私たちのプロトコルでは、小さなガラスビーズからのフィルム再水和を使用して、ペプチドで作られた反応コンパートメントを形成します。実験では、プロトコルのシンプルさと堅牢性の恩恵を受けます。この技術の主な利点は、使用された粗細胞抽出物のような敏感なサンプルを組み込む能力である。
有機溶媒との接触は、サンプルに大きな影響を与えます。この手順を開始するには、遠心真空濃縮器を使用してELP溶液を1.1ミリモルに濃縮します。この濃縮液の200マイクロリットルを2~1クロロホルムとメタノール混合物の1,250マイクロリットルと混合します。
溶液を完全に混合するボルテックス。次に、10ミリリットルの丸い底フラスコに球状ガラスビーズ1.5グラムを加えます。丸底フラスコにELPとクロロホルムメタノール溶液を加え、軽く振って混ぜます。
フラスコをロータリーエバポレーターに接続します。速度を150 RPMに調整し、液体が室温で蒸発するまで約4分間、圧力を20,000パスカルに調整します。沸騰遅滞の可能性があるため、ロータリーエバポレーターを使用する際には注意が必要です。
この後、丸底フラスコの開口部を中心にアルミ箔を緩く包み、ガラスビーズの損失を防ぎ、フラスコを少なくとも1時間デシケータに入れ、残りのクロロホルムとメタノールが蒸発することを保証する。単一の実験の場合、100ミリグラムのペプチドをガラスビーズと60マイクロリットルの膨潤液と混合する。このサンプルを摂氏25度で5分間インキュベートします。
テーブルトップ遠心分離機を使用してサンプルを素早く遠心分離し、ガラスビーズを堆積させます。その後、小胞を含む上清を収集するためにピペットを使用しています。まず、予精製プラスミドDNAの100マイクロリットルを、ロティフェノール、クロロホルム、またはイソアミルアルコールの100マイクロ遠心チューブに混合して、より良い相分離を可能にします。
チューブを6回まで静かに反転させ、遠心分離機を16,000 gで5分間室温にします。その後、上相に200マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを6回まで反転させます。試料を16,000倍gで遠心分離し、室温を5分間処理する。
この後、上清を別のチューブにピペットし、エタノール沈殿のために3モル酢酸ナトリウムの10マイクロリットルを加える。冷たいエタノールを摂氏80度で1ミリリットル加え、サンプルを摂氏80度で1時間保存します。次に、サンプルを16,000回gで遠心し、摂氏4度で15分間遠心します。
上清をデカントし、摂氏20度で冷たい70%エタノールの1ミリリットルを追加します。16,000倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。その後、ピペット処理により液体を除去し、DNAペレットを乱さないよう注意する。
残りのエタノールを蒸発させるために、サンプルを室温で約15分間保存します。この後、サンプルに超純水を加えて、サンプル濃度を約300ナノモルに調整し、260ナノメートルで吸収して測定します。転写翻訳反応を調製するために、調製した粗細胞抽出および反応バッファーを氷上に従ってください。
60マイクロリットルの反応ミックスの場合、反応バッファーの37.5マイクロリットルにプラズマDNAを追加し、粗細胞抽出物の28.7マイクロリットルを追加し、58.8マイクロリットルの最終体積に超純水で満たします。反応が始まる直前に、T7RNAポリメラーゼ溶液を1.2マイクロリットル加え、ピペットを上下に加え、混合します。実験期間中、サンプルと腫脹溶液を摂氏29度(通常は4~8時間)でインキュベートします。
小胞の透過電子顕微鏡画像は、TX/TLやPBSなどの様々な膨潤液を使用して小胞を形成できることを示しています。どちらのソリューションでも、サイズ決定は簡単なステップです。動的光散乱は、ガラスビーズ法なしで調製された小胞が直径134ナノメートルをもたらし、ガラスビーズを使用すると25%の多分散性を有し、直径は168ナノメートルをもたらし、多分散性を有する21%の蛍光強度を有し、ELP小胞の内部で発現される2つの蛍光タンパク質の蛍光強度を測定し、その後、フルエンスプレートを使用して測定される。
小胞形成後、小胞と外液の内容物は同じであり、したがって、抗生物質カナマイシンが外液に添加され、タンパク質発現を抑制することに注意することが重要である。コントロールとして、カナマイシンも膨潤液に添加され、その場合には小胞内部のタンパク質発現が抑制される。これは、カナマイシンが膜を通して拡散せず、常に内部発現を常に抑制することを示している。
FRETアッセイは、膜へのELPの組み込みを実証するために行われます。膜Elpsの発現時に、膜内に追加のペプチドが組み込まれ、FRETペア間の平均距離が増加し、ドナーシグナルの増加をもたらす。提示された技術は、単純な反応容器を生成したり、ペプチドベースの膜を有する人工細胞を作成するために使用することができる。
必要に応じて、内部のコンテンツを選択できます。これらのペプチド小胞を使用することで、我々は今、それらの中でより複雑な合成反応を楽しみにすることができます。
