我々 は研究成長イニシアチブ (賞号 X 340 101)、全米科学財団、主要なインストルメンテーション研究グラント号からの財政支援を認めるPHY-1626450)、大きいミルウォーキー財団 (ショウ賞) とウィスコンシン大学システム (応用研究グラント)。

1. 試薬液の調製法
<ol><li>[トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタンを 20 mM と 150 mM の NaCl、pH 7.4] Tris バッファーを使用して、目的の濃度に興味の蛋白質を溶解/希釈開始タンパク質溶液を準備します。 注: ヒドロゲルに架橋つながる最小のタンパク質濃度使用されるタンパク質に依存しては通常 > 1 mM。</li>
	<li>過硫酸アンモニウム (AP) (1 M) の株式と tris(bipyridine)ruthenium(II) 塩化準備 ([Ru(bpy)3]2 +) APS を溶解することにより (6.67 mM) ソリューション及び Tris バッファー [Ru(bpy)3]2 +粉末。</li>
</ol>2. タンパク質ベース ハイドロゲル合成
<ol><li>1 mL 注射器に押されたプランジャーで 23 G 針を固定します。</li>
	<li>かみそりの刃を使用して (で 0.022 の内径と外径の 0.044) 10 cm ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) チューブをカットします。PTFE チューブの一方の端に、針と注射器を接続します。</li>
	<li>しらん溶液にチューブの 2 番目の端を挿入し、シリンジのプランジャーを取り消しによって管を入力します。30 分程度の管を残します。</li>
	<li>シランのソリューションを削除し、圧縮空気管を乾燥します。 注: シラン ソリューションのすべてが乾燥していることと、管内残留物は残っていないことを確認します。</li>
	<li>APS と [Ru (bpy) 3] タンパク質溶液を混ぜる2 +定体積比を用いた 1.5 mL チューブに [例えば15:1:1 または 15:0.5:0.5 (v: v: v)]。</li>
	<li>渦光ソリューション完全に混ぜ合わせます。</li>
	<li>(例えば、14,000 x g) 任意の気泡をソリューションから削除する最大速度でミックスを遠心します。</li>
	<li>光の混合物に処理 PTFE チューブの開放端を挿入し、シリンジのプランジャーを入れ込んでチューブにソリューションを描画します。</li>
	<li>ロード チューブ加熱することを防ぎ、室温 (図 1 b) で最大 30 分のそこにそれを維持する 100 W 水銀ランプから 〜 10 cm を配置します。 注: 場合によっては、光を露光時間が退色を抑える、蛍光ゲルのゲル化時間の短縮を聡に 30 がここで使用される低ですることができます。</li>
	<li>針からチューブを外し、かみそりの刃を持つハイドロゲル端に近くの管の端をカットします。</li>
	<li>鈍化 24 G 針を使用してトリスのソリューション (図 1) に、ハイドロゲルを押し出します。 注: 鈍い針、ハイドロゲルのサンプルに損害任意のノッチを避けるために使用されます。</li>
	<li>押し出し中または気泡によるを形成し欠陥をもつゲルを破棄可能性があります欠陥のゲルを目視で確認します。</li>
</ol>3. タンパク質ベース ハイドロゲル添付ファイルとクランプ力レオメータ セットアップ
<ol><li>計測器制御プログラムを開始します。ボイスコイル モーターをオンにします。コイル位置を (例えば、7.5 mm) の範囲の終わりの方の値に設定します。 注: 最大移動範囲、ヒドロゲルへの可能な拡張を最大限の終わりの方には、ボイスコイルの位置の使用をお勧めします。</li>
	<li>Zのフックを転置-方向、 xでベンドでそれらを揃える-の方向 (引き座標;図 2 bを参照してください)。X用マイクロ メーターねじの値を記録-方向。</li>
	<li>等しい長さの鎖に 2 滅菌縫合糸を切る (2-3 cm である;図 3 aとBを参照してください)。</li>
	<li>各鎖に緩いダブルオーバーハンド ノットを結ぶ、力センサー (図 3および3 D) に接続されているフックに 2 ループ。</li>
	<li>Tris バッファーで実験室を埋めるし、医療ピンセットを使用して塗りつぶされた室にゲルのサンプルを転送します。</li>
	<li>ボイスコイルを配置、溶液表面に近いセンサー フックを力およびxを使用してすべての方向にフックを配置/y/z-マニピュレーターを配置します。</li>
	<li>医療ピンセット、ハング声に接続されているフックに蛋白質ゲルのサンプルの両側コイルし、強制的にセンサー (図 3) を使用します。</li>
	<li>医療ピンセットで縫合糸ループの両端を持ち、同時にそれらを引いて 1 縫合音声コイル フック ハイドロゲル サンプル ループを締めます (図 3 D)。</li>
	<li>ループの繰り返し手順 3.8 は力センサー (図 3 D) に接続します。 注: は、構造上の損傷およびハイドロゲル サンプルの横の切断を防ぐために縫合糸の極端な締め付けを避けてください。</li>
