(ハイタオ呉) に中国から助成金 Z161100000216154 の基礎研究の状態主要な開発プログラムから 973 (2014CB542203) プログラムの 31522029、31770929、31371149 (ハイタオ呉) に中国の助成金の国家自然科学基金を支え、北京市科学技術委員会 (ハイタオ呉) に.著者は、彼らの励ましと議論ハイタオ呉研究所のすべてのメンバーをありがとうございます。著者は、装置をデバッグでご支援威劉に非常に感謝しています。

動物実験手順、北京基礎医科学研究所 (中国・北京) のケアと実験動物の使用のための中国の政府の規制機関のガイドラインに従った。マウス (成人男性、26 〜 30 g) が収容され、12 h 光/12-h 暗いサイクル (7:00 に点灯)、下水と食品広告自由との 23 ° C の一定温度で保管します。光のサイクル中にすべての実験プロシージャを行った。
1. 手術の準備
注: カスタム電極だったハルパーンのレポート23から変更メソッドを使用して自家製。
<ol><li>並列バイポーラ電極として 2 マイクロ-銅線 (外径 200 μ m) を使用します。電極刺激用円筒電極を形成するためにお互いの周りをラップします。 注: ここでは、PP または DG 内電極の長さは、核の解剖学的深度によると変化させた。</li>
	<li>エチレン酸化物の消毒キャビネットを使用して電極を滅菌します。処理し、汚染することがなく自家製の 2 ch マイクロ ワイヤ電極を格納します。電極は、任意の外科的移植前に厳密に滅菌する必要があります。</li>
	<li>オートクレーブ手術器具。</li>
	<li>手術前に麻酔の手術面を達成するために、ペントバルビ タール (20 〜 50 mg/kg) と腹腔内、マウスを挿入します。</li>
	<li>滅菌ペニシリン G プロカイン サスペンション (75,000 U、i. m.)、感染症や痛み、それぞれ24のリスクを減らすための鎮痛エージェント (カルプロフェン、0.05 - 1 mg/kg、SC) とマウスを注入します。</li>
	<li>動物の麻酔した後に、目の乾燥を防ぐために両方の目に目の潤滑剤を適用します。つま先の摘心し、応答がないときにだけ、操作を続行応答で動物の反射により、鎮静作用の誘導と麻酔の深さを確保します。 注: 獣医軟膏は目の乾燥を防ぐために別のオプションです。</li>
	<li>電気バリカンや剃刀の刃を持つマウスの頭の上に毛皮のほとんどを剃る、70% アルコールや betadine ソリューションの 3 つの交互になるスクラブと剃毛エリアを滅菌、betadine、皮膚に乾燥後に操作を続行します。</li>
</ol>2. 高周波刺激手術25,26
注: この手順では電極は一方的背 DG または内側の PP エリア、エピソードの学習と記憶に重要な役割を持つ海馬の部分に植えられました。
<ol><li>定位脳手術フレームに麻酔下のマウスを置きます。マウスの頭を動かないように、耳バーを正しく整列させるし、すぐにそれらをインストールします。中心の頭をサポートし、マウスを少し確保して優しく耳バーを締めます。</li>
	<li>37 ± で動物の体の温度を維持するためにサーモスタットのパッドを使用して 0.5 の ° c.</li>
	<li>鉗子を使用して、マウスの耳前方の皮膚をつかみ、マウスの頭蓋骨の上に皮膚の 1 cm2の領域を削除する滅菌はさみでカットします。 注: カット皮膚の端に少量の出血を観察できます。</li>
	<li>筋肉や頭蓋骨表面を公開する綿棒と頭蓋骨を覆う他の添付ファイルを削除します。すべての骨膜、腱、結合組織から頭蓋骨の完全に識別、矢状面とラムダ縫合線をきれいに綿棒と解離性ノミを使用します。</li>
	<li>前とラムダ点を識別します。冠状縫合と、頭蓋骨の優れた中間部分の矢状縫合の交点は前があります。矢状縫合で後上の縫合の交点はラムダが目に見えるです。他の核の位置を設定するのには、元のポイントとして前を使用します。</li>
	<li>頭蓋骨の前とラムダの位置の同定後、横のレベルでこれらの 2 つの点を調整します。これらの 2 つの点の高さが (すべてのエラーは、< 0.05 mm をする必要があります), 背腹方向にほぼ同じであることを確認します。また、頭蓋骨が同じ方法26で内側外側方向に水平であることを確認します。</li>
	<li>片側手術のため、自家製 2 ch 銅マイクロ ワイヤ電極を定位脳手術フレーム回転電極ホルダーにマウントします。</li>
	<li>最初は、前のポイントの上に垂直方向に電極を置き、元のサイトとして設定。デジタルを使用して表示、前後 (ap 通信)、内側外側 (ML) を示す定位脳手術フレーム、背腹 (DV) が配置されます。 注: 電極が曲がってばかりを防ぐために操作中に頭蓋骨に電極先端部を触ください。</li>
