Name: chromatin immunoprecipitation (chip) of histone modifications from saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2017-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

著者は、役に立つ議論のため緑のラボのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、NIH の補助金 R03AG052018 と E.M.G. に R01GM124342 によって部分で支えられました

1. 事前バインド磁性ビーズに抗体
<ol>
	<li>タンパク質 A/G 磁気ビーズを混ぜるし、磁気ビーズ 1 つ免疫沈降 (IP) サンプルごとの 20 μ L を 1.5 mL チューブに転送します。 注: ときにビーズをピペッティング ワイド口径、低維持のヒントを使用します。</li>
	<li>マグネット スタンドにビーズとチューブを置き、側管の収集にビーズを許可します。上澄みを除去します。</li>
	<li>冷たいトリス緩衝生理食塩水 (TBS) (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM の NaCl) 1 mL にビードを 3 回洗浄しなさい。</li>
	<li>ビーズと抗体の適切な量に TBS の 200 μ L を追加します。4 ° C で一晩 8 rpm で回転します。 注: 多くのヒストン翻訳後修飾抗体抗体 IP あたり 1-3 μ g で十分です。ただし、滴定の実験は適切な濃度を判断する推奨されます。よ特徴付けられた、商業ヒストン翻訳後修飾抗体の推奨濃度は多いが正確とパブリッシュされたレポートや製品資料で見つけることができます。</li>
	<li>マグネット スタンドにビーズを配置し、上清を除去します。TBS の 1 mL で洗浄し</li>
	<li>IP サンプルあたり TBS の 20 μ L 加え、TBS の (ピペッティングのエラー) の場合追加 5 μ のビードを再停止しなさい 注: ビーズ格納できます 4 ° C で短期的な使用まで。</li>
</ol>
2 酵母を育てる
<ol>
	<li>適切なひずみの単一コロニー YPD (10% 酵母エキス、ペプトン 20%、20% ブドウ糖) 10 mL を接種して 220 rpm で揺れのインキュベーターで一晩 30 ° C で成長します。</li>
	<li>600 の光学濃度を測定分光光度計を用いた酵母培養の nm (外径600)。外径600文化を希釈 100 mL 新しいフラスコ YPD に 0.2 を =。</li>
	<li>中間ログ フェーズに達するまで 220 rpm で揺れのインキュベーターで 30 ° C で細胞を成長 (外径600 = 0.6 0.8)。</li>
</ol>
3生体内でタンパク質が DNA に架橋。
<ol>
	<li>文化が中間ログ段階に達したら、1% のホルムアルデヒドの最終的な集中のための媒体に直接 37% ホルムアルデヒドの 2.7 mL を追加します。25 の ° C (または温度) シェーカーにフラスコを転送し、15 分間 50 rpm で振る。</li>
	<li>メディアに 2.5 M のグリシンの 5 mL を追加し、ホルムアルデヒドを癒やすための 5 分間室温で 50 回転で振動を続けます。</li>
	<li>ボトルを遠心し、スピン 4 ° C で 5 分間 5800 x g でセルにセルを転送します。上清をデカントします。
	<ol>
		<li>冷たい TBS の 45 mL に再それらによってセルを洗浄し、懸濁液を 50 mL の円錐管に移します。4 ° C で 3 分間 2800 x g でチューブをスピンします。上澄みを除去します。</li>
		<li>風邪の 10 mL のセル換散バッファー (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、塩化ナトリウム 1% ノニデット オクチル phenoxypolyethoxylethanol (NP-40)、4 ° C で保存) のチップを洗ってください。</li>
		<li>4 ° C で 3 分間 2800 x g でセルをスピンします。上澄みを除去します。 注: セルが液体窒素で凍結、さらに処理まで-80 ° C で保存します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 酵母溶解液を作る
<ol>
	<li>1 mM 特異フッ化物 (PMSF) コールド チップ換散バッファーの 1 mL と酵母プロテアーゼ阻害剤カクテルの縮尺希釈で細胞を再懸濁します。懸濁液をガラス製のビーズの 200 μ L を含む 2.0 mL スクリュー キャップ チューブに転送します。</li>
	<li>4 ° C で高速撹拌装置を破ってビードにセルを転送し、ビーズが 30 の 6 回をビート s 各。氷を破って各ビード間少なくとも 1 分の上細胞を保ちます。</li>
	<li>ライセートのヒントなゲルを使用して 1.5 mL チューブに転送します。ライセートの 4 ° C で 20 分 15,500 × g で遠心分離します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、250 μ L の MNase 消化バッファーでペレットを再懸濁します (10 mM トリス塩酸 pH 7.5、10 mM の NaCl、3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1 %np-40、4 ° C で保存) によって上下に軽くピペッティングします。</li>
	<li>MNase の 2.5 μ L を反応に追加します。反転で優しく混ぜる 4-6 回とすぐに 20 分の 37 ° C の水浴で孵化させなさい。 注: MNase の新しい在庫を使用する場合、ダイジェスト条件を最適化する必要があります。プロトコルについて、手順 10 を参照してください。</li>
	<li>すぐに反応を停止し、0.5 M の EDTA を最終濃度 10 mM EDTA を 5 μ l 添加氷にチューブを置きます。逆解析による優しく混ぜます。</li>
	<li>4 ° C で 15 分間 15,500 x g で反応を遠心し、上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。 注: 水溶性 (消化) クロマチンは上清になります。ペレットには、何か未消化と不溶性の細胞の残骸が含まれています。</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) ヒストンの修正
<ol>
	<li>ブラッドフォードの試金を使用して各 MNase にリリースされたクロマチン フラクションのタンパク質濃度を決定します。各 8 ディスポーサブルキュベットに加えて、テストする各蛋白質のサンプルの 1 追加キュベットにブラッドフォード試薬 1 mL を追加します。
	<ol>
		<li>2 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) の原液を準備します。</li>
		<li>ブラッドフォード試薬 1 mL に BSA の下記の濃度を達成するために適切なボリュームを追加: 0 μ g/mL、0.5 μ g/mL、1 μ g/mL、2 μ g/mL、4 μ g/mL、6 μ g/mL、8 μ g/mL、10 μ g/mL。追加のキュベットに MNase にリリースされたクロマチンの端数の 2 μ L を追加します。</li>
		<li>パラフィルムの小片をそれぞれキュベットの上部をカバーし、4-6 回キュヴェットを反転ソリューションをよく混合します。キュベット 15 分間室温で孵化させなさい。</li>
		<li>595 で吸光度を測定可視光分光光度計を使用して標準曲線と実験サンプルの nm。 注: 使用する BSA のないキュベット (0 μ g/mL) 空白の最初の測定を取る前に分光光度計。</li>
		<li>分光光度計に関連するソフトウェアや表計算ソフトに BSA の異なる濃度の吸光度値を使用して標準の曲線をプロットします。標準曲線と使用希釈倍率 (レバレッジ) に基づき、各クロマチン一部サンプルの蛋白質の集中を計算するのに吸光度の値を使用します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>各 IP MNase にリリースされたクロマチン画分から 1 mL の最終的なボリュームに到達するチップ換散バッファーに総蛋白の 50 μ g を追加します。 注: ライセートあたり 1 つ以上の IP を設定する場合、ライセートのマスター ミックスを作る、チップの換散バッファーと IP の個々 のチューブに分注 1 mL。</li>
	<li>入力のサンプルとして処理する IP ミックスから 100 μ L を削除します。-20 ° C で入力サンプルを凍結手順 7.1 まで。 注: 任意の残りのクロマチンのサンプルも-20 ° C で凍結して使用できる後の IP のため必要な場合。</li>
	<li>あらかじめ各 IP サンプルに抗体と結合タンパク質 A/G の磁性体ビーズ 20 μ L を追加します。</li></ol>3 h (標準) の 8 回転でサンプルを回転または、4 ° C で (優先) する場合は一晩

