1 mm切片に添加し、ハイドロゲルサンプル全体が浸漬されていることを確認します。</li>
	<li>PseaerAプローブをヒドロゲルサンプルとハイドロゲルサンプルを暗所に置き、46°Cで振とうせずに18~24時間ハイブリダイズさせます。</li>
	<li>ハイブリダイゼーション緩衝液を廃液回収容器にデカントする。</li>
	<li>フィルター滅菌洗浄バッファー(337.5 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)[pH 7.2]、0.01% SDS、精製および脱イオン化H2O)でサンプルを1回すすぎ、1.5 mLチューブのそれぞれに1 mLの洗浄バッファーを添加し、除去します。 注:洗浄バッファーは事前に作成し、室温(RT)で保存できます。</li>
	<li>新鮮な洗浄バッファー 1 mL をチューブに加え、暗所で 48 °C で 6 時間、振とうせずにサンプルをインキュベートします。</li>
</ol>4. ヒドロゲルとPsl0096抗体の結合
<ol><li>洗浄バッファーを 1 mL ピペッターで滅菌除去します。</li>
	<li>PBS 溶液中の 2% BSA(w/v)溶液に 1 mL の 2% BSA 溶液を加えて除去し、サンプルをすすぎます。</li>
	<li>500 μL の 2% BSA/PBS 溶液をハイドロゲルサンプルに添加して、非特異的タンパク質結合をブロックします。その後、サンプルを暗所の室温で一晩、振とうせずにインキュベートします。</li>
	<li>ブロッキング溶液を1 mLピペットで滅菌除去します。</li>
	<li>Psl0096-Texas Red抗体溶液を、500 μLの新鮮な2% BSA/PBS中で最終濃度0.112 μg/mLに希釈して調製します。</li>
	<li>500 μLの抗体溶液をハイドロゲルサンプルに加え、振とうをせずに、光から保護した状態で室温で6時間インキュベートします。</li>
</ol>5. DAPI(4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール)染色
<ol><li>磁性攪拌子を入れたフラスコに、40 gの非イオン性密度勾配培地、30 μLのTween20、3 μgのアジ化ナトリウム、および30 mLのPBSを加えて、屈折率マッチング溶液(RIMS)を調製します。溶液をマグネチックスターラーで15分間、または完全に溶解するまで攪拌します。</li>
	<li>10 mLのシリンジと滅菌済みの0.2 μmフィルターを使用して、溶液を50 mLのコニカルチューブにフィルター滅菌します。 注:溶液は4°Cで数ヶ月間保存できます。</li>
	<li>Psl0096-Texas Red抗体溶液を滅菌済み1 mLピペットで除去します。</li>
	<li>1 mL の PBS を添加してから除去することにより、ハイドロゲルサンプルをすすぎます。</li>
	<li>ハイドロゲルサンプルを 250 μL の RIMS 溶液と 10 μg/mL の DAPI と室温で、暗所で穏やかに振とうしながら一晩インキュベートします。</li>
	<li>共焦点イメージングの前に、サンプルを0.9mmまたは1.7mmの灌流チャンバーにマウントし、ガラスカバーガラスで密封します。 注:FISHおよび/または免疫組織化学の後、RIMSに浸漬する前に、喀痰粘液の可視化が必要な場合は、蛍光レクチン染色を適用できます12。</li>
</ol>6. イメージング
<ol><li>25倍、40倍、63倍、または100倍の倍率で標準的な技術を使用して共焦点レーザー走査型顕微鏡イメージングを実行します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis:+What+drug+and+which+way.">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li><li>Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+acquisition+in+young+patients+with+cystic+fibrosis:+Pathophysiology,+diagnosis,+and+management.">Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+Resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms+to+Antimicrobial+Agents-How+P.+aeruginosa+Can+Escape+Antibiotics.">Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Billings, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+Matrix+Component+Psl+Provides+Fast-Acting+Antibiotic+Defense+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).</li><li>Franklin, M. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>DePas, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposing+the+three-dimensional+biogeography+and+metabolic+states+of+pathogens+in+cystic+fibrosis+sputum+via+hydrogel+embedding,+clearing,+and+rRNA+labeling.">Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling.</a> mBio. 7 (5), 1-11 (2016).</li><li>Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+the+Pseudomonas+aeruginosa+glycoside+hydrolase+PslG+combats+wound+infection+by+improving+antibiotic+efficacy+and+host+innate+immune+activity.">Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).</li></ol>

このプロトコルの目的はCFの患者からの喀痰の P.のaeruginosa のセルのその場の構成に垣間見るようにすることである。喀痰サンプルは、すぐに固定できない場合は、処理されるまで4°Cで保存する必要があります。喀痰中の 緑膿菌 の細胞数は、4°Cで保存した場合、1時間、24時間、または48時間処理しても有意に変化しないことが実証されていますが、25°Cで24時間または48時間放置...