	<li>電極を正しい位置にゆっくり移動 (図 1 a、pp、DG と AP-3.8/ML ± 3.0 の AP-2.1/ML ± 1.0 それぞれ)27タッチせず頭蓋骨の上。電極挿入の目的のサイトが見つかった、電極ホルダー高い卵割の定位調整を使用して、黒のマーカーの位置をマークします。 メモ: 定位座標に関して正確な場所はマウス緊張、重量、および性によって異なります。同性の大人のマウスを使用して、場所の変化を最小限に抑えるください。可能であれば、事前の解剖学的なスキャンは、個々 の主題の基礎27上の場所を識別するために使用ください。</li>
	<li>マイクロマニピュレーター アシスト ハンドドリルを使用して (サイズをバリ = 0.5 mm) マークした位置でバリ穴を正確にあける。掘削前に 70% のエタノールでバリの先端を滅菌します。0.8 - 1.0 ミリメートルの X と Y の位置を変更することがなく z 軸に沿って頭蓋骨を介してミニ ドリル ビットを移動します。操作中に任意の出血を止めるため滅菌綿を使用します。 注: 掘削中に過剰掘削、過度の発熱を避けるためには、掘削速度 15,000-18,000 回転/分 (RPM) は、すべて 8-10 のバリの穴からドリル ビットをよく撤回を確認します。</li>
	<li>硬膜は、公開までの掘削を維持します。曲がった針を使用して、掘削中に生成される、基になる柔らかい脳組織を損傷することがなく硬膜にピンホールを作るすべての骨のスクラップを削除します。 注: 脳組織を損傷しないように、ベントの鈍針置き換えることもできます罰金鈍い鉗子が付いて。</li>
	<li>バリ穴が目的の位置に適切に行われたことを確認するため定位脳手術フレームの調節によって電極の高さを減らすし、電極はバリの穴を介しては障害物に触れることがなくスムーズに挿入されることを確認します。もしそうならはゆっくりと電極を DG (DG PP) に内側の PP である頭蓋骨の表面に 1.8 mm DG (または PP の 3.0 mm) の深さに挿入します。 注: は、電極注入のプロセス中に脳脊髄液または滅菌綿とぎざぎざの穴からの血液流出をふき取りなさい。</li>
	<li>マイクロ ワイヤ電極を頭蓋の穴に挿入すると、小さなヘラを使用して適切な歯科用セメントと場所に保持します。セメントが濃くなると挿入された電極と素敵な滑らかなキャップを形成するネジの周り金型します。なかでも、創傷部を消毒してください。</li>
	<li>電極ホルダーから電極を外します。定位脳手術フレームからマウスを外し、暖かいケージに戻ります。 注: 手術後、彼らは完全に十分な意識と麻酔から回復してまで自分のケージに動物を返すと待ちます。</li>
	<li>マウスを自由に移動し、檻の中を 2 日間の回復することができます。注入電極を接続し、マウスでは、プログラマブル刺激を介して脳、。図 2に示されるように、ソフトウェアのインターフェイスを設定します。400 Hz で 6 パルスの 6 列車の 6 シリーズとして HFS パラメーターを設定 (図 1B列車、20 間 100 ms シリーズの間 s)28。200 μ A に刺激強度を設定します。</li>
	<li>セットとして必要な期間、HFS を提供します。刺激 2 日 x 8:00、20:00 配信します。</li>
	<li>コントロール グループのマウスの電極をインプラントし、刺激を実行しないでください。</li>
	<li>Fosの染色実験的マウスを鋭く刺激 (一日あたり 2 倍)。Brdu 細胞標識の分割実験的マウス急性刺激グループ (一日あたり 2 倍を適用) と慢性的な刺激のグループ (10 x 5 日間で、1 日あたり 2 倍を適用)。刺激の中に、マウスが目がさめているを確認します。リードがよじれていないことを確認してください。 注: プロシージャの最後の日で急性刺激群マウスは励まされて同時に。</li>
	<li>刺激が終わったら、慎重に電極ホルダーおよび記録システムのコネクタから電極ピンを外します。</li>
</ol>3. 蛍光抗体法およびブロモデオキシウリジン29を表示
<ol><li>Fosおよび notch1 遺伝子の染色は、最後の HF DBS 刺激後約 3 時間は麻酔の手術面を達成するために (20-50 mg/kg, i. p.) ペントバルビ タールを注射することによってマウスを麻酔します。</li>
	<li>Brdu 細胞標識の最後の HF DBS 刺激後約 12 時間は 2 h の間隔 (0.9% 生理食塩水、i. p. では 50 mg/kg) でコントロールして誘導マウス BrdU の 6 注射を与えます。最後の注射後 36 時間は、手術面を達成するために (20-50 mg/kg, i. p.) ペントバルビ タールを注射することによってマウスを麻酔します。</li>
