この研究は、国立衛生研究所助成金GM118085とロバート・ウェルチ財団(R.M.H.にF-1811を付与)によって部分的に支援されました。

1. 運動不足株におけるサプレッサー変異体の分離
注: この方法を広範な「キャッチオール」として使用して、運動性欠陥の一般的な性質を特定してください。
<ol><li>ソフト寒天プレートの準備 注:軟寒天は、運動性または水泳寒天とも呼ばれ、低パーセンテージ寒天(〜0.2-0.35%w/v)であり、長い間気胸31,32をアッセイするために使用される。<ol>
<li>2 Lラウンドボトムフラスコにバクト寒天(0.3%w/v)とLB20gを加えます。フラスコに1LのddH2O(二重蒸留水)を加え、攪拌棒と磁気攪拌板を使用して懸濁液を均等に混合します。</li>
		<li>121 °Cで20分間オートクレーブ。</li>
		<li>上記のようにロッド/プレートを使用して穏やかな攪拌で冷却することができます。温度が約50°Cに達したら、滅菌ペトリ皿(100mm x 15mm)に25mLを注ぎ、溶融寒天を16時間以内に蓋を少なくとも1時間所定の位置にセットします。</li>
	</ol></li>
	<li>培養製剤、接種、およびサプレッサー変異体の単離 注:柔らかい寒天で固まった栄養豊富な培地の中心に接種された 大腸菌 は、栄養素を局所的に消費し、彼らが従う栄養勾配を作り出します。彼らが外側に移動すると、定義された「リング」が現れ(図1A)、これは細菌が反応する特定の化学誘引物質に関連している。このアッセイでは、気化システムまたは構造成分の欠陥が性能を損なう可能性があります。多くの場合、運動性優位を有する変異体はスクリーニング中に生じ、環の周囲に沿った単一または複数の点から出現し、そこから「フレア」アウト(図1C)を見ることができる。一つは、水泳の前線の最も外側の端は、植民地化されていない処女柔らかい寒天と対比容易に気づくでしょう。<ol>
<li>レノックスブロスの5 mLで所望の運動欠乏株の一晩培養を成長させます (LB; 10 g/L トリプトン, 5 g/L酵母エキス, 5 g/L NaCl, 材料表) 水平振幅を有する 30 °Cで (220 r.p..m.).翌日、亜培養(1:100希釈)を新鮮なLBで、同じ条件下で指数相(OD600 0.6)に成長する。</li>
		<li>培養液の6μLをピペットを用いて柔らかい寒天プレート(1.1)の中央に接種し、ロードされた無菌チップを寒天に押し込んで内容物を静かに排出します。30°Cに移し、インキュベート(図1B)、運動性'フレア'が明らかになるまで、運動環の接種点または周辺から発せられる、典型的には24〜36時間(図1C)。 注:運動性アッセイでは、変異体分離物と一緒に野生型株を接種して比較します。この野生型株は特徴的な同心円式化学式の環(図1A)を示し、8-10時間内にプレートを充填します。</li>
		<li>滅菌ワイヤーループを使用して「フレア」領域から細胞を持ち上げ、ストリークして単一コロニーをLB硬寒天プレート(上記のように調製したLB、15 g/Lバクト寒天で固化)に精製します。</li>
		<li>滅菌ワイヤーループを使用してストリークプレートから単一のコロニーを選び、「純粋な」コロニー分離を確実にするために単一のコロニーのためにストリークすることによって再精製します。</li>
	</ol></li>
	<li>サプレッサー変異体の確認と特性評価
	<ol>
<li>分離されたサプレッサー変異体が運動性を回復したことを確認する。軟寒天プレート(1.1)、および野生型と比較のための開始「運動不足」株を含む、関心のある株(1.2.1のように)のための培養を準備します。</li>
		<li>プレート(1.2.2のように)を接種し、30°Cで8〜10時間インキュベートします。</li>
		<li>最も外側のリング(円の縁)の直径を記録し、どの分離株が運動性を実質的に回復させているかを確立するために比較する。 メモ:実験の時間を通してプレートを撮影することをお勧めします。最良の結果を得るためには、デジタルカメラを光源の上に取り付けて、泳ぐコロニーの直径を測定し、非植民地化された寒天と区別する「光のバケツ」装置30を使用する。</li>
		<li>被験者は必要に応じてWGSに隔離し、野生型の機能を回復した突然変異を肯定的に同定するのに十分な「シーケンスカバレッジ」を可能にする。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 細胞テザリングによるフラゲラ運動の挙動を定量化する
