著者らは、Veraksaラボのメンバーに、原稿に関する有益なコメントとプロトコル改善の提案を感謝します。 AVは、NIHグラントGM105813およびNS096402によって支持された。 LYは、マサチューセッツ大学ボストンSanofi Genzyme博士号取得フェローシップの支援を受けました。

1. 5Lフライケージの調製（15cmプレートに適合する） <ol><li>必要な材料を入手してください：ふた付きの5クォート（4.7リットル）の容器、 図1Aのナイロンメッシュ、およびカミソリの刃。 </li><li>直径12cmの円に印を付け、カミソリの刃を使って容器の底に穴をあけます（ 図1B ）。蓋に直径15 cmの穴を切ってください（ 図1C ）。 </li><li> 25×25cmの正方形にナイロンメッシュをカットします。 </li><li>容器の上端にメッシュを置き、ふたで押し下げます（ 図1C ）。メッシュがきつく、ふたが傾いていないことを確認してください。ケージにはハエが植えられます（ステップ5.3を参照）。 </li></ol> 2. 1Lフライケージの調製（10cmプレートに適合する） <ol><li>必要な材料を入手する：電気ドリル、76mm（3インチ）の切削工具（ 図1EおよびFナイフメッシュ、カミソリ、サンドペーパー、ゴーグル、作業手袋を備えた直方体の1Lプラスティックジャー（igure 1F）。 </li><li>蓋をしっかりとねじ込みながら蓋をしっかりと締め、プラスチック製の瓶の底部とふたの3インチ（76 mm）の穴を切ってください（ 図1G ）。穴を開け始めるときに切削工具を円の中心に置く。 注意：この手順では目の保護具を着用し、手袋を着用してください。 </li><li>剃刀の刃とサンドペーパーで穴の端を滑らかにします。 </li><li> 18×18cmの正方形にナイロンメッシュを切ってください。 </li><li>瓶の上端にメッシュを置き、蓋をねじ込むことで締め付けます（ 図1G ）。メッシュがきつく、ふたが傾いていないことを確認してください。ケージにはハエが植えられます（ステップ5.3を参照）。 </li></ol> 3.リンゴジュース（AJ）プレートの調製<ol><li> 2Lフラスコに19gの寒天と1Lの18.2MΩ・cmの水を加えます。攪拌棒を加え、短時間混ぜる。 </li><li> 30分間オートクレーブ。一方、100％リンゴジュース濃縮物を凍結ストックから解凍し、10％（重量/体積）の4-ヒドロキシ安息香酸メチル溶液をエタノール中で10mL調製する。 </li><li>オートクレーブ後、攪拌プレート上で寒天を混合し、80％の100％リンゴジュース濃縮物および10％（重量/体積）の4-ヒドロキシ安息香酸メチル溶液10mLをフラスコに加える。一定の混合で室温で冷却する。 </li><li>各皿の寒天レベルが約5 mmになるように、15 cmペトリ皿（5 Lケージ用）または10 cmペトリ皿（1 Lケージ用）を注ぎます。室温で凝固させ、ビニール袋で包みます。 AJプレートは4℃で2週間保存できます。 注：ペトリ皿は洗って再利用することができます。 </li><li>湿った酵母ペーストを調製する：簡単な混合を可能にする蓋を備えた100mLの容器に活性乾燥酵母を注ぎ、少量の水を加えながら撹拌しながら、濃くて完全に混合するペースト。 4℃で最大2週間保管してください。 </li></ol> 4.溶解試薬の調製<ol><li> 250mMトリスpH7.5,25％グリセロール、1％オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（IGEPAL CA-630）、7.5mM MgCl 2,625mM NaCl、125mM NaF、5mM Na 3 VO 4を調製する。 <ol><li> 200mLを作るために：絶えず撹拌しながら、71mLの水中に1gのNaF粉末と184mgのNa 3 VO粉末を完全に溶解する。 1MトリスpH 7.5の50mL、100％IGEPALの2mL、1M MgClの1.5mL、および5M NaClの25mLを加える。次に50 mLのグリセロールを添加し（最後に加える）、1時間撹拌を続ける。 </li><li> 250mLフィルターユニットを使用してフィルター滅菌する。