私たちは、原稿上の有用修正、議論とコメントのT.Stürnerに感謝しています。 SL Zipurskyフライ株式を提供します。画像処理を行うMSchölling。画像解析部は、A.柿田の研究室で行いました。この作品は、革新的な分野でのスタートアップのためのアレクサンダー・フォン・フンボルト財団と日本学術振興会親睦海外研究（AS）、JSPSフェロー（SH-S。）、グラント・イン・エイド（24800024）、（25110713）、持田によってサポートされていました武田、稲盛、第一三共、東レ財団（TS）、DZNEコア資金（GT）とDZNE光学顕微鏡施設（CM）。

このプロトコルに記載の実験手順は、もっぱらショウジョウバエで動作することを含む、ドイツと日本の動物福祉法に供されていません。 1.露光条件<ol><li>感光体R8ニューロン（R8s）にBRP-GFPを視覚化するためのsensless-フリッパーゼ （SENS-FLP）とbruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP（BRP-FSF-GFP）15を運ぶハエを準備します。細菌人工染色体（BAC）内のゲノム遺伝子座をコードするBRPは、このBRP-FSF-GFP構築物を作製するために変更されました。この修正されたBACを運ぶハエではBRP-GFPの発現は、内因性調節配列の制御下にあるが、FRT-STOP-FRTカセット15のsensless-フリッパーゼ媒介除去後R8の光受容体に限定されます。 SENS-FLPはほとんどR7sでフリッパーゼを発現しないことに注意してください。 </li><li> 12時間の李にハエを保ちます幼虫の段階から羽化（ 図1A）まで25℃でGHT / 12時間暗サイクル（LD）。 </li><li>羽化後6時間とフライ食品を含む新しいバイアルに入れます - ハエに0を収集します。 </li><li> 3段階（41センチメートルの高さは21センチベース、4センチメートルの厚さと各ステップ13センチ高さ）（ 図1B）とアクリル樹脂製の透明ラックにバイアルを設定します。 </li><li>デジタル露出計（ 図1C）を使用して、千ルクスの平均強度で照明を提供するために、ラックとLEDパネル間の距離を調整します。 </li><li>小さなインキュベータ（ 図1（a）に25℃で12時間明/ 12時間暗サイクル（LD）、または一定の光（LL）、一定の暗闇（DD）：次のいずれかの条件の下で3日間- 1のためのハエを保ちますおよび1C）。 </li></ol> 2.解剖、免疫組織化学およびイメージング<ol><li> FO 4％で固定し、鉗子でハエの脳を解剖Chaoptinに対する一次抗体（1：50）と、前の実験手順25に基づいて、光受容体の可視化のための第二の抗体とrmaldehydeと免疫染色。簡単に言えば： <ol><li> PBS中の0.1％トリトンX-100（0.1％PBT）を準備します。この溶液を、抗体、組織浸透を改善するために使用されます。 </li><li> 、CO 2パッドの上にハエを麻酔正しい遺伝子型を分類し、0.1％のPBTで満たされたペトリ皿に移します。 </li><li>口先の下に鉗子を固執し、他の鉗子でそれぞれ左右の眼をやってのけます。 </li><li>口先と脳に取り付けられた気管を削除します。 </li><li> RTで0.1％PBTの150μLを含む1.5 mLのチューブに鉗子で脳を転送します。 </li><li> 2.1.3 10分間の反復内 - 2.1.5、できるだけ多くの脳を得ました。 </li><li>チューブに16％ホルムアルデヒドの50μLを加え、ピペッティングにより混合します。 </li><li>部屋で固定液に脳をインキュベート50分間温度。 </li><li>チューブで脳を残すように注意を払って、マイクロピペットで0.1％PBTの200μLで3回洗浄します。 </li><li>最後の洗浄後、0.1％のPBTを削除して、一次抗体溶液を追加し、以下のように調製：0.3％PBT（PBS中0.3％トリトンX-100）抗Chaoptin抗体の4μL（最終希釈1の196μLに追加：光受容体の可視化のための50）。 </li><li> 4°CO / Nで一次抗体溶液中で脳をインキュベートします。 </li><li>マイクロピペットで0.1％のPBTの200μLで洗浄3倍。 </li><li>最後の洗浄後、0.1％のPBTを削除し、二次抗体を含む0.3％PBTの200μLを追加します。 </li><li> 4°CO / Nで暗所でそれをインキュベートします。 </li><li>マイクロピペットで0.1％PBTの200μLで3回洗浄します。 </li></ol></li><li>取り付けのために、約2センチDISTAで顕微鏡スライドの中央にマイクロピペットでマウンティング培地（2μLずつ）二つの小さな滴を入れて互いにNCE。 </li><li> 2カバースリップ、各液滴の上に1を置き、約0.2ミリメートルのカバースリップとの間の狭い隙間を残します。 </li><li>カバースリップの上に取り付けメディアの15μLを置き、マウンティング培地中にマイクロピペットで脳を追加します。 </li><li>解剖顕微鏡下では、最大2つのカバースリップ（ 図2）との間の狭い隙間に腹側と脳を配置。 </li><li>上にカバースリップを置き、試料（ 図2）を固定するための明確なマニキュアを使用してカバースリップの端をシールします。 </li><li>共焦点顕微鏡を用いて脳の画像を得ます。 63X油浸対物レンズ（1.4 NA）と2.6倍デジタルズームを使用してください。 0.5μmのステップサイズを有する第2の視神経節髄質の20以上の光学切片を生成します。 </li></ol>スポット、Surfaceオブジェクト、開始点と終了点の3世代<ol><li> 、競合製品の数を定量化するために、ibutionとBRP-GFPの涙点の非局在化レベルは、画像解析ソフトウェアで、共焦点顕微鏡により得られた積層体を開き、3D画像（ 図3A）を再構成します。この研究におけるステップはIMARISで行われたことに注意してください。 </li><li>各R8の軸索末端のためのスポット検出モジュールによってBRP-GFPの斑点を特定します。 <ol><li> 「新しいスポットを追加します」を選択します。 </li><li>アルゴリズムの設定で「利息のセグメント領域のみ」を選択します。手動髄質におけるR8の軸索末端を選択します。 </li><li> BRP-GFP信号のソースチャンネルを選択します。 注：R7およびR8光受容体の軸索は、抗Chaoptin（ 図3A）で免疫標識しました。唯一のR8は、しかし、BRP-GFPの斑点が含まれているので、簡単に（ 図3A）区別することができました。さらに、R8のエンドポイントは、M3の髄質層へのエントリポイントで抗Chaoptin陽性軸索の間伐によって同定することができました。 </li><li>推定XY径トンを設定します。スポット検出中のO 0.35ミクロンとオフチェック「バックグラウンド減算」。 </li><li>フィルタタイプに「品質」を選択し、自動的にフィルタリングします。 [完了]をクリックします。 </li><li>他のR軸索（ 図3B）のために3.2.1 T-3.2.5から繰り返します。 </li></ol></li><li> R8の軸索にBRP-GFPの非局在化のレベルを測定するために、各軸索のための「表面」機能（ 図3C）で表面オブジェクトを生成します。 <ol><li> 「新しいサーフェスを追加」を選択します。 </li><li>アルゴリズムの設定で「利息のセグメント領域のみ」を選択します。その後、手動で髄質にR8の軸索終末を選択します。 </li><li>光受容体のソースチャンネルを選択します。 </li><li> 「スムーズ」をオフを確認してください。 </li><li>しきい値に「絶対強度」を選択します。 </li><li>チェック「有効にします」。 「シードポイントの直径は「0.5μmです。 </li><li>フィルタタイプ「品質」と「ボクセルの数」を選択し、電話交換をフィルタリング的。 </li><li> 「編集」に移動し、他の非興味深い軸索上に生成表面の部分を削除します。 </li><li>他のR軸索（ 図3C）のために3.3.8 - 3.3.1から繰り返します。 （注）一部の表面オブジェクトがあるため薄さとM2層における光受容体で弱い信号の中断されたが、それらはまだ開始されてからエンドポイントへの単一のオブジェクトとして考えられました。 </li></ol></li><li>延髄の神経網内の各ニューロンに沿っBRP-GFPの涙点の分布を特定するために、測定ポイント機能（ 図3D）との始点と終点を定義します。 <ol><li> 「新しい測定ポイントを追加」を選択します。次に、「編集」を選択し、表面オブジェクトの上部と交差するように、「物体の表面 &quot;を選択します。 </li><li>ために、M1層におけるR軸索の表面オブジェクトの上に測定点を置きます。これらは、現在の開始点（ 図3D）として定義されています。 </li><li> 「新しい測定ポイントを追加」を選択します。次に、「編集」を選択し、表面オブジェクトの底部と交差するように、「物体の表面 &quot;を選択します。 </li><li>ために、M3層におけるR軸索の表面オブジェクトの底に測定点を置きます。これらは現在、エンドポイント（ 図3D）のように定義されます。 </li></ol></li><li> GFPチャネルからのバックグラウンド信号を減算するには、M6層（ 図3E）における二つのR軸索のための表面オブジェクト、スポット、開始点と終了点を生成。 <ol><li> 「新しいサーフェスを追加」を選択します。 </li><li>アルゴリズムの設定で「利息のセグメント領域のみ」を選択します。その後、手動でM5とM6層との間にR7の軸索末端を選択します。 </li><li>感光体のソースチャンネルを選択します。 </li><li> 「スムーズ」をオフを確認してください。 </li><li>しきい値に「絶対強度」を選択します。 </li><li>フィルタタイプ「品質」と「ボクセルの数」を選択し、自動的にフィルタリングします。 </li><li> 「新しいスポットを追加する」を選択;。 </li><li> 「手動で編集し、自動作成をスキップ」を選択します。 </li><li> 「オブジェクトのセンター」を選択し、3.5.1から発生する表面オブジェクトの内側の領域にスポットを追加 - 3.5.6。 </li><li>別のR7の軸索端末用3.5.9 - 3.5.1から繰り返します。 </li><li> 「新しい測定ポイントを追加」を選択します。次に、「編集」を選択し、M6層でのR7の軸索終末の先端の2つの表面のオブジェクトの上に測定点を置きます。これらは今、スタートポイントとして定義されています。 </li><li> 「新しい測定ポイントを追加」を選択します。次に、「編集」を選択し、M6層でのR7の軸索終末の先端の2つの表面のオブジェクトの底に測定点を置きます。これらは現在、エンドポイント（ 図3E）として定義されます。 </li></ol></li></ol>スポットの数の4計算、カスタマイズされたイメージデータ解析ソフトウェアでスポット周波数とBRP-GFPの濃縮のレベルの分布<ol><li>ファイルをコピーしますIMARIS XT MathWorks社のMATLABフォルダに「XtquantifySynapseSNR.m」と「機能」のフォルダ。この研究における計算はMatlabので実装カスタマイズされたプラグインを使用して行われたことに注意してください。ウェブサイト（からプラグインをダウンロードしてください<a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ）。 </li><li> n個のスポット、nは表面および2測定点オブジェクト、（ - 3.4 3.1から調製）をそれぞれ含むn個の測定点でデータセットを開きます。最初の測定ポイントオブジェクトは、すべての軸索の開始位置を定義します。第二の測定点オブジェクトは、すべての軸索の終了位置を規定します。両方の測定点オブジェクトは、測定点の数が同じ（すなわち、軸索の数である）を有する必要があります。 </li><li> 6対シナプス検出atsushis画像処理&gt;&gt; CUSTOM&gt;を実行します。 </li><li>画像解析ソフトウェアのメタデータと変更ピクセルサイズをチェックし、それが正しくない場合。 </li><li> perfのためのチャンネルを選択しますスポット領域および細胞質領域の強度解析（BRP-GFPを有するチャネル）のormance。 </li><li>結果をエクスポートするためのファイル名を定義します。 </li><li>パーセントでビンと軸索の長さの数を定義します。 「10」と「100％」（ 図4Aおよび4B）などのビンの範囲としてビンの数を入力します。 </li><li> BRP-GFPの非局在化分析のためのスポットや他の細胞質領域の領域を定義します。スポットは、「0.35ミクロン」と「50ミクロン」として周辺エリアの幅と半径を入力します。スポット半径は（1涙点を中心に0.35μmの直径、）涙点のGFPシグナルのための領域を定義します。周辺エリアの幅は、細胞質領域（涙点を中心に直径50μm、が、唯一のR8を含む細胞質内のすべてのスポット領域を除く）（ 図4Aおよび4C）にGFPシグナルのための領域を定義します。 </li><li>すべてのニューロンのマスクが処理されるまで待ちますPDFファイル（ 図4Bおよび4C）と、スプレッドシートのさらなる分析のためのcsvテーブルとしてエクスポート。 CSV形式の表には、スポットの数、「細胞質領域」とすべてのR8の軸索のための各ビンに「スポット」での最大信号強度の平均信号強度を含んでいます。 </li><li>バックグラウンド信号の減算に3.5で調製したデータセットを開きます。 </li><li> 4.9から4.3から説明したように画像処理を行います。 </li><li>合計数の平均とスプレッドシート（ 図4Dおよび4E）でBRP-GFPの涙点の分布を計算します。 </li><li>バックグラウンド信号に平均強度を差し引いた「スポット」で最大強度で割った「細胞質領域」における平均強度の比によってスプレッドシートのBRP-GFPシグナルの非局在化の平均値を計算する（ 図4F） 。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

