このナノポアベースの検出方法は、個々の分子を物理的に特徴付け、同定する可能性を実証しています。このビデオの目的であるメタロナノ粒子を扱うことは、測定の精度と精度を制限するものの理解に挑戦しています。この技術の主な利点は、この装置が従来の脂質二重層記憶設定よりも広い帯域幅を有し、ナノポアでより速い結果とより多くの反応を見ることができるということです。
この技術は、1990年代初頭にタンパク質ナノポアの格子、すなわち異なる状態の切り替えが制御でき、分子が細孔壁に結合できることが示されたために可能になった。この技術は、最小限のサンプルを使用するため、商用のDNAシーケンシングアプリケーションのために開発されています。蛍光標識を必要とせず、従来の方法よりもはるかに長い読み取り長さを使用します。
この技術は、ゲル電気泳動やクロマトグラフィーよりも精度と速度を高く、そのサイズに基づいてポリマーを区別するためにも開発されています。まず、500ミリリットルの塩化ナトリウム1モルと10ミリモルのリン酸ナトリウムを電解質として超純水に調製します。この特定のセットアップで新鮮なソリューションとサンプルを使用するのが最善です。
また、膜の形成に成功するためには、高品質の脱イオン水が非常に重要であることがわかりました。次に、凍結乾燥した野生型モノメリックS.aureusアルファヘモリシン粉末の1ミリグラムを超純水1ミリリットルと組み合わせます。ステープルアウレウスアルファヘモリシン毒素タンパク質での作業は危険なことができますことを忘れないでください。
この手順を実行する場合は、MSDS の注意事項に従ってください。次に、ガラスシンチレーションバイアルでエンデカインに1ミリリットルDPhyPCあたり5ミリグラムの4ミリリットルを調製する。バイアルにポリテトラフルオロエチレンの裏地付きキャップをキャップし、最大1ヶ月間摂氏4度で保管します。
その後、57.6ミリグラムの12-ホスホタングスト酸水和物を電解質の10ミリリットルに溶解し、2ミリモルのポリオキソメタレート溶液を作ります。POM溶液を2つの5ミリリットルの部分に分けます。3モルの水酸化ナトリウムを使用して、1つのPOM溶液のpHを5.5に調整します。
試験の準備を始めるには、平坦な脂質二重層電気生理学装置の試験細胞を組み立てる。まず、銀線を600グリットサンドペーパーでブラドし、市販の次亜塩素酸ナトリウムベースの漂白剤に10分間浸し、塩化銀銀線電極を作ります。ワイヤ電極をリンスして乾かしてから、装置の石英毛管に挿入します。
電極を石英ナノポア膜(QNM)内に保管し、毛細管と貯留層を分離します。次に、リザーバーの銀線に取り付けられた円筒形の銀塩化銀ペレット電極を配置します。両方の電極をアンプ回路基板に接続します。
次に、データ収集プログラムを開き、ゼロミリボルトで電源を起動します。空のセルの電極間にDC電流が検出されないか確認します。このデモンストレーションでは、経キャピラリー圧が膜形成とその後のナノポア形成にどのような影響を与えるかを見ることが重要です。
この 2 つの手順を正しく実行しないと、実験は機能しません。約1ミリリットルの電解液をシリンジに積み込み、リザーバーに接続された流体ラインに接続します。増幅器を飽和させる電極間のイオン電流で示されるように、QNMの面が水没するまで、リザーバに電解質を加えます。
アンプが飽和しない場合は、プラスマイナス1ボルトのポップ電圧を印加するか、キャピラリー圧を約300ミリメートルの水銀で増加させることでQNMを詰まらせる。必要に応じて、両方の方法を使用します。アンプが飽和したら、電流がゼロに戻るように、溶液レベルがQNMを下回るまで、リザーバから電解液を引き出します。
