このプロトコルは、しばしば弱く、検出が困難なCD4T細胞応答を研究するためのプラットフォームを提供する。この技術は、抗原の提示に関する事前知識なしにCD4T細胞の検出、列挙、および単離を可能にする。主な利点は、1型糖尿病などの自己免疫状態に関連する非常に頻繁にまれな集団であるCD4T細胞の分析である。
健康なドナーから末梢血サンプルを得ると、50ミリリットルチューブ中の密度勾配培地の15ミリリットル以上の血液を35ミリリットルに重ねる前に、PBSの血液を少なくとも1〜2の比率で希釈する。密度勾配遠心分離によって細胞を分離し、得られた上の血漿層の約20ミリリットルを除去する。次に、赤血球ペレットを避けるように注意して白血球層を収集し、新鮮なPBSで細胞を3回洗浄します。
カウント後、細胞をPBS濃度の1ミリリットル当たり6番目の末梢血単核細胞またはPBMCに10倍に希釈する。個々の10ミリリットルのチューブに各コントロールのための細胞の300マイクロリットルを追加します。PBSで各チューブをトッピングした後、遠心分離によって細胞を沈下し、RP5培地濃度のミリリットル当たり6番目の細胞に10回で細胞を再懸濁する。
その後、1ウェルあたりRP5培地の100マイクロリットルを含む96ウェルプレートの3つの井戸のそれぞれに制御ごとに細胞の100マイクロリットルをプレート。7日間培養インキュベーターにプレートを置きます。次に、残りのPBMCを新しい50ミリリットルチューブに移し、1ミリリットルの細胞懸濁液につき1マイクロリットルのCFSE作業ストック溶液をチューブの側面に加えます。
チューブを数回素早く反転させ、細胞を5分間培養インキュベーターに混ぜ合わせます。インキュベーションの終了時に、5ミリリットルのRP5培地で反応を阻止し、遠心分離により細胞を採取する。ペレットを新鮮なRP5培地のミリリットル当たり10〜6 PBMCに1回再懸濁し、試験される抗原あたり10ミリリットルのチューブに1ミリリットルの細胞を加えます。
その後、1つの抗原につき100マイクロリットルの細胞を、1ウェルあたり対象の希釈された抗原を添加したRP5培地の100マイクロリットルを含む96ウェルプレートウェルの各ウェルに加えます。7日間培養インキュベーターにプレートを置きます。フローサイトメトリック解析のためにCD4+T細胞集団を染色するために、培養終了時に各ウェルから個々の蛍光活性化細胞選別またはFACSチューブに細胞の全容を移す。
0.1%の胎児の子牛血清またはFCSで補われたPBSの1ミリリットルで各サンプルを洗う。適切な抗ヒトCD4抗体のペレットを、チューブあたりPBSとFCSの100マイクロリットルで再懸濁します。光から保護された20分間、摂氏4度で細胞をインキュベートします。
インキュベーションの最後に、新鮮なPBSとFCSの1ミリリットルの新鮮なPBSと1チューブあたりのFCSでサンプルを洗浄し、新鮮なPBSとFCSの100マイクロリットルでペレットを再中断します。分析の直前に、各チューブにヨウ化プロピジウム1マイクロリットルを加える。前方および側面の散乱領域に応じてリンパ球をゲートします。
アポトーシス細胞を除外するには、ヨー化陰性プロピジウムとの間に前方散乱領域をゲートし、非蛍光細胞の電圧ベースラインを設定するために未染色セルを使用します。蛍光シグナルがそれぞれ1000以下になるように、CD4抗体フルオロフォアとCFSE信号の電圧を設定します。単色制御CFSEおよびCD4サンプルを使用して、染色されていないセルで設定された電圧を使用して、各色の正の蛍光シグナルを確認します。
CFSEとヨウ化プロピジウムは、ある程度のスペクトル重複を有するので、CFSEのみのサンプルがヨウ化プロピジウムチャネルにシグナルを生じなくなるまで、蛍光CFSEからヨウ化プロピジウム蛍光を差し引くように補正を調整する。全てのサンプルが分析されたら、抗原を刺激したグループから分割細胞数を5000個の未分割細胞で除いて細胞分裂指数を算出し、抗原を含まない細胞から5000個の未分割細胞当たりの分割細胞の平均数を求める。ほとんどすべてのドナーは、破傷風トキソールを有用な陽性対照抗原にするワクチン接種を受けているため、インビトロ刺激後の破傷風トキソールに対する強いT細胞応答を示す。
しかし、非刺激性PBMCからのCD4+T細胞の増殖は最小限である。ヒトプロインスリンC-ペプチドによる7日間の刺激の後、プロインスリンCペプチド特異的CD4+T細胞は、1型糖尿病の個人の末梢血で検出することができる。インフルエンザAウイルスマトリックスタンパク質で刺激されたPBMCも増殖を示す。
これらのデータをまとめて、これらのデータは、アッセイが短い合成ペプチドと同様に全長タンパク質を使用して行われることを実証する。この方法のFACS成分は、細胞分類フローサイトメーターを用いて行うことができる。細胞ソーターを使用して、抗原特異的T細胞を、下流分析のために単一細胞レベルで単離することができる。
この方法により、早期発症1型糖尿病の個体におけるCD4T細胞応答の発見が可能になった。他の方法を用いたこれらの稀なT細胞集団を分析することは、様々な技術的課題を提示する。