本研究では、同じ光強度にハエを公開するために、光の条件を準備する方法を示しました。我々だけでなく、シナプスマーカーの涙点の数を定量化しただけでなく、空間的に軸索に沿ってシナプスの密度を解決し、細胞質領域におけるマーカータンパク質の非局在化のレベルを測定することができます。これらの三つの評価は、私たちは、異なる環境条件での単一ニューロンレベルでのシナ?...

<html>シナプス機能の変調が正確に応答したり、環境刺激の変化に適応するための神経系の顕著な能力に貢献しています。前シナプス小胞の放出確率を調整すると、シナプス強度1を制御する 1つの方法です。シナプス小胞のリリースでは、アクティブゾーン（AZ）、シナプス前膜2の専門領域で起こります。 AZは、特定のタンパク質3、4のカセットことを特徴としています。 AZアセンブリに貢献し、ほとんどのタンパク質は非常に線虫、昆虫および哺乳類5に保存されています。最近の研究では、神経活動のレベルは今度は両方のin vitroおよびin vivo 6,7 における機能出力のレギュレーションに寄与するAZの分子組成を調節することを示唆しています&gt; 8。我々は以前、感光体AZSは、自然環境光9への長期曝露後に、ショウジョウバエの分子リモデリングを受けることがわかりました。この状態で、我々はBruchpilot（BRP）陽性AZSの数は、感光体の軸索で減少したことを観察しました。 BRP / CAST / ELKSファミリータンパク質は、脊椎動物と無脊椎動物のシナプス10でAZSの基本的なビルディング・ブロックです。 ショウジョウバエのBRP変異体では、小胞の放出は11、12を抑制されている誘発。 BRPの17 C末端アミノ酸残基は、 ショウジョウバエの神経筋接合部（NMJ）13、14におけるシナプス小胞のクラスタリングのために不可欠です。これらの研究は、AZの組織と機能におけるこの分子の中心的な役割を実証しました。最近開発された遺伝的ツール、組換えとシナプスタギング（スター）、BRPと内因性発現レベルで単シナプス解像度15において、特定の細胞型にインビボで観察することができます。このツールは、それが実現可能な定量的に複雑な中枢神経系におけるシナプスの内因性のダイナミクスを評価することができます。 共焦点顕微鏡から得られたデータに基づいて、シナプスの定量化を含むいくつかの研究が行われています。シナプスの変化は、長さ、面積、体積、密度を測定し、洗練されたソフトウェアアプリケーションに基づいて数をカウントすることによって評価されています。例えば、フリーウェアImageJがショウジョウバエ NMJ 16における全シナプスの面積とシナプス密度を測定するための定量方法を提供します。前と後シナプスマーカーの共局在部位の数は、ImageJソフトウェア・プラットフォーム17上で利用可能なプラグイン「涙点アナライザ」を用いて定量化されています。また、マルチパーadigm数値計算環境ベースのプログラム、シナプス検出器（SYND）は、自動的に蛍光マーカーで標識されたニューロンの樹状突起をトレースし、その後細胞体18からの距離の関数としてシナプスのタンパク質レベルを定量化することができます。ソフトウェアシナプス点分析（SynPAnal）は、共焦点または蛍光顕微鏡から取得したニューロンの2D画像の迅速な分析のために設計されています。このソフトウェアの主な機能は、タンパク質涙点19の密度と強度の自動かつ迅速な定量化です。最近、自動学習ベースのシナプス検出アルゴリズムは、3D可視化支援分析（Vaa3D）ソフトウェア21を利用して、3次元20におけるシナプス数の定量のために生成されています。 商業用画像解析ソフトウェアは、シナプスの定量化のための強力なツールです。例えば、蛍光標識された神経伝達物質受容体またはシナプス前AZコンポーネントは、Cの単一シナプスの分解能で3次元で定量化されたシナプスの数百人が急速に単一のサンプル内で特徴づけることができるように、22またはショウジョウバエの嗅覚システム23、24 エレガンス 。 ここでは、カスタマイズされた画像解析ソフトウェアプラグインその数、分布との分子成分の濃縮のレベルを含む、半自動的にAZSの複数の側面を分析することを可能にするマルチパラダイム数値コンピューティング環境において実施することにより方法を提示しますAZ。したがって、この複雑な解析は、私たちは、異なる環境条件下で軸索終末におけるシナプスのコンポーネントの動態を評価することができました。私たちは、大人のハエ光受容体の出力シナプスでの露光量の影響を調べました。手順は3つのステップで行われる：1）露光量、2）切開、免疫組織化学及び共焦点イメージング、および3）画像解析のための準備。

