疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

造血幹細胞に特異的に遺伝子操作を行うマウスを確立する効率的で経済的な方法を開発しました, ゲノム編集技術とレンチウイルス媒介トランス遺伝子デリバリーシステムを使用.このプロトコルの利点は、従来のマウストランスジェニックアプローチと比較して、造血細胞に特異的な変異を含む動物モデルを迅速かつ費用対効果の高い方法で作成できることです。この手順を実証することは、私の研究室の研究者であるイン・ワンです。

レンチウイルス粒子を生成するには、コラーゲン溶液で6つのウェルプレートをコードし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で30分間インキュベートします。次いで、293T細胞をプレートにシードし、さらに2時間インキュベートします。一方、レンチウイルスベクターの0.9マイクログラム、psPAX2の0.6マイクログラムおよびpMD2の0.3マイクログラムを組み合わせることによって、3つのトランスフェクションプラスミドの混合物を調製する。

G及び1ウェルあたり10マイクロリットルに脱イオン化した。次に、プラスミド混合物に50マイクロリットルの1X PBSと5マイクロリットルの希釈されたPEI MAXを慎重に加え、室温で15分間インキュベートする。インキュベーションの後、DMEMを1ミリリットル加えます。

6つのウェルプレートから培地を吸引し、各ウェルにプラスミド混合物を1ミリリットル加えます。さらに3時間プレートをインキュベートします。メディアを新鮮なDMEMに交換し、24時間インキュベートします。

新鮮なDMEMを1ミリリットル加え、さらに24時間インキュベートします。合計48時間のインキュベーションの後、上清を50ミリリットルチューブに移し、3000倍Gで遠心分離機を15分間送り、自由浮遊細胞を取り除きます。上清を0.45マイクロメートルのフィルターでフィルターし、超遠心分離機で3時間フィルターします。

上清を慎重に吸引し、白いペレットを残します。ペレットを100マイクロリットルの無血清造血細胞拡張培地で再懸濁します。10マイクロリットルのアリコートを保管してウイルス用タイターを測定し、残りのサスペンションをマイナス80°Cで保存して使用する準備ができるまで保管します。

骨を単離した後、RPMIで50ミリリットルの円錐形チューブに入れ、チューブを氷の上に置きます。バイオセーフティキャビネットで、骨を無菌100ミリメートル培養皿に移します。その後、鈍い鉗子で骨をつかみ、解剖はさみを使用して慎重に両方の骨端を切断します。

10ミリリットルのシリンジに氷冷RPMIを充填し、22ゲージの針を使用して、シャフトから新しい100ミリメートル培養皿に骨髄を洗い流します。すべての骨髄が採取された後、18ゲージ針で10ミリリットルの注射器を通して骨髄を通過させることによって、単一の細胞懸濁液を作る。70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に細胞懸濁液をろ過します。

その後、原稿の方向に従って管を遠心分離し、上清を吸引する。最適化された分離バッファーの適切な量で細胞ペレットを再中断します。系統陰性細胞を分離するには、製造業者の指示に従って系統細胞枯渇キットを使用します。

無血清造血細胞拡張培地で単離された系統陰性細胞を再懸濁する。2時間の間、5%の二酸化炭素で37°Cで細胞を事前インキュベートします。次に、原稿の指示に従ってレンチウイルスを追加し、さらに16〜20時間インキュベーターに細胞を残します。

翌日、レンチウイルス導入細胞を15ミリリットル円錐形チューブに集め、10分間Gの300倍に遠心分離する。NHAガイドラインによると、リースグループレベル2でレンチウイルスベクターを扱うことが重要です。施設の規制に基づき、予防措置を講じる必要があります。

上清を慎重に吸引し、1本のマウスにつき200マイクロリットルのRPMIでペレットを再懸濁します。マウスに移植するまで、細胞を室温に保ちます。2回目の照射セッションの後、インスリン注射器を用いて、経線陰性細胞を各麻酔マウスにレトロ眼窩注射する。

骨髄移植後3~4週間後、毛細管を用いてレトロ眼窩静脈から血液サンプルを採取する。20マイクロリットルの血液を丸底のポリスチレン試験管に移し、氷の上に置きます。RBCリシスの後、モノクローナル抗体のカクテルを暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞を洗浄、固定、遠心分離し、FACSバッファーの400マイクロリットルに細胞ペレットを再中断します。フローサイトメトリーで分析するまで、サンプルを摂氏4度に保ちます。系統陰細胞伝達の成功はRFPのフローサイトメトリック検出と評価することができる。

7日間のインビトロ培養の後、平均して75.7%の細胞が導入されたことが実証されている。フローサイトメトリーは、トランスサイクリックおよび非トランスデューセド造血幹細胞で再構成した後のマウス末梢血の解析にも使用されています。好中球の平均94.8%、単球の93.5%、および82.7%のB細胞がRFPを発現する。

RFP陽性血液細胞からのゲノムDNAは、PCR増幅され、配列解析のためにサブクローニングされている。様々な突然変異が検出され、69%のクローンがフレーム外または早期停止突然変異を示す。この手順を成功させるためには、高いウイルス対策ストックの調製と造血細胞のトランスダクションおよび移植のための最適化された条件が必要である。

この手法を応用して、心血管疾患の法則を研究しています。しかし、それはまた、造馬性悪性腫瘍を研究するために有用である.この方法により、造血系における新しい遺伝子の機能を高効率かつ高い方法で研究することができます。

私たちは、トランスジェニックマウスの可用性上にこれを収集します。