	<li>心を公開し、左心室に灌流 22 ゲージ鈍針に胸郭をメスを使って切開を確認します。右のアトリウムで小切開を行います。Transcardially はそれを冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 50 mL の 1x PBS (pH 7.4) の冷たい 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の後の 50 mL の灌流します。 注: は、マウス血、生体内では置き換えられ、明確な流体を実行時に PFA に PBS を切り替えます。良い血流は肝のクリアによって判断できます。灌流固定微動が観測されている30一度停止してください。</li>
	<li>眼科用ハサミでマウスの首をはねる、皮膚を切開し頭蓋骨を公開します。鉗子を使用して、頭蓋骨を少しチップそして慎重に全体のマウスの脳を解剖します。ポスト ﬁx 追加 2 日間 4% パラホルムアルデヒドで脳と一晩で 4 ° C 30% ショ糖液に転送します。</li>
	<li>クライオスタットを使用して、20 μ m のコロナ セクションに脳を切り。転送しブラシでスライド ガラスのセクションをマウントし、-20 ° C で保存 注: 電極 misplacements または過度の機械的損傷を持つ動物は、その後の分析から除外されます。</li>
	<li>通常 PBS (0.1 M、pH 7.4) にスライドをコピーする定着剤が含まれていません。任意の余分な定着剤を削除する各 5 分の 3-4 倍の PBS とスライスを洗います。BrdU 標識グループのセクション 2 N 塩酸 37 ° C で 30 分間インキュベートし、0.1 M ホウ酸バッファーにそれらを洗い流して (pH 8.4; 10 分)。その後、洗ってスライス 2 x PBS で 5 分間。 注: 免疫染色が実行されます。</li>
	<li>ソリューション (0.5% トリトン X-100 と 0.02% アジ化ナトリウム 1x PBS で、3% ウシ血清アルブミン < BSA > 1% ヤギ血清) 室温 (RT) で 1 h のブロックでスライスを扱います。</li>
	<li>アンチfosポリクローナル抗体 (1: 500; ウサギ)、反 notch1 遺伝子の抗体 (1:50; ヤギ)、またはブロッキング液の 4 ° c で抗 BrdU 抗体 (1:800; ラット) とスライスを一晩インキュベートします。</li>
	<li>洗ってスライス 3 x pbs は、インキュベーションして Alexa Fluor 568 共役抗家兎 (1: 500)、Alexa Fluor 488 共役の反やぎ (1:1, 000) とまたは Alexa Fluor 488 共役抗ラット (1: 500) 二次抗体室温 1 時間</li>
	<li>サンプル 3 を洗って PBS (各時間 10 分) で x。DAPI を含む耐フェード試薬マウント媒体を用いた免疫標識脳のセクションをカバーしてください。空気乾燥し、4 ° C で光から保護保存スライスを聞かせてください。</li>
	<li>高分解能マルチ チャンネル (シーケンシャル) 走査共焦点顕微鏡と脳の刺激と非刺激側から海馬領域の画像を取得します。対照群と実験群の間に一貫して撮像パラメーターを設定します。</li>
	<li>隣接する電動ステージを使用して、ビューのフィールドの連続 3次元 (XYZ) を獲得し、大型複合材を作るためにそれらをステッチする適切なソフトウェアを活用して高倍率の目的 (20 X 空気目的、NA 0.45) モザイク画像を実行します。画像。 注: 真のステッチと改良されたシームレスなイメージのオプションを平滑化に、タイリング機能が含まれます。複合画像迅速かつ簡単に使用しておりますステッチ機能広域イメージを形成します。</li>
	<li>C-fosと notch1 遺伝子の染色、蛍光密度21ステッチの画像の肯定的な核定量分析を実行します。ランダムに吻側、背側、腹側海馬 DG 小で 3 エリアを選択し、画像 Jのソフトウェア (http://rsb.info.nih.gov/ij/) の31を使用して二重盲検の方法で蛍光の密度を測定します。</li>
	<li>ラベリング BrdU、二重盲検の方法で背側海馬 (前を基準にして-2.70 mm-1.70 mm) を介して掘削ポイント周りスライスを分析します。</li>
	<li>DG における BrdU 陽性ニューロンのみをカウントします。カウントの顆粒細胞の 2 セル径内に横たわっているセルが含まれてください。 注: ここでは、カウントを行った空気目的 X 40 を使用しています。ランダムに 3-5 セクションごとに動物が数えられたとカウントされた平均し DG19あたりの手段として表されます。</li>
</ol>