6. IPs を洗浄し、ヒストン-DNA 複合体の溶出
<ol>
	<li>マグネット スタンドに管を配置し、ビーズ、チューブ側を収集します。ピペットを使用して上清を除去します。1 mL 以下のバッファーの連続してビード洗浄しなさい。
	<ol>
		<li>4 ° C で 5 分間 8 回転で回転、マグネット スタンドにビーズを置いて、培養上清を除去し、次のバッファーを追加する各洗浄を実行: 2 x - チップの換散バッファー、2 x - 高塩洗浄バッファー (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、500 mM の NaCl、1 mM EDTA、4 ° C で保存されている 1 %np-40)、1 x - LiCl/洗剤洗浄バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、250 mM LiCl、1 mM EDTA、1 の np-40、デオキシ コール酸ナトリウム 1%、4 ° C で保存)、1 x - TE (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 ミリメートルの EDTA、4 ° C で保存)、および 1 x - テ。</li>
		<li>最後のテ洗うと TE の 0.5 mL を使用してチューブを洗浄し、残りのビーズを転送テ、別 0.5 mL、ビーズのほとんどを転送する新しいチューブにビーズを転送します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>たてチップ溶出バッファー (1 %sds、1 mM NaHCO3) の 250 μ L を追加します。渦ソリューションを簡単に。室温で 15 分間 8 回転でサンプルを回転させます。</li>
	<li>マグネット スタンドにチューブを置き、ビーズを収集します。慎重に上清を新しいチューブに転送し、ビーズを避けてください。 注: 溶出液には、免疫沈降されたタンパク質と関連する DNA が含まれています。</li>
	<li>ビーズにチップ溶出バッファーの別の 250 μ L を追加します。室温で 15 分間 8 回転でサンプルを回転させます。</li>
	<li>慎重に最初の溶出を含むチューブに上清を転送します。必要に応じて、ビーズを妨害を避けるためにすべての ip アドレスの小さいボリューム (240 μ L) を削除します。</li>
</ol>
7. 逆蛋白質・ DNA クロスリンク
<ol>
	<li>入力サンプルを解凍し、チップ溶出バッファーの 400 μ L を各入力に追加します。</li>
	<li>両方の入力と IP サンプル、反転またはチューブをフリックしても 20 mg/mL, プロテイナーゼ K ミックスの 12.5 μ L、5 μ L 20 mg/mL グリコーゲンの NaCl 5 M の 20 μ L を追加します。65 ° C の水浴のサンプルを一晩インキュベートします。</li>
</ol>
8. 浄化し、DNA を集中
<ol>
	<li>入力と IP サンプル 10 Mg/ml の RNase A の 10 μ L を追加します。30 分の 37 ° C の水浴中サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>水溶液中にフェノール: chlorofrom:isoamyl アルコール (25:24:1 PCI) の 600 μ L を追加し、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g でそれらを回しなさい。
	<ol>
		<li>新しい管へ水の層を削除します。PCI の 600 μ L を追加し、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g でチューブをスピンします。水層を新しいチューブに転送します。 注意: ヒューム フードにし PCI を使用するときに適切な保護具を着用します。制度のガイドラインの指示に従って、液体および固体廃棄物を処分します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 M 酢酸ナトリウムと、DNA を沈殿させる冷たい 100% エタノール 1 mL 0.1 x ボリュームを追加します。4-6 回チューブを反転ソリューションをよく混合します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
	<ol>
		<li>4 ° C で 20 分 15,500 x g でチューブをスピンします。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。</li>
		<li>冷たい 70% エタノール 1 mL にペレットを洗浄します。4 ° C で 10 分間 15,500 x g でスピンします。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。</li>
		<li>(乾燥) するまで約 20 分のためのフードのペレットを風乾します。ヌクレアーゼ フリー水の 50 μ L で IP サンプルを再懸濁します、ヌクレアーゼ フリー水の 100 μ L の入力サンプルを再懸濁します。QPCR を実行するまで-20 ° C で DNA サンプルを格納します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 量的な PCR (qPCR) 濃縮ゲノム領域を検出するには
<ol>
	<li>プライマーの各セットの qPCR マスター ミックスを行います。2 x qPCR ミックスの 5 μ L、20 μ M 前方プライマー 0.25 μ、20 μ M 逆プライマーの 0.25 μ L 反応 1 つにはが含まれます。 注: 適切なプライマー設計と qPCR の実験用のテスト解説他14,,1516。</li>
