コメント Ninov 研究室のメンバーは、原稿、再生療法ドレスデン (CRTD) 魚と顕微鏡施設のテクニカル サポート センターのメンバーに感謝いたします。N.N. は、DFG CRTD、TU ドレスデン、ドイツ研究振興協会 (DFG)、ドイツ語センター糖尿病研究 (DZD) のために卓越性のクラスターからの資金によってサポートされます。

Landesdirektion ザクセン, ドイツ (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016) の許可と動物福祉法による動物科目を含むすべてのプロシージャを承認されています。
1. 準備
メモ: このプロトコルは、ゼブラフィッシュ二重遺伝子導入 Tg から主膵島のex vivoイメージング (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP);Tg (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 ゼブラフィッシュ。このトランスジェニック行でインスリン プロモーター (ins) ドライブ 2 つの遺伝子の β 細胞特異的発現: nls-Renilla-mKO2、単量体の Kusabira オレンジ 2 (mKO2) と β 細胞の核にあたる蛍光;GCaMP6s15 は、細胞内カルシウム水準の上昇への応答で緑色の蛍光を発する。GCaMP6s のベータ細胞特異表現は、周囲の細胞のタイプのカルシウム変化から干渉されることがなく β 細胞のグルコース応答性を検討できます。
<ol><li>1 ml の Ca2 +/Mg2 +牛フィブリノーゲンの 10 mg を溶解することにより新鮮なフィブリノーゲン株式 (10 mg/mL) の準備-ハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) 1.5 mL 遠心管中を含みます。渦フィブリノゲン粉末を完全に溶解するまで精力的に。少なくとも 15 分以上の室温でのソリューションを保持します。 注: ソリューションは、重合を開始し、粘性になる場合、在庫は 2-3 在庫破棄のため室温で保存できます。</li>
	<li>三重の HBSS フィブリノゲン株式を希釈してフィブリノゲン作業ソリューション (3.3 mg/mL) を準備します。たとえば、フィブリノーゲン フィブリノーゲン実用的なソリューションの 900 μ L を準備する HBSS の 600 μ L 入荷の 300 μ L をミックスします。</li>
	<li>10 を溶解することにより、トロンビン溶液 (10 U/mL) を準備 HBSS のリン酸 1 mL でトロンビンのユニット緩衝生理食塩水 (PBS)。 注: このソリューション 50 μ L パーツで検体、予め用意でき-20 ° C の凍結</li>
	<li>200 mM D グルコース溶液を準備するには、50 mL の水に D-グルコースの 1.8 g を溶解します。長期保存のための 4 ° C にしてください。</li>
	<li>300 mM KCl の解決策を準備するには、水 50 mL に KCl の 1.1 g 溶解します。長期保存のための 4 ° C にしてください。</li>
	<li>小島のマウント 35 mm 径ガラス底培養皿を調達します。</li>
	<li>郭清と膵島の取り付けは、蛍光ランプと赤のフィルター キューブを搭載したステレオ顕微鏡を使用 (TRITC: 励起: 532-554 nm、発光: 570-613 nm; またはテキサス赤: 励起: 540-580 nm、発光: 592-667 nm)。</li>
	<li>使用 (0.8 NA) X 20 倒立共焦点顕微鏡 (ツァイス LSM または類似の 780) 空気の目的および 35 mm 径ガラス底培養皿のプレート ホルダー装備 β 細胞内カルシウム流入のイメージングのため。</li>
	<li>ゼブラフィッシュを安楽死させるため tricaine メタンのスルフォン酸塩 (MS222) の 200 mg/L 溶液を準備します。</li>
	<li>ゼブラフィッシュ解離 90 mm シャーレを調達します。</li>
</ol>2. ゼブラフィッシュ主膵島郭清と取付
<ol><li>MS222 で長期間加温を使用して魚を安楽死させます。このため、優しく漁網を使用して水槽から魚を削除し、蓋 (えら) の動きを示しています動物まで、MS222 ソリューションを含むペトリ皿でインキュベート通常、これにかかる 5 分含む Ca2 +/Mg2 +HBSS 液シャーレに転送魚。</li>
	<li>
蛍光ランプと赤のフィルター キューブを搭載したステレオ顕微鏡、下膵臓を分離する動物の腹部の右側にあるを覆っている皮膚を切り裂きます。
	<ol>
<li>このため、シャープな鉗子を用いた臀鰭に口からゼブラフィッシュの皮膚をカットします。腹部を公開するカットの皮膚をはがすこの snipping 臓器の内部を公開します。Β 細胞の mKO2 式の赤い蛍光性を利用して、顕微鏡下で目視検査によって島の位置を確認します。必要な場合は、彼らは見つけるが難しく、膵島をカバーできるよう、肝臓の葉を削除します。 注: 主な膵島は腹部、通常右側の前歯の近くにあります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>肝臓や脂肪細胞などの周囲の組織を慎重に外して主膵島をきれい。けがや膵島; を突くしないように予防措置を取る周囲の組織のクリアした後島表面の個々 の細胞は認識になります。</li>
	<li>ガラス底皿の中央に HBSS の 30 μ L ドロップをピペットします。このドロップに切り裂かれたアイレットを転送します。</li>
	<li>小島 HBSS で一度とフィブリノゲン作業ソリューション (3.3 mg/mL) の 30 μ L を慎重に洗います。細胞死の結果をそう失敗のため洗浄のステップ中に膵島の乾燥を避けるためにことを確認します。</li>
	<li>ゆっくりと優しく、トロンビン溶液 (10 U/mL) を 10 μ L を追加します。小島と皿は 15-20 分、フィブリノーゲン-トロンビン ドロップなる粘性とわずかに不透明なこの時点で観察のためそのままのままにします。</li>
</ol>3 Ex Vivoでのゼブラフィッシュ プライマリ ランゲルハンス島における GCaMP の蛍光強度のライブ イメージング。
<ol><li>HBSS 金型上に 200 μ L を追加し、共焦点顕微鏡のプレート ホルダーに慎重に皿を置きます。共焦点レーザー顕微鏡の 20 倍、0.8 NA、航空目標を使用します。明視野観察オプションを使用して島を探します。</li>
	<li>赤い蛍光性のフィルターを使用して、ベータ細胞の核 mKO2 蛍光を見る、小島に焦点を当てます。個々 の核がはっきりと見えるはずです。</li>
	<li>手動で z 軸に沿って膵島の厚さを介して移動するために共焦点顕微鏡の焦点面を変更することによって明確な画像面を探します。画像平面 β 細胞イメージングのための十分な数 (50-100) を含んでいる、核 mKO2 蛍光の明るさは膵島の中心部で特に制服を確認します。</li>
	<li>「スマート セットアップ メニュー」で次設定を使用して GCaMP6s と mKO2 蛍光の連続集録のセットアップ: GCaMP6s、励起: 488 nm、排出: 500-555 nm、偽色: 緑 (Select"GFP");mKO2、励起: 561 nm (mCherry)、排出量: 570-630 nm、偽色: 赤 (選択"mCherry")。 注: この設定で、緑のチャネルは、GCaMP の蛍光強度を記録しながら、赤のチャネルによって β 細胞核の位置が記録されます。</li>