	<li>任意のすべりを防ぐために各フックのベンドに縫合糸のループを締め3.2 でフックのゼロの区別を見つけるに参照としてこれらのベンド ポイント使用。医療はさみ (図 3 D) を使用して縫合の余分な長さをカットします。</li>
	<li>Zを使用してアタッチされたハイドロゲルを移動- zに沿ってマニピュレーター-実験的ソリューションでゲルを浸す実験室に向かって軸。</li>
	<li>Y-zマニピュレーターを使用してゲルがない任意の応力下におけるゲル サンプルを合わせます。</li>
	<li>力センサーをゼロし、 xを使用して 2 つのフックを独立した-マイクロメータ ゲルを開始力を経験するまでの段階します。Xマイクロ メートルねじ少し引き返すいったんこれが起こる、-方向。</li>
	<li>ボイスコイル モーターとセンサーの両方のマニピュレーターの位置を記録し、これらの値と 3.2 の手順で測定したものの違いを使用して正確な実験の開始時にテザリング フック間隔を計算します。</li>
	<li>~1.5 - 2 mm に余裕の曲線の範囲を設定し、ゲルの余裕期間 (図 4 a) を測定します。 注: スラック測定ごとに 2 体制 (図 4 a) に合わせて最適なデータ ポイント数、初期ボイス コイル位置近く余裕の政体の開始を維持してください。ゲルの長さはフックとたるみで 2 政体の間の交差点の間の分離を使用してミクロンの解像度で判断できます (また見なさいステップ 5.1) のカーブします。力センサー実験条件の変化のための時間のズレと下にないゲル余裕の曲線の一部はこの可能なドリフトのレポートを強制します。PID ループ (図 4 a差込み) にセット ポイント コマンドを送信するとき、計測器を制御するプログラムはこの違いを自動的に補正します。</li>
</ol>4. 蛋白質ベース ハイドロゲル特性定数力測定と制御力ランプを使用して
<ol><li>
力ランプ実験
	<ol>
<li>力ランプ サイクルを実行すると、必要な読み込み速度 (例えば、0.01 mN/秒) に力を高めることによって、反転"V"として開始し、最終的な勢力とプロトコルの期間を入力します。その後、フォールディングとゲルの弾力性を回復するタンパク質のドメインを許可する > 200 s mN (または低力) 0 でゲルを保持します。</li>
		<li>トレースを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
定数力実験
	<ol>
<li>一定の力 (例えば、 1 マンガン) に時間の定義された量の 30 s と増加し、力の低い力 (例えば、0.1 mN) を適用することで定数力プロトコルを実行 (例えば120 s)、続いて同じに戻る力を低焼入> 300 s フォールディングとゲルの弾力性を回復するタンパク質のドメインを許可するため (例えば、0.1 mN) の値。</li>
		<li>フィードバックの応答時間を最大化する PID 設定を調整する最初のパルスに続くループ ( 2 D 図を参照してください)。 注: 硬いゲルおよび力の小さな変化、ループの応答時間は力センサーの電子とコイルの応答時間によって制限されます、5 ms7低くすることができます。柔らかいゲルおよび力の大きな変化は、応答時間、(図 2 D) ゲルの弾力性によって決まります。</li>
		<li>トレースを保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. データの解析
<ol><li>ゲルの起動時に発生する力 (Δx 4 a を図の挿入)、ゲルの長さLの方程式を使って計算する、計算されるコイル位置とフックの間測定の分離を利用しました。 L = L0 + ∆x ここでは、 L0は実験 (ステップ 3.14) の前にマイクロメータねじの位置から測定、フック間の距離です。 注: 完全な架橋が発生しない低蛋白濃度のゲル、測定長さはトレースするから変更されます。また、時間の長い期間にわたってハイドロゲル中のタンパク質があります老化効果25ゲルの全体的な延長の結果になります。</li>
	<li>ひずみを取得するゲルの長さ測定の延長を正規化します。</li>
	<li>重合用チューブの内径を用いたトランスバーサル表面積測定力を正常化します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cao, Y., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+chemical+denaturants+affect+the+mechanical+folding+and+unfolding+of+proteins?.">How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).</li><li>Carrion-Vazquez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+chemical+unfolding+of+a+single+protein:+a+comparison.">Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).