注: 通常のランタンブル動作(chemotaxis)が危険にさらされていると思われる場合は、この方法を使用します。
<ol><li>
培養準備とフラゲラせん断
	<ol>
<li>ステップ 1.2.1 で説明したように、対象株の指数位相培養を準備します。</li>
		<li>ペレット 10 mL の細胞は、フィルター滅菌された運動バッファー (MB; 10 mM リン酸カリウムバッファー [0.0935 M K2HPO4,0.0065 M KH2PO4,pH 7.0] , 0.1 mM EDTA [pH 7.0] , 10 mM NaCl, 75 mM KCl. 注:MBは 運動性を サポートしていますが、細菌の増殖をサポートしていません</li>
		<li>ステップ 2.1.2 を 2 回繰り返してから、最終ペレットを 1 mL の MB で再懸濁します。</li>
		<li>細胞懸濁液を1mLのシリンジに移し、23G針を最後に取り付けます。同一の注射器/針装置を組み立て、各針先にしっかりと覆ったポリエチレンチューブ(0.58mmの内径)の6インチを介して2つを一緒に取り付けます。</li>
		<li>1つのシリンジから他の50倍に細胞懸濁液をゆっくりと前後に渡し、10パスごとに1分の休止を行うことによって、フラゲラ(壊れやすく、簡単に壊れる)を剪断します。</li>
		<li>2,000 x g で 3 分間の皮を遠心し、500 μL の最終体積で再中断します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スライド調製および細胞テザリング
	<ol>
<li>18 mm x 18 mm のカバースリップを 3 インチ x 1 インチ x 1 mm ガラス顕微鏡スライド上に積み重ねて、両面テープで区切ってセル固定チャンバーを準備します (図 S1)。</li>
		<li>チャンバーの上部に塗布することで、0.01%(w/v)ポリリジン溶液でチャンバを洗い流します。下端(顕微鏡スライドでカバースリップをフラッシュ)をタスクワイパー(ティッシュペーパー)に傾け、チャンバー(図S1)を通して溶液を引き出すのに役立ちます。その後、室温で10分間インキュベートします。</li>
		<li>ステップ2.2.2で説明したように使用して、40 μLのMBでチャンバーを3回洗浄します。</li>
		<li>チャンバーの上部に40μLの皮分セル懸濁液(上記を用意)を加え、室温で10分間インキュベートし、細胞をカバースリップに取り付けることができます。</li>
		<li>2.2.3のように40 μLのMBでチャンバーを静かに洗い流し、未接続の細胞を取り除きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞回転記録と定量
	<ol>
<li>つながれた細胞を積んだ顕微鏡のスライドを顕微鏡の段階に移す。</li>
		<li>位相対面顕微鏡と100xの目的を用いて、所定の位置に固定された細胞の母集団をスキャンし、単一軸上で回転する、すなわち、細胞が焦点の出入りする角度で提示するのではなく、固定点で滑らかな回転を行う(ビデオ1)。</li>
		<li>市販の顕微鏡と関連するカメラを使用してください。関連するソフトウェアを開き、対象のセルがフォーカスされていることを確認し、 ビデオ取得 をクリックしてセルの回転を1分間記録します(10フレーム/秒以上)。</li>
		<li>ビデオ再生から、1 分あたりの完全な回転数と、セルの方向 (スイッチング周波数) の変化回数を数値化します。 注:回転速度とスイッチング周波数は目で測定するには速すぎる可能性があるため、低速/細かい再生を提供するビデオソフトウェアを使用するか、自動ソフトウェアシステムを採用して回転パターン33を定量化することをお勧めします。代替手段としては、メチルセルロース(または同様の薬剤)を使用してMBの粘度を上げ、より速い細菌の回転を遅くして解決したり、フレームレートの低いカメラが使用中の場合に補償したりすることです。</li>
		<li>生物学的複製でステップ2.3.2を繰り返し、対象の集団の表現をまとめます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 国境を越えるアッセイにおける群れの準備