	<li>「アクイジション ・ モード」で 1,024 x 1,024 ピクセルで画像の解像度を設定 10 と 1 で平均速度。開始連続記録「時系列」のオプションを選択して、1 フレームあたり約 2 秒捕捉時間と 500 サイクルの「期間」を設定します。 注: タイム シリーズの最初の 50 のフレーム 5 mM のグルコース濃度で β 細胞の活動に対応します。これは、ベースラインの応答です。Β 細胞の応答時間で緑色の蛍光強度の満ち欠けが表示されます。我々 は、β 細胞の数 (1-5%) が 5 mM グルコースで振動することを観察しました。</li>
	<li>
イメージングのサイクルに目を離さない。最初の 50 フレーム後に、記録を停止せず 10 mm 周囲液のグルコース濃度を増やします。
	<ol>
<li>画像取り込みを混乱させないでそっと 200 mm 膵島を保持してゲルの上に D-グルコース溶液 5 μ L をピペットします。10 mM グルコース 150 フレームを取得します。 注: グルコース濃度の増加は、β 細胞の数を増加させる、緑のチャネルで GCaMP 蛍光振動を受けています。</li>
		<li>細胞の核は、プロセス中には安定を確認します。小島が広く集録時に揺れていて、フォーカル プレーンのうち核に移動、(必要なら) サンプルを破棄します。</li>
		<li>その後試料の安定性を確保するためにフィブリノーゲン-トロンビン金型の重合を有効にするのに十分な時間を待機します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>200 フレームでさらに軽く 200 mm D グルコース溶液 10 μ L をピペットで 20 mM に溶液の濃度を上げます。20 mM 濃度 150 フレームを取得します。</li>
	<li>350 フレーム後 KCl の 30 ミリメートルを使用して島を脱分極します。このため、300 mM KCl 原液の 20 μ L を追加します。この段階で観察 GCaMP6s 蛍光振動を停止し、高強度の修正また β 細胞はグルコースに応じなかったことは、KCL の添加によってグリーン蛍光強度の増加を表示しました。</li>
</ol>4. 個々 の β-細胞の GCaMP 蛍光トレースの定量化
注: トレースは、グルコースの様々 なレベルに個々 の β-細胞の応答を定量化、イメージング期間全体の GCaMP 蛍光強度を定量化します。数量は、携帯電話の解像度で実行されます。このためには、画像 (4.1-4.6 のステップ)、およびスプレッドシート ソフトウェアまたは R21分析 (4.8 から 4.9 の手順) を実行するから GCaMP の蛍光性の強度の値を抽出するフィジー20を使用します。
<ol><li>フィジー「LSM ツールボックス」を使用してイメージ ファイルを開きます。このため、選択"プラグイン |LSM ツールボックス |"LSM ツールボックスを表示します。「LSM ツールボックス」で"オープン LSM"をクリックし、イメージ ファイルを選択します。 注:「LSM ツールボックス」でサポートされていない形式の tiff を分析のために最初にそれらを変換します。</li>
	<li>フィジーの関心領域 (ROI) ツールを使用して細胞の応答を抽出します。「ツール」の下で「分析」メニューで「ROI マネージャー」を開きます。ツールバーにある「多角形選択ツール」を使用して投資収益率を手動で描画します。</li>
	<li>ベータ細胞核が表示されます赤のチャネルに投資収益率を描画します。それは細胞の細胞質の一部を含めるためには細胞の核より大きい領域をカバーして、投資収益率を選択します。ROI 位置がフレーム間で一貫していることを確認し、必要に応じて位置を調整します。</li>
	<li>「ROI マネージャー」に「[t] を追加する」ボタンをクリックしてして選択した Roi を追加します。選択し、複数のセルでデータを取得する投資収益率に複数 roi 結合相関を追加します。</li>
	<li>次に、「解析」メニューから「測定を設定」を選択します。領域内の合計の蛍光強度の抽出を指定するためには、「集積密度」を選択します。</li>
	<li>GCaMP 蛍光を含む緑のチャンネルに移り、「ROI マネージャー」で「マルチ メジャー」を選択。 注: これは時間シリーズを通して細胞の強度の測定を提供します。</li>
	<li>ROI 位置は膵島の動きのために調整する必要があります、場合に別のフレームで強度の測定を手動でコンパイルします。コピーして別のスプレッドシートに値を貼り付けます。</li>
	<li>「LSM ツールボックス」からイメージ フレームのタイムスタンプを取得します。使用"スタンプを適用 |T スタンプを適用 |ファイル名 |ダンプ テキストファイルに"タイムスタンプを取得します。「として保存」オプションを使用してタイムスタンプを保存またはスプレッドシートにそれらをコピーします。</li>
	<li>すべてのセルの強度値をコンパイル時に分析 1 つのセル、または自動的に (例えばExcel の数式または R を使用) を実行します。</li>
	<li>
2 つのステップの個々 のセルを分析します。
	<ol>
<li>最初のステップで、ベースラインの上の蛍光強度を計算します。このため、最初の 50 フレーム (5 mM グルコース) の蛍光強度の平均として基準蛍光強度 (F0) を計算します。全体の時系列からベースライン (F0) を減算 (– F F0)。 注: いくつかのセルは、通常高濃度で刺激を続けているクリアの GCaMP 振動基底グルコース下を表示できます。このような細胞の細胞が蛍光性の低下を示した初期フレームの平均強度を生かして F0を見積もることができるだけです。</li>
		<li>分析の 2 番目のステップで蛍光強度を正規化することで最終的な GCaMP の蛍光強度を取得します。 注: これは異なる動物から島の違いが削除されます。個々 の島は、グルコース刺激による蛍光発光のさまざまなレベルを表示します。</li>
		<li>最高の強度値で割ることによって蛍光強度を標準化します。これ、ピーク強度 (F最大– F0) を算出し、最終的な GCaMP の蛍光強度を降伏するピーク強度の基準減算値の除算 (F – F0)/(F最大– F0)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>不健全なまたは破損しているかもしれないので変更を KCl 刺激強度に示さない細胞を破棄します。</li>
