この方法は、細菌遺伝子発現の空間パターンと、組織中の全集団にわたって平均化すると失われる組織微小環境をホストする生理学的適応のための戦略を明らかにすることができる。この技術を用いて、抗毒性または抗菌化合物によって標的とされる新しい細菌経路およびタンパク質を同定する際に考慮しなければならない潜在的な不均一性を検出することができる。まず、凍結したグリセロールストックから血液寒天プレートに関心のあるS.aureus株をストリークし、16〜24時間摂氏37度でプレートをインキュベートし、赤血球をライスする能力に基づいて血解性の異型を確認し、透明な領域を形成することから始めます。
滅菌ガラス管中のトリプティック大豆ブロス(TSB)の4ミリリットルで各株の単一コロニー分離株を接種し、チューブローラーで16〜24時間37°Cでチューブを約70度の角度と毎分70回転で回転させます。翌朝、分光光度計上の培養物の光学密度を600ナノメートル(OD 600)で測定し、125ミリリットルのデロンフラスコで5~1フラスコの体積比で25ミリリットルの無菌TSBのOD 600に希釈します。1分あたり280回転で37°Cの水浴で培養物をインキュベートし、指数相の間に細胞を収穫する。
遠心分離によって細胞をペレット化し、滅菌PBSの等量で細胞を2回洗浄する。次いで、新鮮なPBS中の細胞を、レシピエント動物へのその後の注射のためにミリリットル濃度当たりの8番目のコロニー形成単位に10回再懸濁する。適切な実験終点で、腎臓、心臓、肝臓、肺、脾臓を15ミリリットルのポリプロピレンチューブに収穫し、10%緩衝ホルマリンを含む15ミリリットルのホルマリンを暗所で24〜48時間の静かな揺れまたは回転で収穫する。
固定の終わりに、マイナス80°Cで貯蔵するために透明な組織凍結培地に器官を埋め込む。クライオスタットを使用して、厚さ10マイクロメートルの組織切片を取得し、個別のプリクリーニングされた充電ガラススライドのセクションを暗闇の中で20分間乾燥させてから、DAPIを添加したハードマウント媒体を塗布します。その後、カバースリップを適用し、摂氏4度で長期保存にサンプルを転送する前に、一晩室温でスライドを治します。
サンプル内の病変を識別するには、レーザー走査共焦点顕微鏡のステージ上にスライドを配置し、個々の細胞を可視化して病変の画像を取得するための適切な目的を使用します。共焦点画像内の蛍光強度を測定するには、ImageJで画像を開き、明るさとコントラストを調整して、病変の蛍光信号を適切に可視化します。ポリゴン選択ツールを使用して対象地域を定義し、ImageJ の [編集] タブの ROI マネージャに ROI を追加します。
[編集]、[選択]の順に選択し、最後に [マネージャに追加] を選択します。次に、ROI の名前を変更し、それぞれの画像にラベルを付けます。中心心を定義するには、[解析]タブを開き、[面積]、[平均グレー値]、[心数]、[しきい値に制限]を選択します。
中心の蛍光強度値を抽出するか、単位面積当たりの与えられた病変における平均蛍光強度を測定します。これは、しきい値関数を使用して、必要に応じて蛍光の下限と上限を設定することによって達成することができる。データを Excel ファイルにエクスポートし、周辺とコアの単位面積あたりの平均蛍光強度を示す列を準備します。
周囲およびコアの単位面積あたりの平均蛍光強度を計算するには、しきい値の上限と下限を手動で定義する。黄色ブドウ球菌のサーキュレウスサーヌクレアーゼGFP融合蛍光は、レポーター融合を担っていない細胞よりも、融合遺伝子を担持する細胞において平均9倍近く高い。同様に、タンデムジメリックトマト融合蛍光は、ヌルレポーターコントロールより約6倍高い。
レポーター活動のパターンは、組織ホモジメートを有するフローサイトメトリーによって確認することができる。蛍光の折り目差は典型的には低い。蛍光測定の変動は、レポーターの異種発現に起因する可能性がある。
例えば、これらの代表的なサンプルでは、一部の病変が同じ組織サンプル内の約100マイクロメートルの距離内で一方または両方のレポーターを発現することが観察された。スタフィロコッカルabcess群集における単一細胞分解能に対するレポーター活性を調べると、強いDAPI染色を伴う膿瘍におけるブドウ球菌のサーヌクレアーゼ発現の空間調節が明らかにされ、好中球外細胞トラップの形成および放出に関連している可能性が高い。例えば、ブドウ球菌の黄色ブドウ球菌の熱ヌクレアーゼGFP融合は、周囲に局在するのと比較して、ブドウ球菌のabcess群の内部コアにおいて有意に高く観察される。
同じabcessでは、タンデムジメリックトマト融合蛍光のパターンは反転しているように見える。しかし、この実験のパターンは統計的に有意ではなかった。蛍光画像解析には、完全な凍結埋め込み解剖を得ることが不可欠であり、慎重に行う必要があります。
RNA-Seq分析と相まって、様々な範囲に融合を発現する亜集団を捕捉するための細菌細胞の選別は、トランスクリプトームのゲノム全体の変化を照らすことができる。ホルマリンは発がん性物質であり、直接暴露時に皮膚刺激、アレルギー反応、または眼の損傷を引き起こす可能性があるため、ホルマリンを扱う際には注意してください。目的の蛍光レポーターを運ぶ株の変異型誘導体を生成することは、観察された空間調節パターンの遺伝的根拠を明らかにするのに役立つ。