注: この方法は、グループ運動性に対する突然変異または条件の影響を評価するために使用します。群寒天とは、一般的に、割合が柔寒天よりも高い寒天を指します。柔らかい寒天(0.3%)では、細胞は寒天の中で個別に泳ぎます。群寒天(0.5%以上)では、細胞は表面上のグループとして移動します。群れプレートはここで詳細に使用する必要がありますが、スイムプレートは貯蔵寿命が長く、数日間使用することができます。私たちの個人的な好みは、1-2日で使用することにあります。
<ol><li>
群寒天の準備
	<ol>
<li>2 Lラウンドボトムフラスコにエイケン寒天5g(0.5%w/v)とLB20gを加えます。フラスコに1LのddH2Oを加え、攪拌棒と磁気攪拌板を使用して懸濁液を均等に混合します。</li>
		<li>121 °Cで20分間オートクレーブ。</li>
		<li>上記のようにロッド/プレートを使用して気泡を避けるために穏やかな攪拌で冷却することができます。約50°Cの場合、フィルター滅菌されたグルコースを加え、最終濃度の0.5%を得ます。</li>
		<li>滅菌ペトリ皿(100ミリメートルx 15ミリメートル)に25 mLを注ぎ、少なくとも14時間と20時間以下の室温で設定することができます。今後の使用のために保管しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
群板の接種とインキュベーション
	<ol>
<li>寒天の上にスポッティングして、中指数培養物(1.2のように調製)の6μLを接種します。</li>
		<li>蓋を5~10分間は切り、接種物が寒天表面に乾燥したら交換してください。</li>
		<li>30°Cで8時間インキュベートする。これは寒天の乾燥に寄与し、群れを損なうため、蓋を取り除くことによって群れの進行状況を検査する誘惑を避けてください。 注:インキュベーション時間は、歪み表現型によって異なる場合があります。いくつかの孤立した突然変異は、群れの能力を妨げる可能性があり、寒天の減少率またはインキュベーションのより長い期間を必要とします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
国境通過アッセイプレートの準備 注:このアッセイは、プラスチック製の分割(境界)が1つではなく2つのチャンバーを作成する修正されたペトリ皿を利用しています(図2A)。各チャンバーは、2つを「接続」する前に、群れのための異なる条件を提供し、他の独立して準備することができます。実験計画に応じて、第1室(左指定)は、スイム寒天(0.3%w/v)または群寒天(0.5%w/v)のいずれかで調製することができ、そこから細菌は境界を越えて群れの寒天を含む右の部屋に移動することができます+/-必要なサプリメントまたは挑戦(例えば、抗生物質)。いずれの寒天の移動も、通常、接種の元の点から細菌コロニー形成(エッジからエッジ)の最も広い直径を記録することによって測定/比較される。<ol>
<li>必要に応じて、1.1 に記載されているように、スイム寒天を準備します。</li>
		<li>3.1 で説明したように、群れの寒天を準備します。</li>
		<li>〜30 mLの群れ寒天(必要に応じて必要な補充)を、二重コンパートメントペトリ皿(100mm x 15 mm)の右室に注ぎ、チャンバー間のプラスチック仕切りでレベルが高いが、左側にあふれていないところまで(図2B)。</li>
		<li>寒天が固まった後、左室を泳ぐか、または群れの寒天の30mLで満たし、再びプラスチックの分裂と接触するところまで(図2C)。設定する前に、滅菌ピペットチップを使用して、境界線上で寒天をそっとドラッグして、両側を、分割の全長にまたがる約1mmの高さの寒天橋と接続します(図2D)。</li>
		<li>プレートを室温(3.1)で乾燥させます。 注:ブリッジを作成する別の方法は、左チャンバー寒天を乾燥させ、2つのチャンバー(3.4)を橋渡しするためにプラスチック製の仕切りに沿って溶融群寒天のピペット〜100 μLをゆっくりと可能にすることです(3.4)。泳ぐ(1.2.2)または群れ(3.2)寒天のために上記の詳述通り、12-16時間、または群れが右のチャンバー上で十分に進行するまで、左のチャンバーのプレートを接種して、関心のある株の比較を可能にします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