	<li>R で分析 (4.9-4.10 の手順) を実行するため使用する R スクリプト (plotcelltrace。R) この原稿を提供しました。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kahn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contributions+of+insulin+resistance+and+beta-cell+dysfunction+to+the+pathophysiology+of+Type+2+diabetes.">The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).</li><li>Ogurtsova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+for+the+prevalence+of+diabetes+for+2015+and+2040.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040.</a> Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).</li><li>Pipeleers, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+pancreatic+beta-cell+population.">Heterogeneity in pancreatic beta-cell population.</a> Diabetes. 41 (7), 777-781 (1992).</li><li>MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+mechanisms+in+pancreatic+beta-cells.">Glucose-sensing mechanisms in pancreatic beta-cells.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360 (1464), 2211-2225 (2005).</li><li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+induces+oscillatory+Ca2++signalling+and+insulin+release+in+human+pancreatic+beta+cells.">Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 37, S11-S20 (1994).</li><li>Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+oscillations+of+cytoplasmic+Ca2++and+insulin+release+in+glucose-stimulated+pancreatic+islets.">Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets.</a> J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).</li><li>Wollheim, C. B., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cytosolic+free+Ca2++and+insulin+release+in+an+insulin-secreting+cell+line.">Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line.</a> J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).</li><li>Pace, C. S., Price, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+responses+of+pancreatic+islet+cells+to+secretory+stimuli.">Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli.</a> Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).</li><li>Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+of+single+insulin+secretory+granules+with+evanescent+wave+microscopy:+distinct+behavior+of+granule+motion+in+biphasic+insulin+release.">Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release.</a> J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).</li><li>Soria, B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+calcium+oscillations+and+insulin+release+in+pancreatic+islets+of+Langerhans.">Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).</li><li>Kenty, J. H. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+pancreatic+islet+function+at+the+single+cell+level+by+calcium+influx+with+associated+marker+expression.">Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression.</a> PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling.">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+developmental+histories+of+beta-cells+generate+functional+and+proliferative+heterogeneity+during+islet+growth.">Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth.</a> Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Friedman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+autoimmune+microenvironment+regulates+the+quality+of+effector+T+cell+restimulation+and+function.">An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function.</a> Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+&#946;-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature &#946;-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nat Commun. 7, 11756 (2016).</li><li>Johnston, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+Cell+Hubs+Dictate+Pancreatic+Islet+Responses+to+Glucose.">Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose.</a> Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).</li></ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