</li><li>Wiita, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+chemistry+of+thioredoxin+catalysis+with+force.">Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force.</a> Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Plumere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+redox+hydrogel+protects+hydrogenase+from+high-potential+deactivation+and+oxygen+damage.">A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage.</a> Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).</li><li>Kong, N., Peng, Q., Li, H. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+hydrogels+crosslinked+solely+by+receptor-ligand+interactions:+tunability,+rationalization+of+physical+properties,+and+3D+cell+culture.">Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture.</a> Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).</li><li>Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+behaviour+of+hydrogel-based+composites+for+tissue+engineering+under+mechanical+load.">Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load.</a> Biomedical Materials. 12 (2), (2017).</li><li>Desai, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-point+parallel+disk+correction+for+asymptotically+nonlinear+oscillatory+shear.">Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear.</a> Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).</li><li>Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+proteins+under+force.">Multidomain proteins under force.</a> Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).</li><li>Valle-Orero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Deformation+Accelerates+Protein+Ageing.">Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).</li><li>Fang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+protein+unfolding+leads+to+highly+elastic+and+tough+protein+hydrogels.">Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li><li>Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinks+for+3D+bioprinting:+an+overview.">Bioinks for 3D bioprinting: an overview.</a> Biomaterial Science. , (2018).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで、低ボリューム蛋白質ベースのゲルの力学的応答特性を調査する力クランプ ワイヤ手法について述べる。また、制服の円筒低ボリューム蛋白質ゲルのサンプルを合成するプロトコルが提供されます。フックで任意の力学的変形または蛋白質ベースのゲルのサンプルやゲルの滑りの損傷を引き起こすことがなく各種の弾力性と蛋白質ベースのゲルの種類の結び方を記述するプロトコルに...