<ol>
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(94), e52220 (2014).</li><li>Pizzolato, G., Mandat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+for+movement+disorders.">Deep brain stimulation for movement disorders.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).</li><li>Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+recent+trends+and+further+promising+directions+in+functional+neurosurgery.">Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).</li><li>Laxton, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+deep+brain+stimulation+of+memory+circuits+in+Alzheimer's+disease.">A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease.</a> Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).</li><li>Min, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+induces+BOLD+activation+in+motor+and+non-motor+networks:+an+fMRI+comparison+study+of+STN+and+EN/GPi+DBS+in+large+animals.">Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals.</a> NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+after+transient+global+ischemia+in+gerbils.">Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils.</a> Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).</li><li>Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat:+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation.">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li></ol>

著者申告するものがあります。

HF DBS 手法は、1990 年代以降多くの神経疾患の治療のための強力なツールとして広く使用されています。これまでのところ、HF DBS のランドマーク作業はパーキンソン病や本態性振戦、多くの関心とクリニックと科学的なコミュニティの両方の関心を集めているの治療。特定神経疾患、精神疾患32,33HF DBS 治療上の適用の多くのグループによって進行中?...

HF DBS は、1870 年代1から培われた脳の電気刺激のため脳神経外科技術です。1980 年代後半に HFS がパーキンソン病の潜在的な治療的介入として使用された最初と他の運動障害2。過去数十年で、HF DBS 使用されていますより広く現在治療である脳疾患の治療に従来の治療方針で。特に、HFS 電極、非常に効果的な成果、最小限の副作用の精度向上のため、HF DBS によって扱われる脳疾患の大幅増えている過去数十年3,4、 5。HF DBS をパーキンソン病 (PD)、アルツハイマー型痴呆、本態性振戦、運動疾患2,6、の他の種類の治療のため米国食品医薬品局 (FDA) によって承認されているなど7。 ドーパミン作動性薬の削減 PD 患者における HF DBS8時 50% まで。運動障害の治療に加えて HF DBS はも2,9,として認知増強のため診療所で精神疾患の治療に強力な効果を示しています。10,11. HFS の他の精神疾患の治療のための研究は、さまざまな段階、患者12に多くの約束を提供することに注意してください。
多くの研究は焦点の HFS が脳13全体のローカルとリモートの両方の効果を持っていることを示している、とらえどころのない2,14のまま効果の神経学的および分子のメカニズムです。診療所で治療 HF DBS は、通常のパーキンソン病と慢性の痛みなど多くの意見がどの 1 つの可能性の間での HF DBS 治療によって生成される改善を説明する発生の治療のため長期的な方法で適用されます。現在の HFS は、変調注入の HFS 電極近傍における軸索の反復的な脱分極によって神経ネットワークの活動をおそらく。また、HF DBS は、出力ニューロンと投影のターゲットの吐出量を変更可能性があります。また、HF DBS をつながる可能性があります長期的なシナプスの変化によって、長期増強 (LTP) や長期抑圧 (LTD) などに症状の改善に貢献するかもしれない。ところ、それはまだ不明かどうか HFS inﬂuences 携帯を調節する分子のキーイベント処理など成体脳ニューロン新生の生体として。研究のいくつかの行は、齧歯動物の HFS が臨床的に応用の DBS15,16のと同様の神経応答を模倣可能性がありますを示しています。本研究では、HF DBS の基になる細胞メカニズムを理解するには、我々 最初にセットアップを生体内でHFS 方法論マウスで急性 (1 日) または慢性 (5 日間) さま。第二に、我々 は HF DBS 出産後神経と神経活動の変化を決定する化分析の方法論を設定します。
神経幹細胞から神経細胞の生産が萌芽期の開発の間に豊かなが、大人の生活の中で続けていることを考える、海馬顆粒ゾーンは細胞新生が発生する主要な領域の 1 つです。神経新生のプロセスは、多くの生理学的および病理学的要因の影響を受けます。特定のてんかんの場合は、海馬の神経新生は劇的に減少した17,18です。さらに、単一電気けいれん療法は、19海馬歯状回の神経細胞の生産を大幅に向上する可能性があります。電気生理学的活動が成体と海馬ニューロンのシナプス可塑性の調節に重要な役割を果たしていることが示唆されました。したがって、神経活動と神経新生に及ぼす HF DBS をさらに示すためには、まず実施から生じる短期的な神経活動のよく知られているマーカーは、即時初期遺伝子 (IEG) fosの免疫染色法20をが発生します。Notch1 遺伝子のシグナルが検出された HFS 配信21,22後シグナル伝達活性をモニターします。さらに、我々 は、BrdU 染色することもできます gliogenesis のマーカーが様々 な方法で HF DBS 誘導後分析をラベリング BrdU による神経の生産も検出します。