単一セルの解像度で β 細胞のグルコース応答性の定量化のための手法を示します。これは遺伝子にコードされたカルシウム インジケーター、GCaMP6s を使用して細胞内カルシウム濃度を監視することによって可能です。ベータ細胞の活性は、フィブリノーゲン-トロンビン金型で小島をマウントすることによってキャプチャされた前のヴィヴォです。プロトコルの重要なステップは、金型の安定性です。十分な時間は、フィブリノゲン HBSS 溶液中で溶解するために与えられる必要があります。これがなければ、金型が重合していないので十分にイメージング セッション中に安定性を提供します。小島フィブリノーゲン-トロンビン金型にマウントされ、細胞培養媒体に没頭して残ることが実行可能な少なくとも週 (データは示されていない)。フィブリノーゲン-トロンビン金型、低溶解アガロースなどの選択肢を活用して、膵島22をマウントすることできます。もう一つの重要なパラメーターは、膵島の郭清です。このステップでは、周囲の膵島組織が負傷または膵島を突っついことがなく削除する必要があります。巧みな郭清は実際に付属しています。
イメージングのプロトコルの制限は、膵島の 1 共焦点平面に制限です。これは、ベータ細胞内カルシウム流入の力強さを表現します。膵島の全体の厚さ Z スタックは低画像の速度と個々 の細胞からの振動信号の損失に します。この制限は、3 次元のカルシウム動態をキャプチャを有効にするなど回転ディスクの顕微鏡検査、共焦点レーザー顕微鏡のより高速な手段を用いて改善できます。生体内でカルシウム イメージング12別のフロンティア。ゼブラフィッシュ胚の透明な性質や色素少ないゼブラフィッシュ大人23系統の使用は、将来的に生体内イメージングの可能性を開くことができません。
高時空間分解能でベータ細胞活性のイメージングにより、個々 の β-細胞間の機能的多様性を調査します。このアプローチは、β 細胞集団の存在に光を当てることができます。最近では、複数の研究は名目上均質な β 細胞24,25,26のサブ集団の存在を示しています。Ex vivoイメージングは、グルコースのサブ集団の応答の特性を遺伝的記者と組み合わせることができます。さらに、薬理学的刺激とイメージング セットアップを組み合わせることを β 細胞機能を向上させることができる化合物のスクリーニングを許可できます。
要約すると、ここで紹介しているテクニックは、定量化と個々 の β 細胞のグルコース応答性の比較をことができます。それは β 細胞機能、糖尿病の開発の重要なパラメーターに直接ウィンドウを提供します。