独特な物理的性質を持っていることから離れて蛋白質ベースのゲルは、従って混雑した環境で、タンパク質の研究を有効にする 1 つの '引き' でいくつかの億分子の測定を有効にすることによって力分光法を革命の約束を保持します。皮膚や他の組織に発生したものに似ています。タンパク質ドメインがパートナーとの化学的条件のバインドを強制的に、彼らの生体力学的応答の研究を許可するハイドロゲル内折れ曲がったまま。さらに、ゲル内のタンパク質ドメインの生体力学的応答分子力の分光学の技術を見られる応答に似ています。たとえば、化学変性剤と酸化剤を小さくたたんだ状態、単一のタンパク質ドメイン レベル1,2,3と巨視的レベル4、5の両方の安定性,6,7します。 同様に、浸透圧物質が単一タンパク質8,9、同じ力の条件7,10のゲルの粘弾性応答の減少につながるの安定性を高めます。
いくつかのアプローチは蛋白質ベースのゲルを合成するいずれかによって実装されている物理的相互作用11,12または共有結合性の架橋4,13を使用しています。共有結合反応固定架橋位置を可能にする、これらのゲルは、機械的又は化学的摂動の除去時に初期状態を回復できます。共有結合性の架橋に成功したアプローチは、イニシエーター (図 1)14としてルテニウム (II) 塩、酸化剤として過硫酸アンモニウム (AP) を使用して公開されるチロシンのアミノ酸間の共有結合の炭素-炭素結合を形成に依存します。白色光を浴びること、集中の蛋白質の解決はハイドロゲルに変換できます。制御することによって反応開始、タンパク質-APS ミックスはどんなキャスティング フォームに注入できますポリテトラフルオロ エチレン (PFTE) など管 (図 1 bと1 C) を使用できます非常に小規模のソリューション ボリューム15。さらに、白色光架橋反応を誘発するの使用は蛍光タンパク質の限られた漂白の結果し、蛍光マーカー (図 1) と複合ゲルの定式化をできます。その他タンパク質ハイドロゲル形成方法は、SpyTag SpyCatcher 作用16、アミン架橋経由グルタルアルデヒド13、またはビオチン ストレプトアビジン相互作用17に基づく架橋を使用します。
動的機械分析 (DMA) は現在広く高分子ヒドロゲル13,18を研究に使用される手法です。DMA は、生体に一定の力プロトコルを適用できますが、10 kPa と以上 200 μ L19の大規模なサンプル ボリューム上のヤング係数が必要です。これらの制限によりタンパク質ハイドロゲルは、一般的にこの手法によって調査されるには柔らかすぎます。設計されたコロナ リビング システムを生成が必要なため、ポリマーよりも合成するは難しいと、このような高ボリューム、ベスト4,15で効率的。さらに、ほとんどの生体組織は 10 kPa より柔らかいです。いくつかのアプローチは、筋肉の弾力性20,21の研究では特に、生体試料の開発されました。これらの技術は一定外力を適用するフィードバックの下で動作することができますもが非常に短い時間のための力にさらされている (ミクロン) の小径のサンプル用に最適化された (通常より 1 秒)。
蛋白質ベースのゲルを変更したワイヤを用いて正常に調べた。たとえば、ヒドロゲルを鋳造リング形状の拡張4,22の関数として経験を積んだ力の変化を測定する伸張のワイヤの使用をことができます。蛋白質ベースのゲルのレオロジー特性を研究するための他のアプローチは、せん断応力を制御ワイヤを使用します。これらの技術は低いサンプル ボリュームを達成し、ソフトマテリアルを容認できます。しかし、その原因タンパク質アンフォールディング生体内で、強制的にこれらのメソッドの欠如引きを模倣する能力、ヤング率は、さまざまな仮定や修正23を必要とする複雑な理論に基づいて計算されます。
中径管重合タンパク質の少量を利用した新しいアプローチを行ってきた最近 < 1 mm。この技術の私達の最初の実装目的のプロトコル15次ゲルを伸ばした長さクランプ モードで動作していた。この方法で蛋白質作りを体験拡張および力の両方の連続的な変更ドメインを展開、一方データ解釈面倒。最近では、我々 はフィード バック ループが定義済み力プロトコル7 (図 2) に少量の蛋白質ゲルを公開できる新しい力クランプ ワイヤ技術を報告しています。アナログ PID システムはコンピューターから送信セット ポイントと力センサーを用いて力を比較し、2 つの入力の差を最小限に抑えるためにボイスコイルを動かすことによってゲル拡張子を調整します。力のこの '固定' 蛋白質ゲルのバイオメカニクスを測定する実験の新しい種類今できます。
力ランプ モードで係留タンパク質ハイドロゲルは、定数の増加と時間の力の減少を経験します。PID は、タンパク質とゲル製剤の種類によって、非線形の方法で拡張子を変更する任意の粘弾性変形を補正します。力のランプの主な利点は、ヤング率と、展開とタンパク質ドメインの巻き戻しのためのエネルギー散逸などの標準的なパラメーターの定量化できます。
定数強制モードで応用力を段階的な方法で変更します。このモードでゲルは伸びると弾性力が増加または減少し、それぞれになると契約、時間依存型変形が続きます。ゲル経験一定力時に行われ、この粘弾性変形はドメインの展開/折りたたみを直結します。簡略化された方法でこの拡張機能は、十億の単一分子トレース一緒に平均化され、すべてを一度に測定はいくつかの等価なものとして見なすことができます。クリープと力と時間の関数として蛋白質ゲルの緩和を検討する定数力プロトコルを使用できます。BSA を用いたタンパク質ゲルのための力の関数として弾性および粘弾性の拡張と適用ひずみ7の反動の線形依存関係があることを最近示しました。
ここでは、全体的なハイドロゲルを蛍光簡単に L 蛋白質の混合物 (8 ドメイン24L8として描かれている) とタンパク質 L eGFP コンストラクト (L eGFP) から作られた複合ゲルを使用して力クランプ レオメータの操作を詳細します。示してください。