	<li>各 DNA のサンプルの DNA マスター ミックスを作る。1 つの反作用には 0.5 μ L DNA にはヌクレアーゼ フリー水の 4.0 μ L が含まれています。</li>
	<li>QPCR 384 ウェル プレートの各ウェルに適切なプライマーのマスター ミックスの 5.5 μ L と適切な DNA のマスター ミックスの 4.5 μ L を追加します。 注意: 各ウェルにプライマー ミックスの 5.5 μ L を追加することから始まります。4.5 μ L の DNA ミックスを追加する前に、室温で 1 分 200 x g でプレートをスピンします。</li>
	<li>プレートと室温で 1 分 200 x g でスピンするシールを遵守します。</li>
	<li>QPCR リアルタイム qPCR システムを使用して次の条件を実行: 95 ° C、3 分。40 サイクル 95 ° C の 10 s、55 ° C、30 秒;融解曲線 65 ° C ~ 95 ° C 0.5 の ° C ずつ、5 s。</li>
	<li>各プライマー、qPCR で使用されている 5% の入力サンプルを基準にして IP サンプルのパーセントの入力を計算します。技術的な PCR トリプリケートの手段を使用して、計算を実行します。 注: かどうか実質的な変動が観察される PCR トリプリケートのマスター ミックス組成、ピペッティング エラーおよび 384 ウェル プレートで井戸間の交差汚染に注意を払って qPCR を繰り返すことをお勧めします。<ol>
		<li>生の Cq 値から希釈倍率を表すサイクル数を減算することによって 100% への入力の Cq 値を調整します。 注: 5% 入力は 20 倍、= 4.32 サイクル (2 20 = 4.32 を記録) の希釈倍率を表します。</li>
		<li>2 入力のパーセントを計算 ^ (Cq入力- CqIP) を乗じた。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. MNase ダイジェスト条件 (推奨する前に最初完全な半導体素子実験) を決定します。
<ol>
	<li>4.4 前のプロトコルを介して 2.1 の手順に従います。十分なクロマチンを含むペレットの MNase 消化の複数のサンプルのライセートを生成するプロトコルをスケール アップします。4.4 ステップで MNase 消化バッファーの 1.25 mL にペレットを再懸濁します。5 サンプル管のように各因数には MNase 消化バッファーで再停止されるクロマチン ペレットの 250 μ L が含まれます。</li>
	<li>追加 0、1.5、2.5、5 μ L MNase の各管に。反転で優しく混ぜる 4-6 回とすぐに 20 分の 37 ° C の水浴のチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>すぐに氷の上管を配置し、0.5 M の EDTA を最終濃度が 10 mM の場合の 5 μ L を追加することによって反応を停止します。</li></ol>逆解析によるソリューションを優しく混ぜます。
	<li>4 ° C で 15 分間 15,500 x g でチューブを遠心し、上清を新しい 1.5 mL チューブに転送。</li>
	<li>SDS を最終濃度 1% (10% 原液の 25 μ L) と NaHCO3 0.1 M 最終濃度 (1 M 原液の 25 μ L) 1.5 mL チューブのサンプルに追加します。</li>
	<li>20 mg/mL プロティナーゼ K の 12.5 μ L、5 μ L のグリコーゲン、NaCl 5 M の 20 μ L を 1.5 mL チューブにサンプルに追加します。65 ° C でそれらを一晩インキュベートします。</li>
	<li>10 mg/mL RNaseA の 10 μ L を追加します。37 ° c 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>水溶液中に PCI の 300 μ L を追加し、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g で回転します。
	<ol>
		<li>新しい管へ水の層を削除します。PCI の 300 μ L を加え、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g で回転します。水層を新しいチューブに転送します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 M 酢酸ナトリウム (通常 〜 30 μ L) と、DNA を沈殿させる冷たい 100% エタノール 1 mL 0.1 x ボリュームを追加します。4-6 回チューブを反転によく混ぜます。-80 ° C 1 時間または-20 ° C でチューブを一晩インキュベートします。
	<ol>
		<li>4 ° C で 20 分 15,500 x g でチューブをスピンします。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。</li>
		<li>冷たい 70% エタノール 1 mL にペレットを洗浄します。4 ° C で 10 分間 15,500 x g でスピンします。</li>
		<li>ペレット フード約 20 分 (または完全に乾燥するまで) を空気乾燥させてください。ヌクレアーゼ フリー水の 30 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ローディングの染料の DNA を追加し、2% アガロースゲルの 20 μ L を実行を可視化するゲルは DNA を消化します。</li>