私たちの血糖は、内分泌の膵臓の機能のための大きい部分の狭い範囲に保持されます。膵臓の内分泌の役割は、ランゲルハンス島、ホルモン分泌細胞を含んだによって実行されます。インスリン分泌 β 細胞は、血糖値炭水化物を含む食事を次のレベルを減らします。不十分なインスリン分泌 β 細胞からは、糖尿病1、持続的な高血糖によって特徴付けられるで起因できます。タイプ 1 とタイプ 2 糖尿病は、現在世界中で以上 4 億人を苦しめる、罹患率と死亡率の2に します。Β 細胞機能不全に貢献する分子や環境要因を調査してには、2 型糖尿病を起動し、進行状況をよりよく理解され我々。さらに、ベータ細胞の in vitroに人間の幹細胞を分化する能力は、1 型糖尿病でセル置換療法の新しいベータ細胞のソースを提供できます。このため、ベータ細胞の機能と遺伝モデル有機体の成熟を皿にベータ細胞を作るために必要な知識を得るために勉強することが重要です。
Β 細胞機能は、グルコース刺激による分泌されるインスリン量を定量化することで全体島レベルで監視できます。この累積的なアプローチは、個々 のセルのプロパティを区別せず細胞の単一のグループとして膵島を研究します。ただし、個々 の β 細胞のグルコース応答の解析には、ベータ細胞の機能特性と不均一性3の存在の多様性が明らかにしました。個々 のベータ細胞の機能を評価するためにインスリン分泌4につながる細胞内の変更を監視することが可能です。インスリン分泌 β 細胞にブドウ糖のエントリの前します。Β 細胞に入ったグルコースは atp 急速に代謝されます。高い細胞内 ATP 濃度は、β 細胞の脱分極に導く ATP 感受性カリウム イオン チャネルのオープンの確率を減少させます。脱分極電位感受性カルシウム イオン チャンネルが開き、細胞内カルシウムを増加させます。ターンでは、カルシウムは循環で解放され、グルコース利用5,6,7を促進することにより血糖値を下げるインスリンの分泌をトリガーします。
いくつかの戦略は、β-細胞膜の潜在的な8インスリン小胞のエキソサイトーシス9の直接可視化と細胞内 Ca2 +の定量の監視などの機能を調査するために適用されています。グルコース応答性10のプロキシとして流入。中でも、細胞内 Ca2 +のイメージングはスケール アップ同じ膵島11,12日間グルコース応答性の直接比較を可能にする内の複数の個々 のセルに、分析の利点を提供します。個々 の β-細胞。細胞内 Ca2 +濃度は、カルシウム感受性蛍光色素13または遺伝子にコードされたカルシウム指標 (GECIs)14を使用して監視できます。一方、カルシウム インジケーター色素欠乏細胞型特異性、GECIs は、特定のプロモーターによって特定のセル型で表現できます。また、GECIs、GCaMP6 などの新世代高速ダイナミクス15と共により高い信号対雑音比を提供します。ここ GECIs 単一セルの解像度で β 細胞中のカルシウムを視覚化するための特定の GCaMP6s での新しい世代の有用性を述べる.選択の私達のモデルとして、ゼブラフィッシュを主島に本手法を適用.萌芽期の開発の間に主な膵島のベータ細胞に属します、背側と腹側膵芽16。簡単識別・分離を有効にするゼブラフィッシュ膵臓内のステレオタイプ的な解剖学的位置に主な島があります。主な膵島のベータ細胞は、血糖17,18につながる彼らの遺伝的アブレーション血糖の調節に必要です。さらに、これらのベータ細胞は、早いゼブラフィッシュ開発19中グルコース応答性になります。このプロトコルは、ポスト萌芽期の段階の間に形作る二次の小島をイメージングにも適用できます。プロトコルは定義されたグルコース濃度下の開発の後の段階で画像の β-細胞前のヴィヴォ、することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:276px;">Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">By request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">495015-0001-000</td>
			<td style="width:291px;">SteREO Discovery.V8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">423013-9010-000</td>
			<td style="width:291px;">Illuminator HXP 120 V</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Red Filter Cube</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">000000-1114-462&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Filter set 45 HQ TexasRed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">LSM 780</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine fibrinogen</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS (Hanks&#39; Balanced Salt solution)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm diameter glass-bottom dishes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">E10521&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:344px;">11445-12</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">R, version 3.2.4</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">RStudio</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">plotcelltrace.R</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">A custom script provided with the manuscript</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

