S. r. バジーレは、欧州連合によって共同資金を供給 Cancro (AIRC) ラ Ricerca スルあたり Associazione イタリアーナで交わりによって支えられました。さらに、このプロジェクトはから資金を受けて欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラム マリアスクウォドフスカ キュリー付与契約の下でない 660200 (s. r. バーリョ) に。

間葉系幹細胞の隔離のための人間の脂肪組織は、機関の倫理委員会で承認後 Tergooi 病院 (ヒルフェルスム, オランダ) のプラスチック外科から得られ、同意します。GFP 陽性脂肪 MSCs 子供と大人 (大学のモデナとレッジョ ・ エミリア) 医学と外科学から得られました。
動物実験を行った動物実験は、オランダ法に基づき、プロトコルは VU 大学医療センター, アムステルダム, オランダの動物実験委員会によって承認されました。
1. 腫瘍分泌細胞小胞の分離。
<ol><li>70,000 x g 一晩で FBS (16 時間)、4 ° c 超スイング バケツ ローターなしのブレーキを遠心分離によって EV 枯渇胎仔ウシ血清 (FBS) を準備 (減速 1 h を期待する)。慎重にペレットを乱すことがなく清 (EV 枯渇 FBS) を収集します。0.22 μ m のフィルターで EV 枯渇 FBS をフィルター処理します。</li>
	<li>100 の U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、2 mM グルタミン Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) を補うことで EV 枯渇培養培地を準備 (1 P/S/G x) と 5 %fbs の EV 枯渇します。</li>
	<li>175 cm2フラスコで 3 x 10 の6 143B セルをシードし、37 ° C、5% CO2でインキュベーターでの培養液の EV 枯渇にそれらの文化します。細胞は (通常後 48 h に 36 h) 80-90% の合流を EV 免 8 x 175 cm2フラスコ (28 mL/フラスコ) からの上清を収集します。</li>
	<li>あらかじめ差動遠心分離の (以前スピンするたびに上清を遠心分離) によると、次のプロトコルによって細胞と細胞の残骸を削除する細胞上清をクリアします。<ol>
<li>10 分間 500 x g で 2 回上清を遠心します。</li>
		<li>15 分間 2000 x g で 2 回上清を遠心します。</li>
		<li>30 分間、10,000 × g で 2 回上清を遠心します。</li>
		<li>最大加速度と減速速度設定 4 ° C ですべての遠心を実行します。各手順の後約 1 mL を残して、EV を含む上清を慎重に収集します。手順 1.5 またはストアに事前認可エアコン-80 ° c 媒体 EV 分離まですぐに進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 時間 70,000 x g で一度にクリアランス済みエアコンの中を遠心分離で EVs を分離、4 ° c 超スイング バケツ ローターを用いた超遠心分離機管 (最終巻 38.5 mL/チューブ) で、ブレーキをゆっくり。</li>
	<li>慎重に残りのボリュームで EV を含むペレットを再懸濁しますが後ろに約 1 mL を残して上清を削除、それらをすべて 1 つの遠心管のプールおよび完全なチューブ充填までリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の追加 (最終巻 38.5 mL)。</li>
	<li>ブレーキなしの 4 ° C で 1 時間もう一度 70,000 × g で遠心分離 (減速 1 h を期待する)。慎重にペレットを乱すことがなく上澄みを除去し、100-200 μ L を残します。</li>
	<li>EV ペレットを再懸濁し、(すべて EV 隔離の標準化) PBS で 200 μ L に最終的な音量を調整します。EV の準備をすぐに使用または使用22まで-80 ° C で保存します。 注: EVs に格納できる-80 ° C で 6 ヶ月</li>
</ol>2. EV の特性。
透過電子顕微鏡 (TEM)23によって精製された EVs を視覚化できます。
<ol><li>リン酸バッファーの 4% のパラホルムアルデヒドの等量とミックス EV preps。</li>
	<li>コート 200 メッシュ ホルムバール カーボン被覆ニッケル TEM グリッド室温で 20 分間 EV を懸濁液 5 μ L です。</li>
	<li>0.1 M リン酸緩衝液 (7.0)、シュウ酸ウラニル (pH 7.0) とは対照的に 1% グルタルアルデヒドで TEM グリッドに EV サンプルを固執し、氷の上比は 1:9 4% ウラニル、2% の酢酸メチル セルロースの混合物に埋め込みます。</li>
	<li>ステンレス ループを持つグリッドを削除およびメチル セルロース フィルムの適切な厚さを確保するためフィルター ペーパーで余分な水分をしみ。</li>
	<li>乾燥後、電子顕微鏡でグリッドを確認し、対応するイメージ ソフトウェアと結合したデジタル カメラで画像をキャプチャします。</li>
</ol>3. 腫瘍由来の EVs で MSCs の教育。
<ol><li>4 %ev 枯渇ひと血小板ライセート (hPL)24ヘパリン (10 U/mL) 1 とアルファ最小値必要な媒体 (アルファ MEM) を補うことで MSC の培養液の準備 P/S/G. x 注: EV 枯渇 hPL は、1.1 節で説明されている手順に従って取得されます。</li>
	<li>シード 1.4 x 106 75 cm2フラスコあたりの脂肪由来 MSCs と培地の EV 枯渇 MSC-37 ° C で 5 %co2 インキュベーターでそれらを文化します。</li>
	<li>ときセルを追加 143B 骨肉腫-70% の合流点に到達、またはひと線維芽細胞 (hf) を制御-10 μ L EV 準備/cm2の培養用フラスコ、EVs。24 時間インキュベートし、付加的な 6 時間の EVs の同じ量を追加します。注: 線維芽細胞培養ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) で 10 %fbs および EVs はセクション 1 で説明したように分離されます。</li>
	<li>MSC 上澄みを集め、1 x (最大加速度と減速速度設定) の 4 ° C で 5 分間 500 × g で遠心分離機、新しいチューブに移し、-80 ° c 将来サイトカイン解析 (セクション 5) を有効にするオフ上清を保存します。</li>
	<li>体内の実験 (セクション 6) 教育 GFP 陽性 MSCs25 3.3 3.1 のセクションで説明したように、細胞を収集し、注入まで氷の上 100 μ L。 保持細胞あたり 10 の6セルの最終的な集中に PBS でそれらを再懸濁します。</li>
</ol>4. EV 内面化の試金。