本研究では、小児嚢胞性線維症(CF)患者の喀痰中の緑膿菌のin vivo構造を可視化する実験が設計されました。緑膿菌感染症は、小児CF人口の30〜40%で慢性化します。慢性感染症が確立されると、それらを排除することはほとんど不可能です1.緑膿菌の早期感染患者から分離された緑膿菌株は、一般的に抗菌薬の影響を受けやすいため、慢性感染症の確立を防ぐために抗シュードモナル抗生物質で治療されます2。残念ながら、すべての緑膿菌分離株が抗生物質療法後に肺から効果的に除去されるわけではありません。抗生物質の失敗に関連する正確なメカニズムは完全には解明されていません。これまでの研究では、バイオフィルム細胞の密度、凝集、多糖類産生のばらつきが抗生物質の有効性に影響を与える可能性があることが示されています3。緑膿菌は、Pel、Psl、アルギン酸の3つの細胞外多糖類を産生します4。緑膿菌のほとんどの菌株は、それぞれのエキソ多糖類を発現する遺伝的能力を持っていますが、多くの場合、1種類の多糖類が主に発現しています5。アルギン酸エキソ多糖類は、CF肺の慢性感染症と関連しており、ムコイド表現型6,7をもたらします。多糖類のPelとPslは、初期接着の補助やバイオフィルム構造の維持、抗生物質耐性の付与など、複数の機能を持っています8。
組織のin vivo構造を可視化することを目的とした方法は、さまざまなサンプルタイプに対して開発されています9,10,11。最近では、CF患者の喀痰中のin vivo微生物群集を視覚化するように調整されています12。喀痰内の微生物群集の同定に特化した組織透明化プロトコルの最適化は、DePas et al., 201612によって開発されました。MiPACTという用語は、Passive CLARITY techniqueの後にmicrobial identificationの略で、CF痰11,12の除去のために造られました。組織透明化技術では、標本は最初に固定され、次に透明化され、染色と顕微鏡的視覚化のために固有の構造をそのまま残します11。CF喀痰サンプルを固定・除去することで、バイオフィルム構造、細菌細胞密度、多微生物との関連、病原体と宿主細胞との関連に関する疑問に答えることができます。喀痰内に保存された細菌を直接調べる利点は、宿主特異的な状況で分析・可視化できることです。実験のために実験室で臨床分離株をin vitroで増殖させることは非常に有益ですが、そのような方法ではCF肺環境を完全に再現することができず、その結果、検査結果と患者の転帰の間に乖離が生じます。
ここで紹介する方法は、CF患者や他の呼吸器感染症の患者からの細菌を視覚化するために、喀痰を固定および除去するために使用できます。本明細書に記載の染色および顕微鏡分析の特定のタイプは、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)であり、続いてハイドロゲル内での抗Psl抗体結合、およびその後の共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)による分析である。組織透明化に続いて、他の免疫組織化学および顕微鏡検査法も適用できます。

<table><tbody><tr><td>29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Coverwell perfusion chambers</td><td>Electron Microscopry Sciences</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.</td></tr><tr><td>VA-044 Hardener</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of pseudomonas aeruginosa within the sputum of cystic fibrosis patients

嚢胞性線維症患者の肺内の緑膿菌の早期発見と根絶は、慢性感染症を発症する可能性を減らすことができます。慢性緑膿菌感染症の発症は、肺機能の低下と罹患率の増加に関連しています。したがって、小児患者の約10〜40%で発生する抗生物質療法で緑膿菌を根絶できない理由を解明することに大きな関心があります。緑膿菌の宿主クリアランスと抗生物質感受性に影響を与える多くの要因の1つは、空間構成(凝集やバイオフィルム形成など)と多糖類産生の変動です。そこで、CF患者の喀痰中の緑膿菌のin situ特性を可視化することに興味を持ちました。喀痰サンプルをハイドロゲルマトリックスに包埋した後、組織透明化技術を適用し、宿主細胞に対する3D構造を保持しました。組織透明化後、蛍光標識および色素を添加し、可視化を可能にした。細菌細胞の可視化のために蛍光in situハイブリダイゼーションを行い、エキソ多糖類の可視化のために蛍光標識抗Psl抗体を結合させ、DAPI染色を行って宿主細胞を染色し、構造的洞察を得ました。これらの方法により、共焦点レーザー走査型顕微鏡によるCF患者の喀痰中の緑膿菌の高解像度イメージングが可能になりました。

実験の全体的な計画を図 1 と 図2にまとめます。 図1 は、喀痰処理と喀痰除去プロトコルの概要を示しています。喀痰の処理と除去には最大17日かかる場合があります。ただし、プロトコルは停止する可能性があり、サンプルはPFAによる固定後(2日目)または組織除去後(クリア時間に応じて5〜17日目)に保存できます。 <strong clas...

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Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

このプロトコルは嚢胞性線維症の患者の喀痰内の細菌のセルそして多糖類の統合の遺伝子座(Psl)の多糖類の視覚化のための方法を提供する。

嚢胞性線維症患者の喀痰中の 緑膿菌 の可視化

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

3.0K ビュー.  Hospital for Sick Children. このプロトコルは嚢胞性線維症の患者の喀痰内の細菌のセルそして多糖類の統合の遺伝子座(Psl)の多糖類の視覚化のための方法を提供する。

ビデオ: Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

免疫・感染学

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

嚢胞性線維症肺における 緑膿菌 および 黄色ブドウ球 菌バイオフィルムのEx生体モデルにおける抗生物質有効性試験

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

緑膿菌感染モデルのリアルタイム評価ツール

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

<meta charset="utf8"></head><body>抗菌試験および微生物動態解析のための適応型CFモデル

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

嚢胞性線維症患者の喀痰中の緑膿菌の可視化

要約

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に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用

長期的な慢性

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

P. アフルギノーサ抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

嚢胞性線維症肺における緑膿菌および黄色ブドウ球菌バイオフィルムのEx生体モデルにおける抗生物質有効性試験

緑膿菌感染モデルのリアルタイム評価ツール

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

嚢胞性線維症患者の喀痰中の 緑膿菌 の可視化

要約

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に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用

長期的な慢性

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

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P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

嚢胞性線維症肺における 緑膿菌 および 黄色ブドウ球 菌バイオフィルムのEx生体モデルにおける抗生物質有効性試験

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嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

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嚢胞性線維症肺における緑膿菌および黄色ブドウ球菌バイオフィルムのEx生体モデルにおける抗生物質有効性試験