<ol>
	<li>Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Own+Adventure:+The+Role+of+Histone+Modifications+in+Yeast+Cell+Fate.">Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate.</a> J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+combinatorial+functions+of+histone+modifications.">Signals and combinatorial functions of histone modifications.</a> Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Solomon, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Paf1+complex+is+required+for+histone+H3+methylation+by+COMPASS+and+Dot1p:+linking+transcriptional+elongation+to+histone+methylation.">The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation.</a> Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).</li><li>South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+methyltransferase+Set1+is+involved+in+maintenance+of+ergosterol+homeostasis+and+resistance+to+Brefeldin+A.">H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A.</a> P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).</li><li>Margaritis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+repressive+mechanisms+for+histone+3+lysine+4+methylation+through+promoting+3'-end+antisense+transcription.">Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).</li><li>Jezek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferases+Set5+and+Set1+have+overlapping+functions+in+gene+silencing+and+telomere+maintenance.">The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance.</a> Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).</li><li>Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2p+and+Sas2p+opposingly+regulate+acetylation+of+yeast+histone+H4+lysine16+and+spreading+of+heterochromatin.">Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin.</a> Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).</li><li>Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+gradient+of+histone+acetylation+established+by+Sas2p+and+Sir2p+functions+as+a+shield+against+gene+silencing.">Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing.</a> Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明したプロシージャ免疫沈降による酵母細胞の変更されたヒストンに関連付けられている DNA の効率的な復旧できます。これはローカル濃縮を決定する対象領域または特定のヒストンの修正の枯渇を増幅するプライマーを使用して qPCR が続きます。ほぼ 20 年前メソッドとして開発されているにもかかわらずチップのまま異なるゲノム領域で、多様な条件下でのヒストン変更状態を調?...