<table><tbody><tr><td>Vial</td><td>Hightech, Japan</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>Plug</td><td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>Customized transparent rack made of acrylic resin&amp;nbsp;</td><td>Shin-Shin Corporation, Japan</td><td></td><td>a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step</td></tr><tr><td>Cool incubator</td><td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japan</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>LED panel</td><td>MISUMI, Japan</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>Digital light meter</td><td>CEM</td><td>DT-1301</td><td></td></tr><tr><td>Fly pad</td><td>Tokken, Japan</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 x 10 mm)</td><td>Greiner Bio-One International, Germany</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablet</td><td>Takara, Japan</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, Japan</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tube</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 16%</td><td>NEM, Japan</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>anti-chaoptin antibody</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-conjugated anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide (76 x 26 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. &amp;amp; Co. KG, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)</td><td>Zeiss, Germany</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial Microscopes</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope Lighting</td><td>Olympus, Japan</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscopy</td><td>Zeiss, Germany</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, Switzerland</td><td></td><td>Version 7.6.4 or above</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel for Mac&amp;nbsp;</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing synaptic modulation of drosophila melanogaster photoreceptors after exposure to prolonged light

神経系には適応し、様々な刺激に応答する驚くべき能力を持っています。この神経調整は、主に、シナプスレベルでの可塑性によって達成されます。アクティブゾーン（AZ）は、神経伝達物質の放出を媒介し、足場タンパク質の密なコレクションで構成されているシナプス前膜の領域です。 キイロショウジョウバエ （ ショウジョウバエ ）光受容体のAZSは、自然環境光に長時間さらさ後の分子リモデリングを受けます。したがって、神経活動のレベルは、AZの分子組成を再配置し、機能出力の調節に寄与することができます。 免疫組織化学への露光セットアップの準備から出発し、このプロトコルは番号、空間分布、およびショウジョウバエの光受容体でAZSでのシナプス分子の非局在化のレベルを定量化する方法について詳しく説明します。画像解析SOFを使用してtware、GFP融合AZコンポーネントBruchpilotのクラスタは、各R8感光体（R8）軸索末端のために同定されました。検出されたBruchpilotスポットは自動的に個々のR8の軸索に割り当てられていました。軸索に沿ったスポット頻度の分布を計算するために、我々は、カスタマイズされたソフトウェアのプラグインを実装しました。各軸索の始点と終点を手動で定義し、各Bruchpilotスポットの位置は、始点と終点の間の接続線に投影されました。 Bruchpilotクラスタの数に加えて、我々はまた、クラスタ内のBruchpilot-GFPの非局在化のレベルを定量化しました。これらの測定は、具体的に刺激に異なる環境条件の下で単一ニューロンにおける空間分解シナプスのダイナミクスを反映しています。

ショウジョウバエの複眼は〜780個眼、光受容体のそれぞれを含む8種類（R1-8）を含みます。 R7およびR8プロジェクト、彼らは層M6とM3、それぞれ26でシナプスを形成する第二の視神経節、髄質、への軸索。感光体R8、アクティブなゾーンの分子組成上の光への長期曝露の影響を調べるために、我々は、星の方法15を利用しました?...

