多くのタンパク質の構造が共有的な二硫化物結合で安定していることは十分に確立されています。最近の研究では、この結合は翻訳後修飾として分類されている。したがって、迅速かつ簡単な方法を使用して、生細胞のシステイン安定化多数体複合体を同定できることが重要です。
この手法の主な利点は、結果を得て、迅速に、簡単に、そして最小のコストで解釈できることです。まず、U-2 OS細胞を最小必須中高グルコースの6平方センチメートルの皿で成長させ、5%の二酸化炭素で摂氏37度で10%FBSと1%のピルビン酸ナトリウムを補う。使用直前に10ミリモルヨウアセトアセトアミドの新鮮なストックを作ります.
細胞が50〜60%の合流度に達した後、細胞培養培地に直接0.1ミリモルの最終濃度ヨウドアセトアミドを加える。室温で2分間ゆっくりと皿を揺らす。次に、細胞から培地を吸引し、5ミリリットルの冷たいPBSで細胞を3回洗浄する。
最終PBS洗浄液を吸引し、1ミリリットルの冷たいPBSを加える。セルスクレーパーを使用して、皿の底から細胞を削り取ります。1ミリリットルのピペットを使用して、PBSと細胞懸濁液を引き出し、すべての液体を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに分配します。
セルを摂氏4度で7、500倍に3分間回転させます。細胞ペレットを残してPBSを吸引する。細胞ペレットは、処理までマイナス80°Cで保存することができます。
タンパク質を抽出するには、1Xリシスバッファーの100マイクロリットルを二重蒸留水で希釈して調製します。1 ミリモルの最終濃度に使用する直前に PMSF を追加します。.その後、細胞ペレットに直接1Xライシスバッファーの50マイクロリットルを追加し、再中断します。
抽出物を氷の上で5分間インキュベートします。氷上の抽出物を保つ40%で定パルスモードを使用して8秒間超音波処理します。抽出物を摂氏4度、16,000倍gで5分間回転させます。
ブラッドフォード分析を行い、必要に応じてタンパク質濃度を決定します。試料を調製するために、可溶性タンパク質抽出物の10マイクロリットルを取り、1XレムリSDSサンプルバッファーの10マイクロリットルを加える。サンプルを氷の上に置いておきなさい。
ゲルを動かす前に、サンプルを摂氏85度で5分間加熱します。ホルムアルデヒド架橋を開始するには、U-2 OS細胞を175平方センチメートルのフラスコで70〜80%のコンフルエンシーに成長させます。ヒュームフードでは、ホルムアルデヒド固定剤を培地に直接加えて、最終濃度の1%にし、室温で15分間穏やかな攪拌でインキュベートします。
反応を焼くために、0.125モルの最終濃度に1.25モルグリシンを加え、5分間ロッカーに穏やかな攪拌で室温でインキュベートします。冷たいPBSの5ミリリットルで細胞を3回洗います。最終的なPBS洗浄液を吸引し、PBSを10ミリリットル加えます。
セルスクレーパーを使用してフラスコの底部から細胞を削り取ります。10ミリリットルのピペットを使用して、PBSと細胞懸濁液を引き出し、すべての液体を15ミリリットルの円錐形遠心分離管に分配します。500倍gと摂氏4度で細胞を2分間回転させます。
細胞ペレットを残してPBSを吸引する。0.25モルスクロース、1ミリモルEDTA、10ミリモルHEPES、pH 7.4で0.5%BSAを加えて均質化バッファーの10ミリリットルを調製します。使用直前に、1ミリモルの最終濃度と核懸濁液の3ミリリットルにPMSFを加える。
5ミリリットルの均質化バッファーを細胞ペレットに直接加え、完全に再中断します。サスペンションを500g、摂氏4度で2分間遠心分離する。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを5ミリリットルの均質化バッファーに再懸濁します。
その後、タイトなフィッティングガラスでテフロンホモジナイザーは、500 RPMあたり10ストロークで細胞を均質化し、10分間1、500グラム、摂氏4度で懸濁液を遠心分離します。遠心後上清を捨てる。ペレットを核懸濁液の1ミリリットルに再懸濁し、氷の上で10分間インキュベートする。
インキュベーション後、600回gで遠心分離機を10分間行う。遠心分離後、上清を捨てて、再度核懸濁液と遠心分離機の1ミリリットルにペレットを再懸濁する。最終的なペレットは、単離された核になります。
1Xリシスバッファーの 25 マイクロリットルを細胞ペレットに直接添加する前に説明したとおりにタンパク質を抽出します。次に、可溶性タンパク質抽出物をそれぞれ10マイクロリットルずつ採取してSDS PAGE用に2サンプルを調製し、10マイクロリットルの2X Laemmli SDSサンプルバッファーと1マイクロリットルのBMEを追加します。1サンプルを摂氏37度で5分間加熱し、2番目のサンプルを摂氏98度で15分間加熱してホルムアルデヒドのクロスリンクを逆にします。
25ミリモルトリス、192ミリモルグリシン、体積SDあたり0.1%重量を混合して、1Xトリスグリシンランニングバッファーの1リットルを準備します。次に、SDS PAGE 実行装置をセットアップします。メーカーのプロトコルに従って16%プレキャストTGX SDS-PAGEパッケージを開き、カセットを取り外します。カセットの底部から井戸とテープを裏打ちしている櫛を取り外し、ゲルを実行装置に入れる。
ウェルが液体に沈むまで、1Xランニングバッファでチャンバーを満たします。プラスチックピペットを使用して、ランニングバッファで井戸をすすいでください。サンプルを、染色済みの標準マーカーの10マイクロリットルと一緒にゲルにロードします。
最後に、染料の前面がゲルの底部から約1センチメートルになるまで200ボルトでゲルを実行します。BME還元剤の不存在下における全細胞抽出物のウェスタンブロット分析は、異なるヒト細胞集団における多量体複合体形成を示した。この複合体は、調べた4つの細胞株すべてにBMEを添加して消失し、ジスルフィド結合の存在を示す。
収穫時のヒト細胞におけるdUTPaseの単量体確認は、dUTPaseの少なくとも3つのアイソフォームの組み合わせである:ミトコンドリアアイソフォーム、核アイソフォーム、およびM24で指摘された切り捨てられたバージョンである。対照として用いたミトコンドリアアイソフォームは、ジスルフィド結合体を形成せず、単量体タンパク質の予測分子量に移行した。核dUTPaseのホルムアルデヒド架橋は多量体錯形成を示した。
95°Cでサンプルを15分間インキュベートしてクロスリンクを逆転させると、複合体は不安定になり、単量体状態で視覚化することができました。ヨドアセトアミドを添加することは、遊離システイン残基をブロックし、ジスルフィド結合が抽出手順の結果ではないことを保証するために、この手順の重要なステップである。サンプルに存在するジスルフィドリンケージが減少するため、BMEやDDTなどの還元剤をSDS-PAGEサンプルに追加しないことを覚えておくことが重要です。