サプレッサー突然変異の分離と特徴付けは、気化システム35、36、37、ならびにモータ機器自体38、39、40の主要成分の同定に成功した。プロトコル1を使用している間、運動性の喪失を補うことができる突然変異の大きなスペクトルの分離を確実にするた?...

細菌は、その生態学的ニッチに移動と分散のための多くの付属物を採用しています1.これらの中で最も速いのが、環境信号に応答して好ましいロケールの植民地化を促進し、いくつかの種2,3の病原性能力に大きく寄与する。バネラ菌は、バルク液体で個別に泳ぐか、半固体表面4の上に集団として群がることができます。細胞外のフラグラは膜に埋め込まれた回転モーターによって取り付けられて駆動され、イオン勾配の力を利用して回転1、2、4、5、6、7、8を引き起こすトルクを発生させる。モーターが一定のトルク9で動く大腸菌では、モーター出力は回転速度と回転子の反時計回り(CCW)方向と時計回り(CW)方向の切り替えの観点から分類することができる。CCW回転は、セルを前方に推進するコヒーレント・フラネラ・バンドルの形成を促進し(CW)、一時的な回転方向スイッチ(CW)を行うと、バンドルは部分的または完全に10個を分解し、細胞は泳方向(タンブル)を再び向きにします。大腸菌は通常1秒間走り、10分の1秒は転倒する。ロータまたは「タンブルバイアス」のスイッチング周波数は、化学運動体信号システムによって制御され、膜貫通化学受容体は外部の化学信号を検出し、リンベレーを介してフラゲラモーターに伝達し、誘引物質に応答してランを延長するか、または有毒化学物質11、12に応答してそれらを抑制する。水泳運動は0.3%柔らかい寒天でアッセイされます。
群れの間、細菌は半固体表面を密な集団として移動し、連続渦巻き運動2、13、14、15の中で細菌のパックが流れる。大腸菌群は、変化した化学感覚生理学(低タンブルバイアス)、より高速、およびバルク液体16、17で泳ぐ細胞に対する抗菌性に対する耐性の高さを示す。スウォーマーは、界面活性剤の生産、ハイパーフラフェレーション、細胞伸長2を含む、運動を助ける多くの戦略の展開において異なる。群れは、細菌に生態学的および臨床的な設定18、19、20の両方で競争上の優位性を提供しています。群れの細菌には、0.5-0.8%寒天で固められた媒体でのみ群がることができる温帯スウォーマーと、より高い寒天濃度21を横切ってナビゲートできる堅牢なスウォーマーの2つのカテゴリーがあります。
水泳の運動性とその規制を尋問するために様々なアッセイが存在します。突然変異や環境条件によって障害を受けた場合、運動性自体は、機能の得るサプレッサー突然変異を同定するための強力な選択を提供する。これらのサプレッサーは、元の突然変異の本物の復帰剤、または第2の突然変異が機能を回復する疑似戻し物である可能性があります。このような変異体は全ゲノムシーケンシング(WGS)によって同定することができる。非バイアスサプレッサー選択の代替は、偏った標的突然変異誘発戦略(例えば、PCR変異生成)である。これらの方法論は、多くの場合、運動装置の機能または環境調節に光を当てる。モータ機能を研究することが目標である場合、軟寒天で測定された野生型運動性の回復は、必ずしも野生型モーター出力の回復を示すものではない。細胞テザリングアッセイは、細胞が単一の旗臼によってガラス表面に結合され、その後、細胞体の回転が監視される、運動行動を評価するための最初のアッセイであり得る。モーターの特性を監視するためにより高度な方法論が利用可能になりましたが、モーション分析のためのソフトウェアパッケージの必要な高速カメラのセットアップと適用は、その広範な使用を制限します22,23,24,25.細胞テザリングアッセイは、フラゲラをせき止めることだけを必要とし、短いフィラメントをガラススライドに取り付けることができ、続いて細胞体の回転をビデオ撮影する。このアッセイでは、細胞体がフラゲラムにかかる負荷が高いため、記録されたモータ速度は低いが、このアッセイは、化学戦術応答26、27、28、29に関する貴重な洞察に寄与しており、以下で説明するように有効な調査ツールのままである。
群れの運動性は、研究者にとって異なる課題をもたらします。機能向上抑制剤の選択は、豊富な界面活性剤を生成し、容易に13を群がって生じるスウォーマーでのみ機能する。大腸菌のような界面活性剤非生産者は、寒天、培地組成及び環境2、13、14、21の湿度の選択に対して潔癖性である。群れの状態が確立されると、国境を越えるアッセイ17は、群れが新しい/過酷な条件をナビゲートする能力を尋問するのに有用な方法論です。以下に示すプロトコルは大腸菌に関連していますが、他の種での適用に容易に適応することができます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

運動性は、多くの細菌種の生存と成功に不可欠です。運動性を利用して信号経路を理解し、フラネラ部の機能と組み立てを解明し、運動パターンを調べ、理解するために多くの方法論が存在する。ここでは、これらの方法の3つの組み合わせを示します。柔らかい寒天の運動性は最も古く、運動性障害のある株の機能利得抑制性突然変異を分離するための強力な選択を提供し、運動性は第2の突然変異によって回復する。細胞テザリング技術は、最初に、フラグラーモータの回転性を実証するために使用され、モータ速度および回転方向を切り替える能力に対するシグナルエフェクタの影響を評価するために使用することができる。「国境を越える」アッセイは、水泳細菌が群れとして集団的に移動する準備ができる、より最近のものです。これらのプロトコルは、運動機械の構成要素を特定し、水泳や群れの異なる側面におけるその役割を特徴付けるための体系的かつ強力なアプローチを表しています。それらは他の細菌種の運動性を研究するために容易に合わせることができる。

高レベルのシグナル伝達分子c-di-GMPによって運動性が損なわれる大腸菌株における擬似復帰物質の単離は、我々の研究室34からの最近の研究で詳述された。この株(JP1442)は、ΔyhjHとΔycgRの2つの突然変異を抱えた。YhjHは、大腸菌のc-di-GMPを分解する最も活性なホスホジエステラーゼである。YhjHの不在は、上昇したc-di-GMPレベルと運動性の阻害につなが...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K ビュー.  The University of Texas at Austin. 多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

生物学

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

生化学

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション<em&gt; PilG</em&gt;で<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

免疫・感染学

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

生物工学

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査

要約

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単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

タイムラプス顕微鏡による大腸菌における生物学的ノイズの連続測定

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

要約

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単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査

タイムラプス顕微鏡による大腸菌における生物学的ノイズの連続測定