膵 β 細胞は、ホルモンのインスリンを分泌増加の血中グルコース濃度に対応します。Β 細胞の機能不全は、高血糖と、生命を脅かす深刻な結果に します。Β 細胞が生理学的な条件の下で動作する方法とどのような遺伝および環境要因は彼らの機能不全を引き起こす可能性があります理解することは、糖尿病患者のためのより良い治療の選択肢に 。Β 細胞中のカルシウム濃度を測定する能力は、カルシウム イオン トリガー インスリン放出の流入としての β-細胞機能の重要な指標として機能します。ここで GCaMP6s、カルシウムの遺伝的コード化センサーを用いたゼブラフィッシュ β 細胞のグルコース刺激性カルシウム流入を監視するためのプロトコルについて述べる。メソッドは、単一セルの解像度ex vivoマウント島で細胞内カルシウム動態を監視できます。内同じ膵島 β 細胞のグルコース応答をキャプチャできます同時に別グルコース濃度下でゼブラフィッシュ β-細胞間の機能的多様性の存在を示唆しています。さらに、技術は、グルコース刺激によるカルシウム流入の振動の性質を明らかにする高い時間的・空間的解決を提供します。我々 のアプローチは、モデルとしてのゼブラフィッシュを使用してベータ細胞の機能と機能障害に遺伝および環境要因の貢献を調査する扉を開きます。