ヒストンの動的の翻訳後修飾 (PTM) は、転写、複製、DNA 修復1,2を含む多くの dna のプロセスに対して重要な規制メカニズムです。豊かさと変更されたヒストン併用、これらのプロセスの正確な局在を決定する機能がセルに異なる条件の下で、規制を理解したがって欠かせません。主茎では、DNA 蛋白質の相互作用の生化学的研究から特に体外法化学塗料の硬化剤、方法としてクロマチン免疫沈降 (チップ) の開発を評価する必要性と相まって、蛋白質 DNA 相互作用の体内とゲノム3,4、5の特定の領域での動的な性質。(QPCR) の量的な PCR とシーケンス テクノロジーの進歩もチップ実験で DNA 蛋白質の相互作用を解剖するための強力なツールとなって全体のゲノムの定量的な比較を実行する能力を拡大しています。複数のレベル。
現在、チップはゲノムのクロマチン パミンに興味を持って、研究グループの必要なメソッドとして変更されたヒストンおよび特定の genomic 位置の間で物理リンクに直接問い合わせることに匹敵するメソッドがないです。vivo。さまざまな科学的な質問の規模、コスト、これらのアプローチがアドレスがありますゲノム6,7中のヒストンの修正をマップする次世代シーケンシングを使用してこのメソッドのバリエーションはありますが、テクニカル リソースは、いくつかの研究グループの制限があります。さらに、対象となるチップ qPCR はこれらを補完するために必要な方法で両方を提供することによってアプローチを最適化チップ プロトコル シーケンスの前に、エピゲノムのデータセットの結果を検証します。質量分析法に基づくアプローチ8,9,10,11, をただし、浮上してもゲノム領域に関連付けられているマークがあるヒストンの完全な補完を識別するこれらアプローチに関するゲノムの領域を検出できる、技術的な専門知識と研究のすべてのグループに使用できなくなります計装を必要といくつかの制限があります。したがって、チップは豊かさとエピジェネティクス、クロマチンとゲノム機能の制御に興味があるすべての研究グループの多様な条件下でのヒストンの修正の分布を分析するための基本メソッドです。
ここでは、出芽酵母を用いたチップ モデル酵母 (出芽酵母)クロマチンでヒストン Ptm の分布を調査する手法について述べる。このアプローチは、酵母を開発し、多様なモデル システム12,13にも適用チップ プロトコルのコア コンポーネントの数に依存します。変更されたヒストンと DNA、細胞間の相互作用は、ホルムアルデヒドで架橋によって保持されます。次の試薬、クロマチン フラグメントによって可溶性に均一サイズの断片にミクロコッカスヌクレアーゼで消化。商業やラボで生成された抗体、変更されたヒストンの免疫沈降を実行され、任意の関連付けられた DNA を分離して、qPCR (図 1) を使用して特定のゲノム領域で濃縮を分析します。多くのヒストンの修正、この議定書から得られた DNA の量は qPCR で 25 以上の異なるゲノム遺伝子をテストするため十分です。
このチップ メソッドは、汎用性の高い複数の変異株や環境条件は、1 つのヒストン修飾の分布を監視または野生型細胞ゲノムの遺伝子の数で複数のヒストンの修正をテストするためです。さらに、プロトコルの多数のコンポーネントは、いずれか高いまたは卑しい-豊富なヒストンの検知を最適化するために容易に調節可能。最後に、出芽酵母で変更されたヒストンのチップを実行する他のシステムで主に使用される抗体の特異性の主要なコントロールを使用する機会を提供します。すなわち、酵母に変更、対象とヒストンの残基の点突然変異を運ぶ生成され、いくつかのケースでは、のみ特定のヒストン残渣の変更を促進する単一酵素 (e.gヒストンのリジン。メチル化酵素)。したがって、チップは、いずれか、ヒストン変異体や酵素削除系統程度抗体の非特異的結合が発生して偽陽性の結果を生成する可能性がありますを試金する実行できます。このコントロールは、新しく開発された抗体、特に貴重なも他のシステムで、使用前に保存されたヒストン修飾の抗体の特異性を検証に使用することがあります。このアプローチは、(モノ-、ジ -、tri-メチル化) などの別の修正状態の間で区別する抗体の特異性をテストするのには他の方法を補完する変更されたペプチドの配列をプローブとヒストンの西部のしみの実行を含むまたは定義された変更とヌクレオソーム。全体的にみて、出芽酵母におけるチップはヒストン Ptm ゲノム全体のダイナミクスを評価して、その調節を支配するメカニズムを解剖する有力な手法であります。