この工程は遅くなる可能性があるが、不溶性微粒子を除去するためには溶液を濾過することが重要である。 50 mLチューブで10 mLずつ分注し、-80°Cで保存します。 </li></ol></li><li>水中で1Mジチオスレイトール（DTT）溶液を調製する。 1 mLのアリコートで-20℃で保存する。 </li><li>プロテオームを得るエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いたアゼイン阻害剤カクテル錠剤。 4℃で保存する。 </li><li> 10mLのシリンジおよびシリンジフィルター（直径26mm、界面活性剤を含まない酢酸セルロース（SFCA）膜、孔径0.45μm）を入手する。 </li></ol> 5.フライ胚の収集<ol><li>関心のあるタグ付きタンパク質を運ぶトランスジェニックフライラインをボトル（約100フライ/ボトル）で増幅し、フライラインごとに25〜30本のボトルが蓄積されるまで2日ごとにボトルを移す。同様の方法で制御在庫（ 例えば 、 ywライン）を増幅します。 </li><li> AJプレートを室温まで暖めます（約1〜2時間、一晩中行うことができます）。手袋をした指を使って、AJプレートの中央に若干の濡れた酵母ペーストを広げ、 15cmのプレートの場合は6cmの円、10cmのプレートの場合は4cmの円である。 </li><li> 標準的なショウジョウバエの段階設定を使用して、二酸化炭素の流れでハエを麻酔し、ケージ（5リットルのケージにつき約15のよく成長したハエのボトル、1リットルのケージあたり5ボトル）。 <ol><li>ステップ5.2の準備済みのAJプレートでケージの底を覆い、テープの2つのストリップを使用してAJプレートをケージにテープします（ 図1Dおよび1H ）。プレートを交換するときに簡単に剥がれるように、プレートの上にあるテープの先端を折り畳むと便利です。 </li><li>ハエが麻酔から回復した後、プレートを下にしてケージを保持し、上部に噛み合わせます。 注意：ハエが完全に回復するまで待つことが重要です。さもなければAJプレートと酵母ペーストに固執します。 </li><li>実験の終わりに、ケージを洗浄のために準備するために、ケージを数時間冷凍庫に入れる。メッシュを水に数時間浸すと、クリーニングが容易になります。 </li></ol></li><li>ケージをハエと室温で2〜3日間インキュベートし、AJプレートを1日2回交換する。プレートを交換するには、ケージを上下逆さまにして、テープをプレートからはがすが、プレートをケージに保持し、ベンチ上のケージ全体を静かにタップして、新しいプレートの交換を迅速に行い、ハエが逃げないようにする。 注：ハエはケージに適応する必要があり、3日目から始めるのが最善です。彼らはピークレベルで約4-5日間寝続けるでしょう。上の敷設能力で2つの5Lケージは、一晩の収集で1gまでの胚を産生することができる。小規模実験には1リットルのケージを使用します。 </li><li>ハエが新鮮なAJプレートに胚を一晩（約16時間）置くことを可能にするか、または任意の他の所望の時間長さに置く。 </li><li>翌朝、使用したフライラインごとに1つずつ、胚収集用のメッシュ容器をマーキングし、計量します。 </li><li> セクション4の試薬を使用して、1x溶解バッファーを調製します（注意：すぐに使用できる1x溶解バッファーは、抽出直前に調製しなければなりません）：10mLの5x濃縮溶解バッファー（-80℃で保存） 50mLのチューブに入れた。 <ol><li> 1 MDの50μLを加えるTTで1mMの最終濃度にし、十分に混合し、2つの50mL試験管に分け、各25mLを分取する。チューブの1つに、1つのプロテアーゼ阻害剤錠剤を加え、4℃で30分間回転させる。錠剤が溶解している間、胚を収集し、脱皮する（ステップ5.8〜6.6）。錠剤が完全に溶解していることを確認し、バッファーを氷上に置いてください。 注：DTTを含む1×バッファーの2番目のチューブは-80°Cで保存することができ、次の実験の前にタブレットの添加が必要になります。タンパク質精製工程中のその後の洗浄を考慮に入れて、2mLまでの溶解緩衝液25mLで十分である。 </li></ol></li><li>使用されたフライラインの遺伝子型を用いてケージ上のAJプレートに印を付け、新鮮なもののためにプレートを交換する。 