MSCs によって EV 吸収を可視化、次の製造元のプロトコル (市販) リンカー緑色蛍光色素 (GFLD) の Ev をラベルします。
<ol><li>簡単に言えば、200 μ L EV 準備に希釈液 180 μ L を追加します。GFLD 色素希釈の 50 μ L での 1 μ L を希釈し、希釈の EV 準備に色素希釈の 20 μ L を追加します。</li>
	<li>軽くピペッティングで混ぜるし、暗闇の中で部屋の温度で 3 分間インキュベートします。</li>
	<li>PBS で 0.1 %bsa の 5 mL を追加、超遠心分離管に移し、PBS (最終巻 38.5 mL/チューブ) と管を埋めます。</li>
	<li>遠心ブレーキなしの 4 ° C で 1 時間 70,000 × g で 1 x (減速 1 h を期待する)。慎重に上澄みを除去し、200 μ L の最終巻でラベル付けされた EV ペレットを再懸濁します (PBS でボリュームを調整)。</li>
	<li>MSC 文化にラベル付きの EVs を追加または-80 ° C で保存一晩インキュベートした後蛍光顕微鏡による小胞内面を評価し、フローサイトメトリー7の流れ。</li>
</ol>5. MSC サイトカイン発現の評価。
<ol><li>インターロイキン 8 (IL-8) の多重の定量化, インターロイキン 1 β (il-1)、インターロイキン 6 (IL-6)、インターロイキン 10 (IL-10)、腫瘍壊死因子 (TNF)、MSC のインターロイキン-12 p 70 (IL-12 p 70) タンパク質レベル完備媒体 (手順 3.4 を参照) を使用して、製造元の指示に従う人間の炎症性サイトカインの市販フローサイトメトリーによるビーズの配列 (CBA)。</li>
	<li>簡潔に、キャプチャの標識抗体ビーズをミックスし、すべてのアッセイ チューブにそれらを追加します。サイトカイン標準希釈液の調製やエアコンの中のサンプルをチューブに追加します。</li>
	<li>検出試薬を追加し、室温 3 時間インキュベート</li>
	<li>付属の洗浄ソリューションでビーズを洗浄します。流れの cytometer を使用してサンプルを測定し、製造元の指示に従ってデータを分析します。</li>
</ol>6. 骨肉腫の同所性同種異種移植マウス モデルの世代。
<ol><li>慣らす実験の手順を開始する前に、少なくとも 1 週間に 6 週齢では、女性の無胸腺ヌード Foxn1nu マウスを許可します。</li>
	<li>1 日前手術に、と周術期鎮痛法としては、飲料水にパラセタ モールを追加します。「子供のためパラセタ モール ソリューション」を希釈 (材料の表を参照) を最終濃度 2 mg/mL の水で。150 mL/kg の平均水摂取量に基づいて/日、20 g の平均体重、この用量は 6 mg の投与量に達する/マウスに十分な/日 (300 mg/kg/日)。</li>
	<li>術後、あるいは長い動物は痛みの兆候を示す場合の 24 時間まで鎮痛治療を継続します。</li>
	<li>手術の日、10 分 300 × g で遠心分離によってルシフェラーゼ正 (流) 143B 細胞 (レンチ ウイルス伝達によって以前に生成) を収集し、PBS で 2 x 10 の5細胞/μ L の濃度で細胞を再懸濁します。6 時間を氷の上細胞懸濁液を維持します。</li>
	<li>オートクレーブ手術用機器。準備し、作業領域をきれいに滅菌ハサミとピンセット滅菌シート上に配置。手術の手順 (手順 6.8) の前に 20 分皮下ブプレノルフィン (0.05 mg/kg、0.9% 生理食塩水で希釈した) との 0.5 mL インスリンは注射器 (29 g 針) を使用して鎮痛剤として動物を注入します。</li>
	<li>それぞれの動物を麻酔直前集中 (流) 143B 細胞懸濁液の少なくとも 1 μ L で 10 μ L のシリンジを入力 (手順 6.4 を参照)。</li>
	<li>イソフルレン吸入麻酔 (酸素の 2-3%) と動物を麻酔します。つま先は、動物を締めつけることにより、麻酔のレベルを確認します。動物がすなわち、麻酔が深くつまんでに反応しないときは、麻酔中の乾燥を防ぐために目に軟膏を塗る。</li>
	<li>麻酔マスクで頭とオペレーターに向かって足背中に動物を配置します。左の膝を屈曲します。70% アルコールで皮膚を拭くし、綿先端が 3 倍の局所麻酔薬リドカイン (2%) を適用します。</li>
	<li>滅菌手術用のナイフを使用して、脛骨を公開する膝のすぐ下の皮膚に小さな切開 (約 5 mm) を作る。脛骨、0.8 mm のマイクロ ドリルを使用して膝の下約 2 mm のピンホールをドリルします。両方の脛骨の皮質ドリルスルーはがれる恐れがあります。</li>
	<li>26 ゲージの針を使用して穴にゆっくりと (約 5 秒) で 1 μ L 細胞懸濁液 (約 2 x 10 の5セル) を挿入します。懸濁液の逆流を防止する組織接着剤の液滴と穴を閉じます。</li>
	<li>モノフィラメント縫合糸と組織接着剤の一滴で肌を閉じます。よく加熱された環境 (熱ランプを使用) で動物の回復をしましょう。放置しないでください動物まで胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しています。動物が完全に麻酔から回復後に、のみ、自分のケージに戻します。</li>
	<li>腫瘍接種後 2 日間注入教育 EV または素朴な GFP 陽性 MSCs (100 μ L の pbs は、10 の6セルは、ステップ 3.5 を参照)、マウスの尾静脈で 0.5 mL インスリン注射器で静脈内投与。</li>
	<li>腫瘍の成長を生物発光イメージングの26週二回に続きます。このため、150 μ L でマウス i. p. を注入 D-ルシフェリン (30 mg/mL) をインスリン注射器。注入後、10 分生物発光イメージング システムに動物を配置し、腫瘍細胞によって生成される光束を測定します。</li>
	<li>また、キャリパーと骨腫瘍の直径を測定します。(Mm3) の腫瘍体積は、長さ2 × 0.5 × 幅によって推定されます。</li>
	<li>注記: 人道的エンドポイントは腫瘍径として定義されます > 15 mm や減量 > 15%。</li>
</ol>7. 肺結節数の評価
<ol><li>動物の 1 つ (約 3-4 週間) でステップ 6.14 で定義される人道的エンドポイントに達すると、実験を終了して収集し、すべての関連する組織を分析します。</li>
	<li>Euthanization、前に 10 分を 150 μ L 注入 D-ルシフェリン (30 mg/mL) を 0.5 mL インスリン注射器。</li>
	<li>イソフルレン吸入麻酔と動物の麻酔 (手順 6.7 を参照してください)。つま先ピンチにマウスの反応の欠如によって麻酔の深さを確認します。頚部転位27でマウスを安楽死させます。</li>
	<li>肺、肝臓、脾臓、腎臓滅菌ハサミとピンセットを使用してを収集します。血のトレースを削除し、シャーレに入れて PBS で臓器を洗います。</li>