本研究では 2 つの HFS 方法は直接および間接的に海馬 DG の活性化をターゲットに適応されます。電極は DG に直接注入または DG の神経細胞をアクティブにする予測を送信内側貫通パス (PP) に移植しています。HF DBS 誘導プログラム可能な刺激は、マウスの頭の上に固定電極を連続刺激を介して提示されます。HFS の神経細胞の活性化と神経新生に及ぼす影響を決定する免疫蛍光染色と海馬 DG 地域における BrdU 組み込まれて肯定的なニューロン数c-fosと notch1 遺伝子の発現を検出後,HFS の治療。特に、HF DBS の DG における神経新生に及ぼす影響比較されます急性と慢性刺激方法または直接および間接的な刺激方法間それぞれ。

<table><tbody><tr><td>Brain stereotaxic instrument</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>Stereotactic intracranial implantation for mouse</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A-M systems</td><td>Model 3800</td><td>MultiStim 8-Channel programmable stimulator</td></tr><tr><td>Dental driller</td><td>Saeshin Precision Co., Ltd</td><td>STRONG 90</td><td>For drilling and crainiotomy&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Burr</td><td>Meisinger</td><td>HM1 005#</td><td>For drilling and crainiotomy&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1550 Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>AXON 1550</td><td>High-resolution data acquisition</td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Cryotome FSE</td><td>Cutting frozen sections of specimens</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV-1200</td><td>Japan, with 20x Objective (NA 0.45)</td></tr><tr><td>Mouse surgery tools</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08,11254-20,16109-14</td><td>Scissors, forceps, bone cutter, holders etc.</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>4579</td><td>20-50mg/kg for i.p. injection</td></tr><tr><td>Penicillin G&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td>75,000 U for i.m. injection</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1713</td><td>5-10mg/kg, for s.c. injection</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Beijing Solarbio Sci-Tech Co.&amp;nbsp;</td><td>P1110</td><td>stocking solution for tissue fixation</td></tr><tr><td>Phosphate buffer (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td>pH7.4, 500ml in stocking</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Formulation of water-soluble glycols and resins</td></tr><tr><td>anti-BrdU antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Dilutions:1/800</td></tr><tr><td>anti-c-fos antibody</td><td>Abcam</td><td>ab209794</td><td>Dilutions:1/500</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11036</td><td>Dilutions:1/500</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-546-150</td><td>Dilutions:1/500</td></tr><tr><td>Antifade mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Counterstaining with DAPI</td></tr><tr><td>anti-Notch1 antibody (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-6014</td><td>Dilutions:1/50</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td>Dilutions:1/1000</td></tr></tbody></table>