脂質二重層形成プロセスを開始するには、電解液レベルをQNMの顔より上に上げ、どのくらいの溶液がかかったかを書き留めます。その後、DPHyPC溶液に10マイクロリットルピペットチップを浸し、すべての目に見える脂質を先端に引き込みます。ピペットの先端を電解液の表面に触れ、ピペットから空気水界面を流れるようにします。
脂質が溶液全体に均一に広がるのを2〜5分待ちます。次に、溶液の表面がQNMの下になるまで電解液をゆっくりと引き出し、その後、QNM上の溶液を上げて絶縁脂質二重膜を形成するのに十分な電解質をゆっくりと加える。二重層が3回試みた後に形成されない場合は、先に述べたように脂質の別の部分を適用し、プロセスを繰り返す。
二重層が形成されたように見えたら、毛細血管への圧力を高め、二重層をポップし、以前と同じように溶液レベルをゆっくりと下げて上げることによってそれを改革する。このプロセスを数回繰り返して、QNMが詰まらず、二重層が形成されていることを確認します。次に、氷上または室温でアルファヘモリシンタンパク質のアリコートを解凍する。
250ナノグラムの単量体アルファヘモリシンタンパク質と約250マイクロリットルの超純水で貯蔵所を満たします。次いで、200~400ミリボルトバイアスを適用して、細孔形成を誘導する。細孔の形成を容易にするために、毛細管圧を40〜200ミリメートルの水銀で増加させ、QNMから二重層を拡大する。
ナノポアが形成されたら、印加されたバイアスを測定電圧に減らし、圧力を挿入圧力の約半分に減らします。テストを開始するには、DCオフセット電圧を再調整して、印加電位がゼロに設定されている場合に測定電流がないことを確認します。次に、リザーバに対して120~マイナス120ミリボルトの適用電位に対するイオン電流トレースを取得する。
自発的な電流遮断によって示される汚染物質がないことを確認する。pH 5.5 2ミリモルPOMクラスター溶液の1〜6マイクロリットルを貯留槽に加えます。負の120ミリボルトの印加電圧でイオン電流時系列測定を適用します。
アルファヘモリシンチャネルを介した個々のアニオン性ホスホトゥングジン酸分子の動きは、平均開孔イオン電流を約80%減少させる一過性の遮断を生じ、持続時間と遮断電流はいずれも粒子と孔の相互作用に直接関連しており、イオン種を相対遮断深度比のヒストグラムで区別することを可能にする。pH 5.5では、約0.06と0.16の深さの比率で2つのピークが観察されました。リンNMRに基づいて、マイナーピークは6マイナスホスファトゥン州種であり、主要なピークは7マイナス種であった。
pH 7.5では、相対濃度は7-マイナス種に対する6-マイナス種のより高い比率にシフトした。pH 5.5に対する遮断事象の20倍の減少は、リン酸およびタングステン酸イオンの遊離による分解に起因した。滞留時間分布を適合させるには、複数の指数関数が必要であり、各イオン種内の複数のタイプの粒子と細孔相互作用を示す。
pH 7.5での滞留時間が短いほど、pH 5.5よりも弱い粒子と細孔相互作用が示唆され、α溶化管腔内またはアルファ溶出管腔付近の固定電荷の相対的数におけるpH依存的変化を示す以前の研究と一致した。高純度脱イオン水は、この特定のセットアップに不可欠です。使用済みの有機物フィルターカートリッジは、私たちの研究室が数ヶ月間QCMに膜を形成することができない可能性が高い原因でした。
この特定のバージョンの方法に新しい個人は、膜が非常に小さく、ナノポアを形成するトリックがあるため、苦労するかもしれません。数十年前に開始されたこの方法は、イオン、核酸、合成ポリマー、ならびにDNAシーケンシングの分析に有用であることが証明されています。また、生物物理学や基本的な細胞生物学の応用を見つけることができます。
例えば、この手順は、合成ポリマーおよびバイオポリマーの物理的性質を研究するために使用され、その大きさ、他の分子との相互作用、および他の重要な質問を調査することができる。