注：この段階で過剰の酵母ペーストをプレートから掻き取ることができます。胚は、発育時間の所望のウィンドウを得るために、25℃または室温でプレート上で老化させることができる。 </li><li> 十分な水を加えるo各AJプレートをカバーする。柔らかいペイントブラシ（平らな頭部、約10mm幅）は、平らなプレートから胚を静かに取り除きます。先に計量してマークしたメッシュ容器に胚を注ぎ、余分な水を排水する。 <ol><li>必要に応じて、すべての胚を取り除くためにプレートの2回目のすすぎとブラッシングを行います。同じフライラインの追加プレートの胚を同じメッシュコンテナに結合する。 </li></ol></li><li>簡単にペーパータオルでメッシュを拭き取り、余分な水分を取り除きます。 </li></ol> 6.胚の脱皮<ol><li> 50％漂白剤を含む6cmのペトリ皿（水中のvol / vol溶液）を半分充填する。 注：Table of MaterialsおよびReagentsの漂白剤ブランドに関する重要なコメントを参照してください。 注意：手袋を着用し、衣類に漂白剤をつけないでください。 </li><li> 2つの大きなペトリ皿を水で準備する。 </li><li>胚を50％漂白剤で90秒間メッシュ容器に浸します。 incuの間にメッシュを静かにタップ漂白剤溶液中の胚を懸濁させるために2〜3回繰り返す。 </li><li> 90秒のインキュベーションの終わりに、2つの皿の各々のメッシュ容器を約10秒間水で洗浄する。 </li><li>噴霧ボトルを使用してメッシュ容器を18.2MΩ・cmの水で完全にすすぎます。また、メッシュコンテナの側面と外側を洗います。 注：徹底的な洗浄の後、漂白剤の臭いは検出されません。 </li><li>メッシュ容器をペーパータオルで汚す。胚でメッシュコンテナを計量し、ステップ5.6で得られた空のコンテナの重量を引く。胚の結果重量を記録する。目指すべき胚の量は0.5〜1gが良い。 </li></ol> 7.胚芽抽出物の調製<ol><li>プロテアーゼ阻害剤（ステップ5.7より）を含む溶解バッファー1 mLをdounceガラスホモジナイザーに加え、氷上に保ちます。胚をメッシュ容器からホモジナイザーに移す。 注：胚は、平らな末端で採取することができますファーメタルスパチュラまたはブラシに入れ、緩衝液に直接移した。このセクションのすべての手順を氷上で実行します。 </li><li>メッシュ上の残りの胚をさらに1mLの溶解緩衝液で洗い流し、ホモジナイザー中の材料に加える。胚をホモジナイザーの底まで沈降させ、上清を注意深く吸引する。 </li><li>プロテアーゼ阻害剤（ステップ5.7から）を含む溶解緩衝液をホモジナイザーに添加し、胚1グラムあたり5-6mLの溶解緩衝液を目標とする。 </li><li>緩やかなフィットの乳棒で4-6ストロークで胚を均質化する。 注：最初のストロークの間に、より多くの抵抗があります。溶液がはねられるのを避けるために、乳棒を連続的に動かすようにしてください。 </li><li>タイトフィットの乳棒で8-10ストロークだけ胚を均質化する。 </li><li>ホモジネートを氷上で20分間インキュベートする。 </li><li>ホモジネートをマイクロ遠心チューブに移し、最高速度（約13,000 xg）で15分間4℃で遠心分離します。 </li><li>避けるペレットと非常に上の脂質層を取り除き、上清を新鮮な微量遠心管に移し、4℃で15分間、最高速度（約13,000×g）で遠心分離する。 </li><li>慎重に1mLの先端で上清を吸引し、0.45μmのフィルターが取り付けられた冷却された10mLシリンジにロードする（同じサンプルのアリコートを1つのシリンジに合わせる）。氷上で標識した15 mLチューブにすべての溶液を押します。この抽出物は、その後のタンパク質精製実験にすぐに使用することができ、液体窒素中で急速冷凍し、将来の使用のために-80℃に保つことができる。 注：その後の胚の解凍中にプロテアーゼが活性化され、タンパク質分解を引き起こす可能性があるため、胚よりも抽出物を凍結する方がよい。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