<table><tbody><tr><td>SI-KG4A force transducer</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SI-KG4A</td><td></td></tr><tr><td>Linear Voice Coil Motor</td><td>Equipement Solutions</td><td>LFA2010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)</td><td>BSA-AAF-1XG / 100 G</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>248614-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544981-1G</td><td></td></tr><tr><td>EXPRESS MEDICAL SUPPLIES&amp;nbsp;6-0 NYLON SUTURE 12/PK</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0395626</td><td></td></tr><tr><td>1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Silane, Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&quot;ID x 0.042&quot;OD, 100 ft/roll</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic Needle, 23 Gauge</td><td>Healthcare Supply Pros</td><td>305194</td><td></td></tr><tr><td>Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge</td><td>KIMCO</td><td>JG24-1.5X</td><td></td></tr><tr><td>USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp</td><td>ALB</td><td>USH-103D USHIO</td><td></td></tr><tr><td>Medical Tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

force-clamp rheometry for characterizing protein-based hydrogels

ここでは、力クランプ ワイヤは、蛋白質ベースのゲルの力学的特性を特徴付ける方法をについて説明します。このメソッドでは、アナログの比例・積分・微分 (PID) システムを使用して、線形ボイスコイル モーターと力覚セン繋留円筒蛋白質ベースのゲルのサンプルの制御プロトコルを適用します。操作中には、PID システムは、測定とセット ポイントとの間の違いを最小限に抑えることによって、定義済みプロトコルに従うハイドロゲル サンプルの拡張機能を調整します。蛋白質ベースのゲルにこのユニークなアプローチは、異なるタンパク質濃度で非常に低いボリューム ハイドロゲル サンプル (< 5 μ L) のテザリング可能。 にします。力ランプ プロトコル、どこ、応力は増加し、時間とともに直線的に減少、下でシステムにより、タンパク質と標準的な弾性の測定 (国連) 折り畳みに関連する弾力性とヒステリシス動作の研究、粘弾性パラメーター。定数力、力パルスがステップのような形、弾性応答のため力の変化には、変性と巻き戻り蛋白質ドメインからなる粘弾性応答から分離されて。少量サンプルなど様々 な力学的摂動の適用の多様性により力クランプ ワイヤは一括アプローチを使用して力の下で蛋白質の力学的応答を調査に最適です。

図 1 aは、EGP/L8ハイドロゲルを合成するために使用光反応のスキームを示しています。図 1 bは、光の前後に PTFE チューブのヒドロゲル混合物を示しています。トリス ソリューション内の押出 L eGFP8ハイドロゲルを図 1に示します。ハイドロゲルのサンプルには、ノッチなど構造上の欠?...

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Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

蛋白質ベースのゲルを特徴付けるため力クランプ ワイヤ

新しい力クランプ ワイヤ技術を使用して、ボイスコイル モーターと力センサーの間の連結台数の少ないタンパク質ハイドロゲル サンプルの機械的性質を調査します。アナログ比例・積分・微分 (PID) システムは、目的のプロトコルを経験の力の '固定' のことができます。

Here, we describe a force-clamp rheometry method to characterize the biomechanical properties of protein-based hydrogels. This method uses an analog ...

force-clamp-rheometry-for-characterizing-protein-based-hydrogels

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Engineering

6.9K ビュー.  University of Wisconsin-Milwaukee. 新しい力クランプ ワイヤ技術を使用して、ボイスコイル モーターと力センサーの間の連結台数の少ないタンパク質ハイドロゲル サンプルの機械的性質を調査します。アナログ比例・積分・微分 (PID) システムは、目的のプロトコルを経験の力の '固定' のことができます。

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

生物工学

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

生化学

Combining Microfluidics and Microrheology to Determine Rheological Properties of Soft Matter during Repeated Phase Transitions