	<li>生物発光イメージング システムの臓器とペトリ皿を配置します。器官の両側発光信号を測定します。測定後すぐに将来の組織学的解析の 4% ホルマリン (24-72 時間、RT) をじっと見つめることで臓器を突入します。</li>
	<li>手動閾値処理によって適切なイメージング ソフトウェアを使用して得られた写真を処理します。各画像上肺結節の数をカウントします。肺の両側肺結節の合計数をカウントします。</li>
</ol>8. 組織学的解析
<ol><li>肺組織の組織学的解析。<ol>
<li>パラフィンのホルマリン固定臓器を埋め込み、6 μ m 組織スライドを準備します。</li>
		<li>Deparaffinate 肺組織はスライドし、それらを 0.01 M クエン酸バッファー (pH 6) で 15 分間煮沸して抗原検索を実行します。</li>
		<li>抗ビメンチン抗体 (200 μ G/ml) 希釈 1: 150 抗体希釈液 (市販) でと、HRP 標識二次抗体 (0.5 mg/mL、希釈 1: 500) その後室温で水平方向にスライドを孵化させなさい。3'-ジアミノベンジジン (軽打) とヘマトキシリン カウンター染色組織を染色します。</li>
		<li>対応するカメラとイメージ ソフトウェアと結合した光学顕微鏡による染色組織スライドを観察します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウス脛骨の GFP 陽性 MSCs の存在を評価。<ol>
<li>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 0.24 M、pH 7.2 7.4 で脛骨をめし。骨が柔軟になる (約 1 週間) まで毎日 EDTA バッファーを更新します。</li>
		<li>脛骨を脱水し、パラフィンとそれらに侵入します。パラフィン ブロックに脛骨 (骨肉腫組織を含む) を埋め込みます。</li>
		<li>ミクロトームを使用して、6 μ m のパラフィン切片を準備します。スライド ガラスの上にパラフィン セクションに配置します。乾燥後、室温で一晩スライドを保存します。</li>
		<li>クエン酸バッファーを使用して熱を介した抗原検索を実行 (8.1.2 を参照) 抗体希釈液で 1:900 希釈の抗 GFP 抗体 (抗血清を全体) と組織を染色します。4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と組織を counterstain します。</li>
		<li>対応する画像処理ソフトウェアと結合した蛍光顕微鏡を用いた組織スライドを観察します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+fetal+bovine+serum+substitute+improves+human+adipose-derived+stromal+cell+culture+for+future+cardiac+repair+applications.">Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications.</a> Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).</li><li>Grisendi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+as+stable+source+of+tumor+necrosis+factor-related+apoptosis-inducing+ligand+delivery+for+cancer+therapy.">Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy.</a> Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).</li><li>Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Saut&#232;s-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence-based+tumor+quantification+method+for+monitoring+tumor+progression+and+treatment+effects+in+mouse+lymphoma+models.">Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Carbone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cervical+dislocation+as+a+humane+euthanasia+method+in+mice.">Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tumor-derived+exosomes+selectively+impair+lymphocyte+responses+to+interleukin-2.">Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2.</a> Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).</li><li>Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+microvesicles+promote+regulatory+t+cell+expansion+and+induce+apoptosis+in+tumor-reactive+activated+cd8++T+lymphocytes.">Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes.</a> J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).</li><li>Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-released+microvesicles+as+vehicles+of+immunosuppression.">Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression.</a> Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Lin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+exosomes+endow+mesenchymal+stromal+cells+with+tumour-promotion+capabilities.">Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities.</a> Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).</li></ol>