ここに提示されたプロトコールは、 ショウジョウバエの集団ケージを中規模に設定し、胚から全細胞タンパク質抽出物を作製するための単純で一般的な手順である。得られた抽出物は、アフィニティー樹脂上のタンパク質複合体の精製など、様々な下流の用途に使用することができる。タンパク質分解を最小限に抑えるために、抽出工程を氷上で行い、強力なプロテアーゼ阻害を用い...

遺伝学的スクリーニング、そして最近では、ゲノムアプローチが生物学的機能の研究に革命をもたらしている。しかしながら、重要な細胞情報は、タンパク質および相互作用するパートナーの集合体にコードされている。伝統的な遺伝子改変スクリーニングは、律速経路成分を同定し、間接的な相互作用を回復することができるが、プロテオームアプローチの強さは、目的のタンパク質の完全な即時相互作用ネットワークを同定する能力にある。したがって、プロテオミクスは生物学的システムを研究する貴重な直交方法であり、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、伝統的な遺伝子スクリーニングを補完するものです。 Affinity purification-mass spectrometry（AP-MS）は、細胞および組織1,2の固有環境におけるタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）を研究する強力なアプローチであることが証明されています。この方法は、特定の開発における直接的または間接的な相互作用の同定を可能にする様々な発生経路における複数の新規PPIを同定するために首尾よく使用されている（参考文献1で概説されている）。 PPI研究の明白な成功にもかかわらず、それらの大部分は、目的の「餌」タンパク質が過剰発現された培養細胞で実施されている。細胞培養においてPPIを研究することには2つの問題がある：第1に、特定の細胞株は、特定のタンパク質の発現の欠如のために完全な相補性を提供しない可能性がある。第二に、このような分析に通常用いられる高い過剰発現は、タンパク質の誤った折り畳みまたは誤った陽性の相互作用の同定のような人工物につながる可能性がある。 インビボで PPI を分析することによって、これらの制限の両方を克服することができる。そのような実験における限定的な工程は、タンパク質複合体を精製するための出発物質の利用可能性である。 ショウジョウバエmelanogasterは、機能解析のモデルとして長く使用されてきた最近、インビボで PPIを研究するための優れたシステムであることも示されています。 ショウジョウバエの胚発生は、胚を大量に容易に採取することができ、また胚発生の過程で大部分の遺伝子（&gt; 88％）が発現され、関連性の高いin vivo環境を提供するためPPIを研究するのに特に魅力的な組織型であるPPIs 3 。 伝統的に、ハエの生化学的研究は、機能的転写ライセートを精製するために必要なものなど、非常に大規模な胚コレクション（100〜150g）を利用している4,5。これまでのショウジョウバエの AP-MS研究では、タンデムアフィニティ精製（TAP）などの2ステップ精製手法に依存し、各ステップ6で材料が喪失したため、大量の胚が必要でした（5~10g）。大物高価な（商業的に購入された場合）および維持管理に時間がかかることがあり、7,8,9を清潔にすることができる、大きな集団ケージに胚コレクションを設置する必要があった。 シングルステップ親和性精製アプローチの開発における最近の進歩、ならびに質量分析計の高感度化は、出発物質の必要量を一桁減少させた。ストレプトアビジン結合ペプチド（SBP）または緑色蛍光タンパク質（GFP）などのタグを使用し、1g未満の胚から開始することにより、餌タンパク質および相互作用する成分の量を、質量分析10,11 。 ここに提示された議定書の目標は、研究者が過度に私はインビボでのPPIの生化学分析に対する認識された障壁となった。そのためには、 ショウジョウバエの胚を中程度（0.5〜1g）で採取するための簡単で安価な手順を提供し、続いてAP-MSまたは他のアプローチによる後の分析に適した全細胞タンパク質抽出物の一段階調製を行う。私たちの方法は、どの実験室でも簡単に作成できるカスタムメイドの1Lまたは5L集団ケージの使用に依存しています。さらに、ここに提示された抽出条件は、培養細胞およびインビボの両方において、10,12,13,14,15,16,17のいくつかの研究で検証されている。