The microstructure of soft matter directly impacts macroscopic rheological properties and can be changed by factors including colloidal rearrangement during previous phase changes and applied shear. To determine the extent of these changes, we have developed a microfluidic device that enables repeated phase transitions induced by exchange of the surrounding fluid and microrheological characterization while limiting shear on the sample. This technique is &#181;2rheology, the combination of microfluidics and microrheology. The microfluidic device is a two-layer design with symmetric inlet streams entering a sample chamber that traps the gel sample in place during fluid exchange. Suction can be applied far away from the sample chamber to pull fluids into the sample chamber. Material rheological properties are characterized using multiple particle tracking microrheology (MPT). In MPT, fluorescent probe particles are embedded into the material and the Brownian motion of the probes is recorded using video microscopy. The movement of the particles is tracked and the mean-squared displacement (MSD) is calculated. The MSD is related to macroscopic rheological properties, using the Generalized Stokes-Einstein Relation. The phase of the material is identified by comparison to the critical relaxation exponent, determined using time-cure superposition. Measurements of a fibrous colloidal gel illustrate the utility of the technique. This gel has a delicate structure that can be irreversibly changed when shear is applied. &#181;2rheology data shows that the material repeatedly equilibrates to the same rheological properties after each phase transition, indicating that phase transitions do not play a role in microstructural changes. To determine the role of shear, samples can be sheared prior to injection into our microfluidic device. &#181;2rheology is a widely applicable technique for the characterization of soft matter enabling the determination of rheological properties of delicate microstructures in a single sample during phase transitions in response to repeated changes in the surrounding environmental conditions.

We demonstrate the fabrication and use of a microfluidic device that enables multiple particle tracking microrheology measurements to study the rheological effects of repeated phase transitions on soft matter.

繰り返し相転移の間に柔らかい物質のレオロジー的性質を決定するためのマイクロ流体システムとレオロジーを組み合わせること

The microstructure of soft matter directly impacts macroscopic rheological properties and can be changed by factors including colloidal rearrangement ...

工学

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of the data and determines which properties of the film can be quantified. The quartz crystal microbalance offers a uniquely sensitive platform for measuring fine changes in mass and/or mechanical properties of an applied film by observing the changes in mechanical resonance of a quartz crystal oscillating at high frequency. The advantages of this approach include its experimental versatility, ability to study changes in properties over a wide range of experimental time lengths, and the use of small sample sizes. We demonstrate that, based on the thickness and shear modulus of the layer deposited on the sensor, we can acquire different information from the material. Here, this concept is specifically exploited to display experimental parameters resulting in mass and viscoelastic calculations of adsorbed collagen on gold and polyelectrolyte complexes during swelling as a function of salt concentration.

The quartz crystal microbalance can provide accurate mass and viscoelastic properties for films in the micron or submicron range, which is relevant for investigations in biomedical and environmental sensing, coatings, and polymer science. The sample thickness influences which information can be obtained from the material in contact with the sensor.

タンパク質吸着とポリマー力学の石英結晶マイクロバランス測定におけるサンプル調製

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...

化学

Macro-Rheology Characterization of Gill Raker Mucus in the Silver Carp, Hypophthalmichthys molitrix

The silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, is an invasive planktivorous filter feeder fish that infested the natural waterways of the upper Mississippi River basin due to its highly efficient filter feeding mechanism. The characteristic organs called gill rakers (GRs), found in many such filter feeders, facilitate the efficient filtration of food particles such as phytoplankton that are of a few microns in size.
The motivation to investigate the rheology of the GR mucus stems from our desire to understand its role in aiding the filter feeding process in the silver carp. The mucus-rich fluid, in a &#8216;thick and sticky&#8217; state may facilitate the adhesion of food particulates. The permeation and transport through the GR membrane are&#160;facilitated by the action of external shear forces that induce varying shear strain rates. Therefore, mucus rheology can provide a vital clue to the tremendous outcompeting nature of the silver carp within the pool of filter feeding fish. Based on this it was posited that GR mucus may provide an adhesive function to food particles and act as a transport vehicle to assist in the filter feeding process.
The main objective of the protocol is to determine the yield stress of the mucus, attributed to the minimum shear stress required to initiate flow at which irreversible plastic deformation is first observed across a structured viscoelastic material. Accordingly, rheological properties of the GR mucus, i.e., viscosity, storage, and loss moduli, were investigated for its non-Newtonian, shear-thinning nature using a rotational rheometer. &#160;
A protocol presented here is employed to analyze the rheological properties of mucus extracted from the gill rakers of a silver carp, fished at Hart Creek location of the Missouri River. The protocol aims to develop an effective strategy for rheological testing and material characterization of mucus assumed to be a structured viscoelastic material.

