我々のプロトコルは、アクセス可能で制御されたマウスモデルにおける近腹歯間炎の研究を可能にする。したがって、このプロトコルは、患者のサンプルまたはインビトロモデルよりも利点があります。この技術の主な利点は、マウスが十分に研究されており、方法は施設要件の面で技術的に簡単であり、費用対効果が高いということです。
この手順は、歯の小さな寸法のために困難であるため、技術の位置と性能について学ぶために手順を視覚化することが有益です。つま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、閉じたセル押出ポリスチレンフォーム表面上の支配的な手側にマウスを置き、テープで足を固定します。切歯1対1の単一のゴムバンドを使用し、長い針を閉細胞押出ポリスチレンフォーム表面にピン留めし、口を開く。
右頬を引っ込めるために泡にテープで閉じた鉗子を使用してください。そして、フォームとマウスを顕微鏡と光源の下に置きます。次に、歯科ヘラを使用して舌を引き込み、27ゲージ針を使用して、第1の下顎臼歯に隣接する粘膜下垂体折り畳に25〜50マイクロリットルの局所麻酔薬を注入する。
注射部位の周りの組織の腫脹は観察されるべきである。パルプを露出するには、丸い高速ダイヤモンド0.8ミリメートルの歯科用バーを1分間に800発の速度で装備した適切な歯科用モーターを使用して、パルプホーンが象牙質を通して見えるまで、最初の右下顎臼歯の咬合部を掘削します。KまたはHファイル、番号8または番号10を使用してパルプを突き刺し、角にファイルを挿入できるように、メスと遠位のパルプホーンを覆う象牙質を破ります。
パルプ内のファイルを可能な限り深く使用しながら、ファイルで開口部を広げながら、パルプからの出血は、通常、歯の鋭い縁をバーで観察し、実験中の痛みを軽減するためにaclusionから歯を取り除きます。マイクロブラシを使用して、残骸を清掃してください。そして、対照的に最初の下顎臼歯を残します。
処置後の最初の3日間は、動物に体重を量り、1日1回、1キログラム当たり0.1ミリグラムの腹腔内に注入する。週に2〜3回の計量と一般的な行動評価によって、今後42日間にわたって動物を監視し続けます。そして、フォローアップ期間を通してケージの床にペトリ皿に水で柔らかくした食品ペレットを提供します。
実験の最後に、外科用ハサミと鉗子を使用して、治療された側と治療されていない側面の両方に3つの大臼歯を含む顎の部分を集める。そして、サンプルに主に骨と歯を残して、可能な限り柔らかい組織の多くを剥がすために鉗子を使用してください。PBSでティッシュを簡単にすすい。
24〜48時間の4%パラホルムアルデヒドに固定する前に。次に、新鮮なPBSでサンプルを3回すすいだ。マイクロコンピュータ断層撮影またはマイクロCT解析では、収穫した組織を12ミリ径のチューブに入れ、1.5ミリリットルのPBSをスキャナーステージに配置します。
サンプルは、歯と根の頬または言語の表面がチューブの底に平行に横たわるように向けられた。スポンジを使用してサンプルを分離します。そして、柔軟なフィルムでチューブの上部をカバーします。
制御ファイルを選択し、エネルギーを70キロボルト、強度を114マイクロアンプに、解像度を6マイクロメートル立方体ボクセルサイズに設定します。[スカウトビュー]をクリックします。イメージが表示されたら、[リファレンス ライン] をクリックし、スキャンするサンプルの領域にマークを付け、各サンプルの後に [スキャンの追加] をクリックします。
すべてのサンプルがマークされたら、タスク リストに移動し、[対話タスクの開始] を選択します。マイクロCTスライスの輪郭の場合、歯の近似中央を表すスライスを選択し、コロナパルプ、両管のラキュラーパルプ、および両尖語の経理面の面前部が存在する。輪郭パネルをクリックし、遠位根の頂点の遠位点から始まり、毛先根の遠位の境界に続く中間根の頂点、および遠位根の中間境界に続いて、放射状のパケの頂点領域に対して円形の境界線を点印します。
作成した輪郭をコピーして貼り付け、中央のスライスの両側に配置された 5 つのスライスに合わせてコンターを調整します。各サンプルにマークされたコンターの組織容積を計算するには、マイクロCT評価で[タスク]を選択し、[3D評価]をクリックします。次に、3D評価のウィンドウで[選択]をクリックし、組織の体積を計算するフィルタを選択します。
マイクロCT分析の最後に、1ミリリットルのEDTAを含むマイクロ遠心管にスキャナーから組織を10日間移します。脱灰の終わりに、エタノール濃度を増加させた組織学的カセットにサンプルを入れ、1濃度あたり1時間置きます。2番目のエタノール浸漬後、サンプルをキシレンに移して2回の1時間浸漬し、カセットを化学フード内の60°Cの液体パラフィンに移す前に、キシレンが蒸発するようにします。
翌朝、フィドリュードサンプルと根を金型の底面に平行に配置し、組織学的ブロッキングマシンに入れてパラフィンにサンプルを埋め込みます。切片を得るために、パラフィンブロックサンプルをマイクロトーン切断ブロックに固定し、目的の組織に到達するまでサンプルをトリミングします。歯の任意の部分が見える場合は、6マイクロメートルの厚いセクションを取得し始め、冠動脈およびラジカルパルプおよび頭蓋の前部を含む矢状切片が得られるまで切断角度を調整する。
ここでは、処理された下顎全体が示されている。処理された第1右臼歯の倍率は、軸及び遠位パルプ角および運河への入り口の両方の露出の観察を可能にする。マイクロCTイメージングは、髄質曝露、および骨再生の髄質および遠位周発光領域の可視化を可能にする。
実際、組織体積の有意な骨の再投与は、コントロールと比較して、処理された歯で測定される。組織学的分析は、治療された歯において、歯髄自体が壊死を呈することを示し、これは対照組織のパルプ組織と比較してHおよびE染色後に明確に観察することができる。さらに、重要なことに、処置された歯の心房領域において、免疫細胞からなる心房が観察され、対照歯には存在しない。
正しい位置決めが動物の口への良好なアクセスと最適な結果を可能にするように、パルプ露光中に正しくマウスを配置することが重要です。免疫組織組織組織染色やファクスなどの心房炎解析の追加方法や、細胞の詳細な分子解析は、このプロトコルに従って行うことができる。このプロトコルは、歯科研究だけでなく、免疫学的研究にとっても重要であり、内部統制を内蔵した局所誘発炎症のモデルを提供する。