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腫瘍分泌細胞小胞 (Ev) は、腫瘍支援環境を生成するローカルと遠隔の間葉系細胞の生理学を変更できます。ここで腫瘍細胞の EV を介した相互作用の郭清ができる骨肉腫のマウスの前臨床モデルの生成について述べるし、間葉系幹細胞 (MSCs)生体内で。ひと腫瘍マウス骨肉腫異種移植片を強く付け EV 教育 MSCs の全身投与は、IL-6/STAT3 シグナリング経路7をアクティブにし?...

腫瘍微小環境は転移巣形成および1の治療に抵抗性の発達を含む腫瘍と癌の進行のすべてではない、ほとんどの面で積極的に参加しています。これは腫瘍のニッチ市場で発生している複雑な腫瘍間質相互作用の郭清ができる臨床同所性同種癌マウス モデルの必要性を強調します。
腫瘍微小環境の多くの細胞コンポーネント間で間葉系幹細胞 (Msc) は強く乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、骨肉腫2 など複数のがんの種類の癌の進行に貢献します。 ,3,4,5,6,7。MSCs は、8,9骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血、およびその他を含むさまざまな成人および胎児組織に存在する多能性幹細胞です。がんによる炎症性シグナルに応答、MSCs は腫瘍のサイトへの移行、腫瘍微小環境に組み込む、最終的に細胞のがんサポート10に分化します。これら癌関連付けられている MSCs は腫瘍の進行腫瘍細胞と周囲間質2,の両方の演技 (すなわち、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、免疫メディエーター) 本質的な要因を提供します。3,11,12,13。 癌関連付けられている MSCs の発癌促進効果が多数癌モデルで検討されてきた中、腫瘍細胞は、癌促進のニッチを形成する MSCs を再プログラムするメカニズムはよく理解され。ここで具体的には細胞小胞 (Ev) を介して骨がん細胞と MSCs の pro 発癌性の相互作用の研究ができる直交異方性異種移植モデルの生成について述べる.
EVs は、腫瘍と間質細胞14細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターです。EVs は、細胞が起源、蛋白質、脂質、規制 Rna などの生体機能分子を運ぶ。これらの小胞周囲の細胞によってとることができる、血液やリンパの循環を介して遠隔部位に運ばれるや標的細胞の行動に深く影響を与える細胞外スペースに解放されて、一度。15,16,17たとえば、間質線維芽細胞による癌 EVs の取り込みがあります myofibroblast 分化血管新生をサポートし、腫瘍成長体内18,19, 内皮細胞によって内面化を加速細胞が腫瘍の血管新生を刺激して血管透過性16,20、増加し、免疫細胞との相互作用は、21抗腫瘍免疫応答の抑制につながる可能性があります。
我々 は最近示した、骨肉腫、腫瘍細胞がプロ発癌性およびプロ転移性表現型を取得する MSCs を促す EVs を多量を解放する発光同所性同種異種移植マウス モデルを用いたします。この効果は MSC サイトカイン発現プロファイル (「MSC 教育」と呼ばれる)、の劇的な変化により、治療インターロイキン 6 受容体 (IL-6 r) 抗体7の管理によって防ぐことができます。私たちの仕事は、がん EVs が骨肉腫の進行を停止する微小環境をターゲットとしたアプローチの理論的根拠を提供、MSC の動作の重要な変調器であることを示した。ここで、EV を介した腫瘍 MSC の相互作用、生体内で調査するステップバイ ステップ プロトコルについて述べる.このモデルは、するものです: 1) 特に腫瘍微小環境におけるがん EV 誘起 MSC の動作変更を定義する、2) 評価に干渉するかどうかこの相互作用が骨腫瘍の成長と転移巣の形成、3) 研究に貢献する方法生体内でEV を介したクロストークは、癌の進行を防ぎます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW32Ti</td><td>Beckman</td><td>369650</td><td>Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor</td></tr><tr><td>Transmission electron microscope</td><td>Zeiss</td><td>EM109</td><td>Or similar TEM</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon</td><td>DMX 1200F</td><td>Or similar camera</td></tr><tr><td>Imaging software TEM&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>ACT-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D2</td><td>Or similar Fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Imaging software FM</td><td>Zeiss</td><td>ZEN Blue</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Nuaire</td><td>4750E</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettick</td><td>ROTANTA 460R</td><td></td></tr><tr><td>-80 Freezer</td><td>Thermo electro corporation</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td>BD FACScalibur</td><td>Or similar flow cytometer</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ferm</td><td>FCT-300</td><td>With 0.8 mm drill</td></tr><tr><td>HSS micro twist drills, 0.8 mm</td><td>Proxxon</td><td>28 852</td><td>0.8 mm drill</td></tr><tr><td>IVIS camera</td><td>Xenogen</td><td>Ivis Lumina</td><td>Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Living image software2.60</td><td>Xenogen / Igor Por</td><td>n.a</td><td>Xenogen is now part of Perkin Elmer</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L Syringe</td><td>Hamilton</td><td>Neuros Model 1701 RN</td><td></td></tr><tr><td>Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm</td><td>Hamilton</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Mitutoyo</td><td>G08004463</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Astell</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Heat Lamp</td><td>Philips</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>RYG35912</td><td></td></tr><tr><td>Platelet Lysate</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>IMDM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-722F</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE02-002F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>pen/strep/glutamine</td><td>GIBCO</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA (10x)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>adipose deriverd MSCs</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>GFP-positive MSCs</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>human