an invasive method for the activation of the mouse dentate gyrus by high-frequency stimulation

電気高周波刺激 (HFS)、さまざまな脳領域をターゲット注入電極を使用しては、様々 な神経疾患、精神疾患の効果的な治療法として実証されています。深部脳刺激療法 (DBS) とも呼ばれます、脳の深部で HFS 臨床試験でますます重要になってきた。高周波 (HF DBS) 外科領域の最近の進歩は大鬱病障害 (MDD)、強迫性障害 (OCD) の治療など、その他の状況にこの侵襲的手法の利用可能性を普及し始めているので上。
これらの拡大の徴候にもかかわらず HF DBS の有益な効果のメカニズムに残る謎。この問題に対処するため 1 つのアプローチはまばら HFS によってニューロンの分散のサブポピュレーションをアクティブに注入電極を使用します。それは、診療所における難治てんかんの治療のため、視床の前核の HFS がされる可能性がありますが報告されています。基になるメカニズムは増加神経新生に関連するかもしれない、神経活動を変更します。したがって、HFS 治療前後 (DG) のマウスの海馬歯状回における神経新生と同様に、神経活動の検出による生理学的変化を探究することに興味を持っております。
本稿では、直接または間接的、急性または慢性的にマウスで DG の活性化をターゲットに HFS のための方法論について述べる.さらに、述べるは、 c-fosと notch1 遺伝子の神経の活動を監視する染色とシグナル伝達活性化蛍光ブロモデオキシウリジン (BrdU) を決定するためにラベル付け、脳スライスの準備のための詳しいプロトコル、HF DBS 誘導後の新生。HF DBS 治療後神経活動と神経の活性化は、神経生物学の直接証拠と潜在的な治療上の利点を提供します。特に、この方法論を変更し、大脳基底核などの他の興味がある頭脳領域とクリニック特定の脳障害に対する視床領域をターゲットに適用できます。

次の海馬の DG のサブ領域を直接または DG を直接活性化する PP サブ領域に HF DBS 刺激定位調整を使用してを介して挿入された電極、齧歯動物の, ペントバルビ タール麻酔をかけられましたし、3 h をサンプリングc-fosと notch1 遺伝子免疫染色の最後の HF DBS 刺激。BrdU の染色、1 日または 5 日間 HF DBS 刺激の後最後の BrdU 投与後 36 h のげっ歯類脳セクションの?...

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An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

このプロトコルはマウスで信頼性の高い HFS メソッドを設定する方法を示しています。を通じて海馬歯状回の神経細胞は、HFS を直接および間接的に生体内で電気刺激します。神経活動と分子シグナリング、 c-fosと notch1 遺伝子の免疫蛍光染色でそれぞれチェックします。神経新生は、アッセイをラベリング ブロモデオキシウリジンによる定量化されます。

高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

an-invasive-method-for-activation-mouse-dentate-gyrus-high-frequency

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.7K ビュー.  Beijing Institute of Basic Medical Sciences. このプロトコルはマウスで信頼性の高い HFS メソッドを設定する方法を示しています。を通じて海馬歯状回の神経細胞は、HFS を直接および間接的に生体内で電気刺激します。神経活動と分子シグナリング、 c-fosと notch1 遺伝子の免疫蛍光染色でそれぞれチェックします。神経新生は、アッセイをラベリング ブロモデオキシウリジンによる定?...