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Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

ここでは、光への長期曝露後に遺伝的にコードされた分子マーカー、およびそれらの調節で強調、数およびキイロショウジョウバエ の光受容体におけるシナプスアクティブゾーンの空間分布を定量化する方法を示しています。

のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

6.5K ビュー.  Niigata University. ここでは、光への長期曝露後に遺伝的にコードされた分子マーカー、およびそれらの調節で強調、数およびキイロショウジョウバエ の光受容体におけるシナプスアクティブゾーンの空間分布を定量化する方法を示しています。 

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Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

シナプス電位のChannelrhodopsin2仲介刺激でショウジョウバエ神経筋接合部

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

生物学

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

に自然免疫とサーカディアン規制Photobehaviorを勉強する光プアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

神経科学

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

生化学

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

ショウジョウバエ光受容体の光色素レベルを測定するための電気生理学的方法

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

ショウジョウバエの幼虫フォトタキスの分析のための光スポットベースアッセイ

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Investigating Prolonged Depolarizing Afterpotential (PDA) in Drosophila Photoreceptors

Source: Gutorov, R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63514">Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates an experimental protocol to investigate the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) in white-eyed Drosophila. The fly&#39;s eye is exposed to intense blue light pulses to convert the photopigment rhodopsin to metarhodopsin, initiating a signaling cascade that opens positive ion channels and causes membrane depolarization. Because blue light prevents the reconversion of metarhodopsin to rhodopsin, the continuous influx of positive ions results in sustained depolarization, known as the prolonged depolarizing afterpotential (PDA).

ショウジョウバエの光受容体における長期にわたる脱分極性残電位(PDA)の調査

1. Measuring the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) using the electroretinogram

	Suitable rearing conditions for Drosophila melanogaster ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Stimulation and Modulation Techniques

Synaptic Modulation in Drosophila After Exposure to Prolonged Light

Source: Sugie, A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55176">Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light.</a> J. Vis. Exp. (120)
This video demonstrates the rearing of Drosophila melanogaster under specific light conditions to study the role of Bruchpilot proteins in neurotransmitter release and the resulting modulation of synaptic activity.

長時間の光への曝露後のショウジョウバエのシナプス調節

1. Light Exposure Conditions

	From the larva stage until eclosion, keep the flies in a 12 h light/12 h dark cycle (LD) at 25 &#176;C (Figure 1A).
	...

Analyzing Synaptic Vesicle Recycling and Fluorescent Dye Uptake in Drosophila Larvae

Source: Kopke, D. L., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57765">FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a protocol to study synaptic vesicle recycling at neuromuscular junctions in channelrhodopsin-expressing Drosophila larvae using a fluorescent dye. Blue light activates the channelrhodopsins, causing calcium influx and synaptic vesicle exocytosis. The dye integrates into the neuronal membranes and is internalized during endocytosis, resulting in enhanced fluorescence. Further blue light stimulation induces exocytosis and dye release, which is shown by reduced fluorescence.

ショウジョウバエ幼虫におけるシナプス小胞のリサイクルと蛍光色素の取り込みの解析

1. Larval Glue Dissection

	Thoroughly mix 10 parts of silicone elastomer base with 1 part of silicone elastomer curing agent from the elastomer kit ...

のシナプス変調を分析

要約

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シナプス電位のChannelrhodopsin2仲介刺激でショウジョウバエ神経筋接合部

に自然免疫とサーカディアン規制Photobehaviorを勉強する光プアッセイ

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法

ショウジョウバエ光受容体の光色素レベルを測定するための電気生理学的方法

ショウジョウバエの幼虫フォトタキスの分析のための光スポットベースアッセイ

ショウジョウバエの光受容体における長期にわたる脱分極性残電位(PDA)の調査

長時間の光への曝露後のショウジョウバエのシナプス調節

ショウジョウバエ幼虫におけるシナプス小胞のリサイクルと蛍光色素の取り込みの解析