fibroblasts</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>143B cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>FLUC-143B cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>Transduced</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Disposables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture flasks 175 cm2</td><td>CELLSTAR</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>Freeze tubes</td><td>Thermoscientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear tubes</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes</td></tr><tr><td>0,22 &amp;micro;m filter</td><td>Millex</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL insulin syringes with 29G Needle</td><td>Terumo</td><td>U-100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P7612</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper&amp;nbsp;</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>50363215</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents / kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Alfa Aeser</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Braun</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>16300</td><td></td></tr><tr><td>uranyl oxalate</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>22510</td><td></td></tr><tr><td>urany acetate</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>methyl cellulose</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td>1560</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>mini67-1kt</td><td>Referred to in the manuscript as GFLD</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CBA - human inflammatory cytokine kit</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37%</td><td>VWR</td><td>104003100</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Steel surgical blades</td><td>Swann-Morton</td><td>206</td><td>Referred to in the manuscript as surgical knife</td></tr><tr><td>anti-human vimentin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>Clone V9</td></tr><tr><td>Antibody diluent</td><td>DAKO</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>HRP-labeled anti mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>32230</td><td></td></tr><tr><td>DAB-kit</td><td>DAKO</td><td>K500711</td><td></td></tr><tr><td>hematoxyllin</td><td>Sigma</td><td>GHS232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-buffer</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Citrate buffer</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>rabbit polyclonal anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>n.a.</td><td>Ab290</td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup</td><td>Bayer</td><td>n.a.</td><td>Sinaspril, paracetamol solution for kids</td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Vumc pharmacy</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml</td><td>Indivior UK Limited</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>lidocaine-HCL 2%</td><td>Vumc pharmacy</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>VWR</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Tissue glue</td><td>Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate</td><td>Vygon</td><td>LB604060</td></tr><tr><td>Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml</td><td>Bausch+Lomb</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin, potassium salt</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Thermo scientific</td><td>630-0954</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel loops&amp;nbsp;</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mice experiments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,&amp;nbsp; female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA</td><td>ENVIGO</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Paper-pulp smart home (cage enrichment)</td><td>Bio Services</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-dri bedding material</td><td>Shepperd Speciality Papers</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet</td><td>ENVIGO</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td>V926H</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>(or similar)</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>(or similar)</td></tr></tbody></table>

