この方法は、二次細胞と呼ばれるショウジョウバエの男性補助腺からの稀な細胞集団のトランスクリプトミック分析を可能にし、生殖の成功に不可欠な遺伝子を発見する。1日の間に、この技術は、異なる遺伝子型からの二次細胞の選別と、その後のqPCRまたはRNAシーケンシングのための全RNAの抽出を可能にする。時にはプロジェクトは、出発材料の希少性によって制限されます。
この方法は、希少細胞集団を扱うという課題に直面している他のグループの基礎を提供することができます。手順は40腺を蓄積する必要があるため、分節を練習することが重要です。自家製のピペットのヒントを準備することも重要ですので、あなたはそれを作り、事前に準備する方法をビデオで視覚化する必要があります。
手順を開始する前に、切り取り、炎のラウンド、広い、腺を処理するための200マイクロリットルの先端を通過し、開口部を狭めるために1秒未満の炎の近くに複数の1,000マイクロリットルの先端の先端を渡します。次に、吸引の速度に基づいて、変更されたヒントを狭い範囲から幅に並べ替えます。下腺解剖の場合は、氷の上のガラス皿に20〜25人の男性ショウジョウバエを置き、鉗子と解剖顕微鏡を使用して1つの雄のハエの生殖管を取り除きます。
睾場や射精球を含む他のすべての組織からアクセサリー腺のペアをクリアし、室温で血清補充培地を含むガラス板にアクセサリー腺を移します。20組の付属腺が採取されたら、PBSの皿の中で、室温で1~2分間、その腺を洗います。洗浄の最後に、腺を新しく調製した解離液に移し、解剖顕微鏡の下で鋭い鉗子を使用して腺状の葉の真ん中をしっかりとつまみます。
鉗子の第2のペアを使用して、2次細胞を含む腺の部分から補助腺と射精管の近位領域を分離するために鋭い先端で組織を切断する。ペプチダーゼが外側の筋肉層によって保護されている細胞に到達できるように腺を切断し、腺の内腔内の粘性精液によって保護されます。次に、プレウェット、火の丸められた、広い200マイクロリットルピペットチップを使用して、腺を1.5ミリリットルチューブに移します。
組織消化の場合は、1分あたり1,000回転で60分間、37°Cシェーカーにチューブを置きます。インキュベーションの終わりに、血清補充培地の1ミリリットルで消化を停止し、24ウェルプレートにサンプルを転送するために、プレウェット、火の丸めた、広い、1,000マイクロリットルのピペットチップを使用します。蛍光顕微鏡で細胞のGFP発現を確認します。
腺の先端のほとんどは、そのまま見るべきであり、いくつかの二次的な細胞を分離する必要があります。丸みを帯びた、狭い、1,000マイクロリットルのピペットチップを使用して、細胞を3〜5回穏やかにトリチュレートしてアクセサリー腺組織を破壊します。次いで、細胞を個体化するために、非常に狭く、丸みを帯びた1,000マイクロリットルピペットチップを1〜2回使用する。
セルのセルの決済を 15 分間許可します。細胞が顕微鏡下で健康に見えるのを確認し、余分な培地を取り除きます。次に、新しい1.5ミリリットルのチューブに細胞を移し、残りの細胞を回収するために新鮮な培地でウェルをすすいます。
Abd-B-GAL4コンストラクトは、これらの実験で、GFPを有する二次細胞ではなく、主要な細胞にラベルを付けるために使用することができる。本研究では、両方の細胞タイプを野生型およびiab-6cocuD1変異体付帯腺から選別した。このD1変異体は、Abd-BおよびMSA転写産物の発現を欠いているため、二次細胞の発達、形態、および機能に影響を及ぼす。
細胞解離後、FACSを使用してDRAQ7に基づいて生きている細胞を選択し、GFP蛍光レベルを使用して二次細胞および主細胞を単離する。RNAは各細胞集団から抽出され、その後のRT-qPCRおよびシーケンシングのためにサンプル当たり2ナノグラムに調整される。野生型の主細胞および二次細胞抽出物に対するリアルタイム定量PCRによる特異的遺伝子の発現の定量化により、二次細胞遺伝子であるRab19およびMSAは二次細胞抽出物のみから検出され、メイン細胞遺伝子性ペプチドは主細胞サンプルからのみ検出されることを明らかにしている。
3つの野生型および3つの変異体反復のRNAシーケンシングデータに関する主成分分析は、野生型が両方のクラスターを互いに近接させ、突然変異体サンプルから遠く離れたところに複製することを明らかにする。特定の遺伝子に整列した読み取りを可視化すると、アクチン5Cなどのハウスキーピング遺伝子と、Rab19およびDveの二次細胞特異的遺伝子が両方の遺伝子型で発現することが示されている。しかし、MSAの場合、野生型ハエで観察される遺伝子の強い発現は突然変異株で失われる。
十分な生きた二次細胞の解化を得ることは、正常な処置のために重要である。したがって、小規模実験で解剖および解離プロトコルを検証する。この方法は、少数のハエから両方の細胞タイプの補助腺を選別することを可能にし、それらの細胞が複数の遺伝的または環境条件に転写反応する方法の研究を可能にする。
男性の生殖の成功は、遺伝子型、年齢、交配状態を含む多くの事柄の影響を受けることが知られています。この方法の容易さは、これらの要因がアクセサリー腺転写にどのような影響を与えるかを調査することを可能にする必要があります。