<table><tbody><tr><td>Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3)</td><td>Home Depot</td><td>209330</td><td>For making 5-L cages.</td></tr><tr><td>Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3)</td><td>Home Depot</td><td>209320</td><td>Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.</td></tr><tr><td>Sefar NITEX nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-180/44</td><td>180 micron, 44% open area, used for fly cages.</td></tr><tr><td>Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor</td><td>Home Depot</td><td>49-56-9670</td><td>3 inch cutting tool for making 1-L cages.</td></tr><tr><td>Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td>For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.</td></tr><tr><td>Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch</td><td>Red Star&amp;nbsp;</td><td></td><td>can be purchased from Amazon.com or other suppliers.</td></tr><tr><td>Frozen 100% Apple Juice Concentrate&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>can be purchased from a grocery store. Has to say &quot;100% apple juice&quot; on the can.</td></tr><tr><td>Methyl 4-hydroxybenzoate</td><td>Acros Organics</td><td>AC126965000</td><td>also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>used for preparing lysis buffer.</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-2A</td><td>0.2 &amp;mu;m pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.</td></tr><tr><td>CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td>Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.</td></tr><tr><td>Corning SFCA syringe filters&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-21</td><td>SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 &amp;mu;m. Used for filtering final extract samples.</td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Luer-Lok Disposable Syringes without Needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td>for filtering final extract samples. BD cat # 309604.</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td></td><td>used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.</td></tr><tr><td>Corning Costar Netwell Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-213</td><td>mesh containers for embryo collections. 74 &amp;mu;m mesh size, 6-well.</td></tr><tr><td>Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-435B</td><td>homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.</td></tr></tbody></table>

medium-scale preparation of drosophila embryo extracts for proteomic experiments

タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の分析は、細胞シグナル伝達、生物発達、および疾患などの生物学的プロセスおよびメカニズムを研究するために欠かせないアプローチとなっている。相互作用ネットワークの最も自然で不偏なビューを得るために、生体内材料を用いて PPI情報を得ることがしばしば望ましい。ショウジョウバエDrosophila melanogasterは、 インビボで PPIを研究する優れたプラットフォームであり、生化学実験用の材料を単離するための直接的なアプローチに役立ちます。特に、ミバエの胚は、この発達段階で動物を集めるのが容易であり、タンパク質の大部分が胚発生において発現され、したがってほとんどのPPIを明らかにする関連する環境を提供するため、PPIを研究するのに便利なタイプの組織である。ここでは、 ショウジョウバエの胚を中規模（0.5〜1g）で採取するためのプロトコールを提示します。これは、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）によるPPIの分析を含む、プロテオーム用途に適している。どの実験室でも簡単かつ安価に設置できる胚収集用の1Lおよび5Lケージの設計について説明します。我々は、AP-MSのような下流のアプリケーションで直接使用することができる溶解物を生成するための胚収集およびタンパク質抽出のための一般的なプロトコルも提供する。我々の目標は、すべての研究者がインビボで PPIの分析を実施するためのアクセス可能な手段を提供することである。