a preclinical mouse model of osteosarcoma to define the extracellular vesicle-mediated communication between tumor and mesenchymal stem cells

腫瘍微小環境の内で居住者又は採用した間葉系幹細胞 (MSCs) は、複数のがんの種類で悪性進展に貢献します。特定環境シグナルの影響を受けて、これらの成体幹細胞は加速の腫瘍の成長と転移につながるパラクリン メディエーターを解放できます。腫瘍と MSCs 間のクロストークの定義は、癌の進行のメカニズムを理解し、治療的介入のための新しいターゲットを識別する重要です。
がん細胞標的細胞腫瘍微小環境、遠隔部位の動作に深く影響を与える細胞小胞 (Ev) の大量に生産します。腫瘍の EVs は、炎症性の Rna と間質細胞のがん細胞の転移の特性を高めるためにまたは前転移のニッチ形成に参加することができます教育 (新規) タンパク質を含む生体機能分子を囲みます。この記事で EV を介したクロストーク腫瘍と間葉系幹細胞との間の具体的な評価を可能にする臨床癌のマウスモデルの開発について述べる.まず、浄化と腫瘍分泌 EVs のキャラクタリゼーションと MSCs によって EV 内面の評価について述べる。我々 はそれから作るがん EVs による多重ビード ベース イムノアッセイ MSC サイトカイン発現プロファイルの変化を評価するための使用。最後に、腫瘍 MSC の相互作用を繰り返す骨肉腫の発光同所性同種異種移植マウス モデルの生成を説明し、腫瘍の増殖と転移形成に MSCs を EV 教育の貢献を示します。
私たちのモデルは、がん EVs が腫瘍支援の環境を形づけるかを定義し、腫瘍と MSCs の EV を介したコミュニケーションの封鎖は癌の進行を防止するかどうかを評価する機会を提供します。

本研究では、我々 はプロ発癌性およびプロ転移性表現型に向かって MSCs を教育する骨肉腫分泌される電気自動車の能力を探った。骨肉腫細胞が MSCs によって内在化されているエキソソームのような EVs を解放することを示す.がん、EVs による MSC サイトカイン発現プロファイルの変化を測定し、, EV 教育 MSCs の腫瘍の成長と転移巣形成に及ぼす影響を評価した.研究デザ...

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A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

癌由来細胞の小胞 (Ev) の直噴は骨髄腫瘍進行をサポートのリプログラミングにつながるただし、セルは、この効果を仲介する明確ではありません。ここで、我々 転移の MSCs の EV 教育に重要な役割を明らかに EV を介する腫瘍間葉系幹細胞 (MSC) 相互作用は生体内で、調査するステップバイ ステップ プロトコルをについて説明します。

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

a-preclinical-mouse-model-osteosarcoma-to-define-extracellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.1K ビュー.  VU Medical Center. 癌由来細胞の小胞 (Ev) の直噴は骨髄腫瘍進行をサポートのリプログラミングにつながるただし、セルは、この効果を仲介する明確ではありません。ここで、我々 転移の MSCs の EV 教育に重要な役割を明らかに EV を介する腫瘍間葉系幹細胞 (MSC) 相互作用は生体内で、調査するステップバイ ステップ プロトコルをについて説明します。

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Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains poor when metastasis has occurred. The Cancer Stem Cell (CSC) theory holds that there is a subset of tumor cells within the tumor that have stem-like characteristics, including the capacity to maintain the tumor and to resist multidrug chemotherapy. Therefore, a better understanding of OS biology and pathogenesis is needed in order to advance the development of targeted therapies to eradicate this particular subset and to reduce morbidity and mortality among patients. Isolating CSCs, establishing cell cultures of CSCs, and studying their biology are important steps to improving our understanding of OS biology and pathogenesis. The establishment of human-derived OS-CSCs from biopsies of OS has been made possible using several methods, including the capacity to create 3-dimensional stem cell cultures under nonadherent conditions. Under these conditions, CSCs are able to create spherical floating colonies formed by daughter stem cells; these colonies are termed &#34;cellular spheres&#34;. Here, we describe a method to establish CSC cultures from primary cell cultures of conventional OS obtained from OS biopsies. We clearly describe the several passages required to isolate and characterize CSCs.