上記で説明したプロトコルを使用して 45 日後受精 (dpf) ゼブラフィッシュから島の β 細胞のグルコース応答を行った。このため、主な膵島 euthanized 動物から切開し、ガラス底皿にフィブリノーゲン-トロンビン金型にマウントされています。小島は 5 mM グルコースを含む HBSS に没頭していた。グルコース濃度は、10 mM と 20 mM を段階的に増加しました。Β 細胞のグルコース濃度を上げるレスポンスを記録しました。最後に、ベータ細胞は 30 mM KCl (図 1) を使用して脱分極されました。KCl を使用して脱分極は、健康なベータ細胞のカルシウム エントリを誘導します。
フィジーおよびデータ解析ソフトウェアを使用して、個々 の β-細胞の GCaMP6s の蛍光強度は抽出し、正規化 (図 2)。蛍光強度のトレースから見ると、個々 の β 細胞はグルコース刺激による、KCl 刺激を停止する GCaMP6s 蛍光性の振動を表示します。テクニックは、その機能に β 細胞のグルコース応答ウィンドウ携帯電話の解像度を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> 図 1:前のヴィヴォライブ イメージング カルシウム流入ゼブラフィッシュ β-細胞の GCaMP6s を使用しています。Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); から主な島Tg(ins:GCaMP6s)ゼブラフィッシュ (45 dpf) がフィブリノーゲン-トロンビン金型でマウントされ、5 mM (基底) グルコースと孵化させます。GCaMP6s 蛍光は緑のチャンネルにある β 細胞は赤い核マーカーと標識しました。小島は、グルコース ランプの 10 mM と 20 mM D-グルコースとシーケンシャルの孵化から成る刺激と 30 mM KCl。 矢印マークその活動を行った個々 の β-細胞の脱分極します。<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> 図 2: GCaMP6s 蛍光強度 - 個々 の β-細胞のトレースを正規化します。正規化された GCaMP6s 蛍光強度 - のトレース図 1の矢印でマークされた β-細胞。X 軸は、時間 (秒) を示します。上部のバーは HBSS 中グルコースと KCl の濃度を表しています。Y 軸は、タイム シリーズの間に正規化蛍光強度を示します。このため、基準強度 (F0) は 5 mM グルコースで孵卵中平均強度として計算されます。これは全体の時系列データから減算 (F ・ F0)。セルに表示される最大の強度によって強度の基準を正規化 (F ・ F0)/(F最大- F0)。正規化されたトレースは、グルコース、30 mm KCl 細胞が脱分極するときに安定化する β 細胞の振動応答を示しています<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets at JoVE.com

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Β 細胞機能カルシウム流入の遺伝的コード化の記者を使用して単一セルの解像度で評価される血糖値の恒常性に重要です。

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K ビュー.  TU Dresden. Β 細胞機能カルシウム流入の遺伝的コード化の記者を使用して単一セルの解像度で評価される血糖値の恒常性に重要です。

ビデオ: Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

生物学

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

ゼブラフィッシュランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウムイメージングを用いた β-細胞機能の解析

要約

さらに動画を探す

この動画の章

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

高解像度全マウント

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

要約

さらに動画を探す

この動画の章

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

高解像度全マウント

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

ゼブラフィッシュランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウムイメージングを用いた β-細胞機能の解析