<table><tbody><tr><td>Yeast Extract</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20025-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P20250-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>ThermoScientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12007-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoScientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>Equivalent to NP-40</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20899-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoScientific</td><td>AC413271000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Amresco</td><td>M107-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>Yeast protease inhibitor cocktail</td><td>VWR</td><td>10190-076</td><td></td></tr><tr><td>25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol</td><td>VWR Life Science</td><td>97064-824</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>VWR</td><td>100720-992</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004797</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>ThermoScientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P50220-0.1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Bradford Assay Reagent</td><td>ThermoScientific</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BSA Standard 2 mg/mL</td><td>ThermoScientific</td><td>23210</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H4</td><td>EMD Millipore</td><td>04-858</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H4K16ac</td><td>EMD Millipore</td><td>ABE532</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H3K4me2</td><td>Active Motif</td><td>39142</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;High Rox qPCR Mix</td><td>Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix</td><td>ACC-PR2000-L-1000</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G Magnetic Beads</td><td>ThermoScientific</td><td>88803</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stand for 1.5mL tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-21359</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Washed Glass Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Microtube Homogenizer</td><td>Benchmark</td><td>D1030</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763837-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-288</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-476-476</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>384-Well PCR Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-1384W</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Gyratory Floor Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model G10</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) of histone modifications from saccharomyces cerevisiae