The presence of cancer stem cells (CSCs) in bone sarcomas has recently been linked to their pathogenesis. In this article, we present the isolation of CSCs from primary cell cultures obtained from human biopsies of conventional osteosarcoma (OS) using the ability of CSCs to grow under nonadherent conditions.

がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

がん研究

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including osteosarcoma--one of the most frequent primary non-hematologic malignancies in the childhood and adolescence. Therefore, LFS provides an ideal model to study this malignancy. Taking advantage of iPSC methodologies, LFS-associated osteosarcoma can be successfully modeled by differentiating LFS patient iPSCs to mesenchymal stem cells (MSCs), and then to osteoblasts--the cells of origin for osteosarcomas. These LFS osteoblasts recapitulate oncogenic properties of osteosarcoma, providing an attractive model system for delineating the pathogenesis of osteosarcoma. This manuscript demonstrates a protocol for the generation of iPSCs from LFS patient fibroblasts, differentiation of iPSCs to MSCs, differentiation of MSCs to osteoblasts, and in vivo tumorigenesis using LFS osteoblasts. This iPSC disease model can be extended to identify potential biomarkers or therapeutic targets for LFS-associated osteosarcoma.

Here, we present a protocol for the generation of induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) from Li-Fraumeni Syndrome (LFS) patient derived fibroblasts, differentiation of iPSCs via mesenchymal stem cells (MSCs) to osteoblasts, and modeling in vivo tumorigenesis using LFS patient-derived osteoblasts.

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common mutations associated with RMS and allowed discrimination of different RMS subtypes, major challenges still exist for the development of novel treatments to further improve prognosis. Although identified by the expression of myogenic markers, there is still significant controversy over whether RMS has myogenic or non-myogenic origins, as the cell of origin is still poorly understood. In the present study, a reliable method is provided for the tumorsphere assay for mouse RMS. The assay is based on functional properties of tumor cells and allows the identification of rare populations in the tumor with tumorigenic functions. Also described are procedures for testing recombinant proteins, integrating transfection protocols with the tumorsphere assay, and evaluating candidate genes involved in tumor development and growth. Described further is a procedure for allograft transplantation of tumorspheres into recipient mice to validate tumorigenic function in vivo. Overall, the described method allows reliable identification and testing of rare RMS tumorigenic populations that can be applied to RMS arising in different contexts. Finally, the protocol can be utilized as a platform for drug screening and future development of therapeutics.

This protocol describes a reproducible method for isolation of mouse rhabdomyosarcoma primary cells, tumorsphere formation and treatment, and allograft transplantation starting from tumorspheres cultures.

マウス横紋筋肉腫から単離された原発性腫瘍細胞からの腫瘍球誘導と治療

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

遺伝学

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of DNA samples. It is resourceful, requires small amounts of DNA, and takes around 4&#8211;5 h of hands-on work. In the presented technique, DNA samples are first denatured then hybridized to probes that target DNA at either methylated or reference sites as a control. Hybridized DNA is separated into parallel reactions, one undergoing only ligation and the other undergoing ligation followed by HhaI-mediated digestion at unmethylated GCGC sequences. The resultant DNA fragments are amplified by PCR and separated by capillary electrophoresis. Methylated GCGC sites are not digested by HhaI and produce peak signals, while unmethylated GCGC sites are digested and no peak signals are generated. Comparing the control-normalized peaks of digested and undigested versions of each sample provides the methylation dosage ratio of a DNA sample. Here, MSPA is used to detect the effects of osteosarcoma-derived extracellular vesicles (EVs) on the methylation status of long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) in mesenchymal stem cells. LINE-1s are repetitive DNA elements that typically undergo hypomethylation in cancer and, in this capacity, may serve as a biomarker. Ultracentrifugation is also used as a cost-effective method to separate extracellular vesicles from biological fluids (i.e., when preparing EV-depleted fetal bovine serum [FBS] and isolating EVs from osteosarcoma conditioned media [differential centrifugation]). For methylation analysis, custom LINE-1 probes are designed to target three methylation sites in the LINE-1 promoter sequence and seven control sites. This protocol demonstrates the use of MSPA for LINE-1 methylation analysis and describes the preparation of EV-depleted FBS by ultracentrifugation.

Described here is the use of a methylation-specific probe amplification method to analyze methylation levels of LINE-1 elements in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Ultracentrifugation, a popular procedure for separating extracellular vesicles from fetal bovine serum, is also demonstrated.