タンパク質複合体精製実験におけるこのプロトコールの使用を説明するために、本発明者らは、ホモ接合性生存フライライン、EGFPタグ化ショウジョウバエ細胞外シグナル調節キナーゼ（ ロール遺伝子によってコードされるERK）を対照下で発現するarm-EGFP-ユビキタスで表現されたアルマジロ （ arm ）プロモーターの18,19 。 <...

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Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

このプロトコールの目標は、中程度の規模（0.5〜1g）でショウジョウバエ胚を採取し、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）のような下流のプロテオーム用途に使用できるタンパク質抽出物を調製するための、 ）。

中規模の<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;プロテオーム実験のための胚抽出物

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

medium-scale-preparation-drosophila-embryo-extracts-for-proteomic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

7.8K ビュー.  University of Massachusetts Boston. このプロトコールの目標は、中程度の規模（0.5〜1g）でショウジョウバエ胚を採取し、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）のような下流のプロテオーム用途に使用できるタンパク質抽出物を調製するための、 ）。 

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Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

遺伝学

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

に有糸分裂研究のためのマイクロインジェクション技術キイロショウジョウバエ合胞体胚

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

生物学

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

発生生物学

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

初期ショウジョウバエ胚における免疫組織化学およびRNAのその場分布のためのプロトコル

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged molecules within complex biological samples. While traditional confocal microscopes allow one to resolve two adjacent fluorescent point sources located a few hundred nanometers apart, observing the finer details of subcellular biology requires the ability to resolve signals in the order of tens of nanometers. Numerous hardware-based methods for super-resolution microscopy have been developed to allow researchers to sidestep such resolution limits, although these methods require specialized microscopes that are not available to all researchers. An alternative method for increasing resolving power is to isotropically enlarge the sample itself through a process known as expansion microscopy (ExM), which was first described by the Boyden group in 2015. ExM is not a type of microscopy per se but is rather a method for swelling a sample while preserving the relative spatial organization of its constituent molecules. The expanded sample can then be observed at an effectively increased resolution using a traditional confocal microscope. Here, we describe a protocol for implementing ExM in whole-mount Drosophila embryos, which is used to examine the localization of Par-3, myosin II, and mitochondria within the surface epithelial cells. This protocol yields an approximately four-fold increase in sample size, allowing for the detection of subcellular details that are not visible with conventional confocal microscopy. As proof of principle, an anti-GFP antibody is used to distinguish distinct pools of myosin-GFP between adjacent cell cortices, and fluorescently labeled streptavidin is used to detect endogenous biotinylated molecules to reveal the fine details of the mitochondrial network architecture. This protocol utilizes common antibodies and reagents for fluorescence labeling, and it should be compatible with many existing immunofluorescence protocols.

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Here, a protocol for the implementation of expansion microscopy in early Drosophila embryos to achieve super-resolution imaging using a conventional laser-scanning confocal microscope is presented.

拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

抗体媒介ライブイメージングによるタンパク質可視化の強化

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

著者スポットライト:動物の形態形成研究における機械的および生化学的シグナルのダイナミクスの解明 

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

中規模の

要約

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しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャライブラリの生成

に有糸分裂研究のためのマイクロインジェクション技術キイロショウジョウバエ合胞体胚

の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

初期ショウジョウバエ胚における免疫組織化学およびRNAのその場分布のためのプロトコル

拡大顕微鏡を用いたショウジョウバエの胚全体拡大による超解像イメージング

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化

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初期ショウジョウバエ胚における免疫組織化学およびRNAのその場分布のためのプロトコル

拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャライブラリの生成

拡大顕微鏡を用いたショウジョウバエの胚全体拡大による超解像イメージング