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Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential cellular mechanism underlying learning and information storage, have long been used to elucidate the physiology of various neuronal circuits in the hippocampus, amygdala, and other limbic and cortical structures. With this in mind, transgenic mouse models of neurological diseases represent useful platforms to conduct long-term&#160;potentiation (LTP) studies to develop a greater understanding of the role of genes in normal and abnormal synaptic communication in neuronal networks involved in learning, emotion and information processing. This article describes methodologies for reliably inducing LTP in the freely behaving mouse. These methodologies can be used in studies of transgenic and knockout freely&#160;behaving mouse models of neurodegenerative diseases.

Transgenic and knockout mouse models of neurological diseases are useful for studying the role of genes in normal and abnormal neurophysiology. This article describes methodologies which can be used to study long-term potentiation, a cellular mechanism which may underlie learning and memory, in transgenic and knockout freely&#160;behaving mouse models of neuropathology.

自由に行動するマウスにおける有孔質路 - 歯状回シナプスの長期増強

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

行動学

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

成体マウスから海馬歯状回の解剖

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

生物学

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.

マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

神経科学

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

行動するマウスにおける海馬シータ振動の光同調

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

行動中マウスの海馬における振動を制限空間録音

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for several neuropsychiatric diseases. The biological effects of tDCS are not fully understood, which is in part explained due to the difficulty in obtaining human brain tissue. This protocol describes a tDCS mouse model that uses a chronically implanted electrode allowing the study of the long-lasting biological effects of tDCS. In this experimental model, tDCS changes the cortical gene expression and offers a prominent contribution to the understanding of the rationale for its therapeutic use.

Transcranial Direct Current Stimulation tDCS in Mice

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a therapeutic technique proposed to treat psychiatric diseases. An animal model is essential for understanding the specific biological alterations evoked by tDCS. This protocol describes a tDCS mouse model that uses a chronically implanted electrode.

マウスにおける経頭蓋直流電流刺激 (tDCS)

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

マウス脳の水平海馬スライス

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

低コストの脳波とミリサイズのコイルでマウスの脳を刺激

Low-Cost Electroencephalographic Recording System Combined with a Millimeter-Sized Coil to Transcranially Stimulate the Mouse Brain In Vivo

A low-cost electroencephalographic (EEG) recording system is proposed here to drive transcranial magnetic stimulation (TMS) of the mouse brain in vivo, utilizing a millimeter-sized coil. Using conventional screw electrodes combined with a custom-made, flexible, multielectrode array substrate, multi-site recording can be carried out from the mouse brain. In addition, we explain how a millimeter-sized coil is produced using low-cost equipment usually found in laboratories. Practical procedures for fabricating the flexible multielectrode array substrate and the surgical implantation technique for screw electrodes are also presented, which are necessary to produce low-noise EEG signals. Although the methodology is useful for recording from the brain of any small animal, the present report focuses on electrode implementation in an anesthetized mouse skull. Furthermore, this method can be easily extended to an awake small animal that is connected with tethered cables via a common adapter and fixed with a TMS device to the head during recording.The present version of the EEG-TMS system, which can include a maximum of 32 EEG channels (a device with 16 channels is presented as an example with fewer channels) and one TMS channel device, is described. Additionally, typical results obtained by the application of the EEG-TMS system to anesthetized mice are briefly reported.

著者スポットライト:ミリサイズコイルと組み合わせた低コストの脳波記録システムによるマウス脳の経頭蓋刺激 In vivo  

A low-cost electroencephalographic recording system combined with a millimeter-sized coil is proposed to drive transcranial magnetic stimulation of the mouse brain in vivo. Using conventional screw electrodes with a custom-made, flexible, multielectrode array substrate, multi-site recording can be carried out from the mouse brain in response to transcranial magnetic stimulation.

ミリサイズのコイルと組み合わせた低コスト脳波記録システムにより、マウス脳をin vivoで経頭的に刺激する

A low-cost electroencephalographic (EEG) recording system is proposed here to drive transcranial magnetic stimulation (TMS) of the mouse brain in vivo, ...

高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

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成体マウスから海馬歯状回の解剖

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マウスにおける経頭蓋直流電流刺激 (tDCS)

マウス脳の水平海馬スライス

ミリサイズのコイルと組み合わせた低コスト脳波記録システムにより、マウス脳をin vivoで経頭的に刺激する

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