アセチル化、メチル化、リン酸化などの翻訳後修飾ヒストン修飾 (Ptm) は、一連のセルによって受信した信号への応答でこれらのマークの削除を追加または酵素によって動的に調整されます。これらの PTM が遺伝子発現制御などのプロセスの規則への主貢献者および DNA 修復します。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、豊かさとセルに多様な摂動に対してゲノム全体にわたって多くのヒストン Ptm のローカリゼーションを解剖するため手段アプローチをされています。ここでは、出芽酵母酵母 (出芽酵母)からファーストクリーニング変更されたヒストンのチップを実行するための汎用性の高いメソッドを説明します。このメソッドはホルムアルデヒド治療イースト文化の DNA やタンパク質の架橋結合に依存しているミクロコッカスヌクレアーゼ、によってクロマチン フラグメントの可溶化とヒストン DNA の免疫沈降を破って、ビーズで酵母溶解液の生成複合体。興味のヒストン マークに関連付けられている DNA は、精製は、ゲノム全体の複数の座位で濃縮を評価する定量的 PCR 分析を受けます。野生型と変異酵母ヒストン マーク H3K4me2 と H4K16ac の局在化を探る代表的な実験、データ分析と解釈を示す説明します。このメソッドは、さまざまなヒストン Ptm に適していて、異なる突然変異系統またはそれに異なる条件下でのクロマチン動態の変化を調査するための優れたツールを作り、多様な環境ストレスの存在下で実行できます。

このプロトコルの 1 つの主要コンポーネントは、ステップ 10 で説明したよう、可溶性フラグメントにクロマチンを消化するために使用ミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) の濃度が最適化されます。これは興味のゲノム領域でのヒストンの修正の分布に関する高解像度データを取得するため重要です。MNase 滴定は、主にモノラル-ヌクレオソーム クロマチンの可溶性画?...

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR 豊かさとゲノム全体ヒストン翻訳後修飾のローカリゼーションを調査する使用されます。

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-histone-modifications-from

Universidad de Cartagena UDEC

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Molecular Biology

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

12.6K ビュー.  University of Maryland. ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR 豊かさとゲノム全体ヒストン翻訳後修飾のローカリゼーションを調査する使用されます。

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

遺伝学

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription factors (TFs), chromatin regulators, and histone modifications, as well as detecting entire genomes for uncovering TF binding patterns and histone posttranslational modifications. Chromatin-modifying activities, such as histone methylation, are often recruited to specific gene regulatory sequences, causing localized changes in chromatin structures and resulting in specific transcriptional effects. The rice blast is a devastating fungal disease on rice throughout the world and is a model system for studying fungus-plant interaction. However, the molecular mechanisms in how the histone modifications regulate their virulence genes in Magnaporthe oryzae remain elusive. More researchers need to use ChIP-seq to study how histone epigenetic modification regulates their target genes. ChIP-seq is also widely used to study the interaction between protein and DNA in animals and plants, but it is less used in the field of plant pathology and has not been well developed. In this paper, we describe the experimental process and operation method of ChIP-seq to identify the genome-wide distribution of histone methylation (such as H3K4me3) that binds to the functional target genes in M. oryzae. Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.

マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

酵母細胞からの遺伝子座特異的クロマチン単離

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

著者スポットライト:高濃縮遺伝子座特異的クロマチン単離プロトコルによるクロマチン研究の進展と制限の克服(英語) 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

生化学

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

神経科学

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

生物学

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

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