Macro-Rheology Characterization of Gill Raker Mucus in the Silver Carp, Hypophthalmichthys molitrix

This protocol presents a method to perform rheology characterization of mucus that resides on gill rakers (GRs) of the silver carp. Viscoelastic characteristics of GR-mucus, obtained by measuring viscosity, storage and loss moduli, are evaluated for the apparent yield stress to understand the filter feeding mechanism in GRs.

銀の鯉、眼圧軟化モリクスにおけるギル・レイカー粘液のマクロ・レオロジー特性

The silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, is an invasive planktivorous filter feeder fish that infested the natural waterways of the upper Mississippi ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

治療用途のためのツールとしてのRGD官能ヒドロゲルの合成

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

セミフレキシブル高分子を研究する多目的ツールとして DNA ナノチューブ

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

神経科学

<meta charset="utf8"></head><body> ペプチドハイドロゲル:ECF-5の環境応答性ゲル化法

Preparation of Mechanically Stable Self-Assembled Peptides Hydrogels

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking networks. Their morphology closely resembles that of the extracellular matrix, allowing them to exhibit both the biological functions of peptides and responsive gelation properties. These unique characteristics have led to their extensive application in tissue engineering, three-dimensional cell culture, cancer therapy, regenerative medicine, and other biomedical fields. This article describes three methods for preparing ECF-5 peptide hydrogels using self-assembling peptides with environmentally responsive gelation processes: (1) pH-responsive gelation: varying pH levels induce the protonation or deprotonation of amino acid residues, altering electrostatic interactions between peptide molecules and promoting their self-assembly into hydrogels; (2) Metal ion addition: polyvalent metal ions chelate with negatively charged amino acid residues, acting as bridges between peptides to form a network hydrogel; (3) Solvent exchange: hydrophobic peptides are initially dissolved in non-polar organic solvents and subsequently induce self-assembly into hydrogels upon transitioning to a polar aqueous environment. These methods utilize conventional experimental procedures to facilitate peptide self-assembly into hydrogels. By designing peptide sequences to align with specific gelation-inducing conditions, it is possible to achieve finely tuned micro/nanostructures and biological functions, highlighting the significant potential of peptide hydrogels in the biomedical domain.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:優れた生体適合性のための自己組織化繊維およびペプチドハイドロゲルの生産の改善

This protocol presents three fast and simple preparation methods that use environmental conditions to trigger the self-assembly of peptides into hydrogels. Additionally, the characterization of peptide hydrogels is described, demonstrating that mechanically stable peptide hydrogels can be formed under these straightforward conditions.

機械的に安定な自己組織化ペプチドハイドロゲルの調製

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking ...

蛋白質ベースのゲルを特徴付けるため力クランプワイヤ

要約

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細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

繰り返し相転移の間に柔らかい物質のレオロジー的性質を決定するためのマイクロ流体システムとレオロジーを組み合わせること

タンパク質吸着とポリマー力学の石英結晶マイクロバランス測定におけるサンプル調製

銀の鯉、眼圧軟化モリクスにおけるギル・レイカー粘液のマクロ・レオロジー特性

治療用途のためのツールとしてのRGD官能ヒドロゲルの合成

セミフレキシブル高分子を研究する多目的ツールとして DNA ナノチューブ

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

機械的に安定な自己組織化ペプチドハイドロゲルの調製

機械的に安定な自己組織化ペプチドハイドロゲルの調製

蛋白質ベースのゲルを特徴付けるため力クランプ ワイヤ

要約

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細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

繰り返し相転移の間に柔らかい物質のレオロジー的性質を決定するためのマイクロ流体システムとレオロジーを組み合わせること

タンパク質吸着とポリマー力学の石英結晶マイクロバランス測定におけるサンプル調製

銀の鯉、眼圧軟化モリクスにおけるギル・レイカー粘液のマクロ・レオロジー特性

治療用途のためのツールとしてのRGD官能ヒドロゲルの合成

セミフレキシブル高分子を研究する多目的ツールとして DNA ナノチューブ

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

機械的に安定な自己組織化ペプチドハイドロゲルの調製

機械的に安定な自己組織化ペプチドハイドロゲルの調製

蛋白質ベースのゲルを特徴付けるため力クランプワイヤ