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival compared to surgery alone. To address this problem, the aim of the study is to refine a lesser-known model of OS in rats with a comprehensive histologic, imaging, biologic, implantation, and amputation surgical approach that prolongs survival. We used an immunocompetent, outbred Sprague-Dawley (SD), syngeneic rat model with implanted UMR106 OS cell line (originating from a SD rat) with orthotopic tibial tumor implants into 3-week-old male and female rats to model pediatric OS. We found that rats develop reproducible primary and metastatic pulmonary tumors, and that limb amputations at 3 weeks post implantation significantly reduce the incidence of pulmonary metastasis and prevent unexpected deaths. Histologically, the primary and metastatic OSs in rats were very similar to human OS. Using immunohistochemistry methods, the study shows that rat OS are infiltrated with macrophages and T cells. A protein expression survey of OS cells reveals that these tumors express ErbB family kinases. Since these kinases are also highly expressed in most human OSs, this rat model could be used to test ErbB pathway inhibitors for therapy.

Here, a syngeneic orthotopic implantation followed by an amputation procedure of the osteosarcoma with spontaneous pulmonary metastasis that can be used for preclinical investigation of metastasis biology and development of novel therapeutics is described.

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival rate of osteosarcoma patients with pulmonary metastasis is less than 30%.Therefore, the utilization of mouse models mimicking the osteosarcoma development in humans is of great significance for understanding the fundamental mechanism of osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis to develop novel therapeutics. Here, detailed procedures are reported to generate the primary osteosarcoma and pulmonary metastasis mouse models via&#160;intratibia injection of osteosarcoma cells. Combined with the bioluminescence or X-ray live imaging system, these living mouse models are utilized to monitor and quantify osteosarcoma growth and metastasis. To establish this model, a basement membrane matrix containing osteosarcoma cells was loaded in a micro-volume syringe and injected into one tibia of each athymic mouse after being anesthetized. The mice were sacrificed when the primary osteosarcoma reached the size limitation in the IACUC-approved protocol. The legs bearing osteosarcoma and the lungs with metastasis lesions were separated. These models are characterized by a short incubation period, rapid growth, severe lesions, and sensitivity in monitoring the development of primary and pulmonary metastatic lesions. Therefore, these are ideal models for exploring the functions and mechanisms of specific factors in osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis, the tumor microenvironment, and evaluating the therapeutic efficacy in vivo.

The present protocol describes intratibia osteosarcoma cell injection to generate mouse models bearing orthotopic osteosarcoma and pulmonary metastasis lesions.

同所性骨肉腫および肺転移マウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...

Isolation and Identification of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and their Derived Extracellular Vesicles

With the development of stem cell therapy in translational research and regenerative medicine, bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs), as a kind of pluripotent stem cells, are favored for their instant availability and proven safety. It has been reported that transplantation of BM-MSCs is of great benefit to repairing injured tissues in various diseases, which might be related to modulating the immune and inflammatory responses via paracrine mechanisms. Extracellular vesicles (EVs), featuring a double-layer lipid membrane structure, are considered to be the main mediators of the paracrine effects of stem cells. Recognized for their crucial roles in cell communication and epigenetic regulation, EVs have already been applied in vivo for immunotherapy. However, similar to its maternal cells, most of the studies on the efficacy of transplantation of EVs still remain at the level of small animals, which is not enough to provide essential evidence for clinical translation. Here, we use density-gradient centrifugation to isolate bone marrow cells (BMC) from porcine bone marrow at first, and get porcine BM-MSCs (pBM-MSCs) by cell culture subsequently, identified by the results of observation under the microscope, induced differentiation assay, and flow cytometry. Furthermore, we isolate EVs derived from pBM-MSCs in cell supernatant by ultracentrifugation, proved by the techniques of transmission electron microscopy (TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and western blotting successfully. Overall, pBM-MSCs and their derived EVs can be isolated and identified effectively by the following protocols, which might be widely used in pre-clinical studies on the transplantation efficacy of BM-MSCs and their derived EVs.

This article elaborates a method to isolate and identify porcine bone marrow mesenchymal stem cells (pBM-MSCs) and extracellular vesicles (EVs) derived from them, providing a methodological basis for the pre-clinical evaluation of transplantation efficacy of BM-MSCs and their derived EVs.

With the development of stem cell therapy in translational research and regenerative medicine, bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs), as a kind of ...

医学

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

要約

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この動画の章

がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックスモデル

マウス横紋筋肉腫から単離された原発性腫瘍細胞からの腫瘍球誘導と治療

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

同所性骨肉腫および肺転移マウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射

Isolation and Identification of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and their Derived Extracellular Vesicles

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

要約

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がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

マウス横紋筋肉腫から単離された原発性腫瘍細胞からの腫瘍球誘導と治療

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

同所性骨肉腫および肺転移マウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射

Isolation and Identification of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and their Derived Extracellular Vesicles

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックスモデル