Name: combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in drosophila
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
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この仕事は基本的な研究プログラムの中国国家 (2012CB825504)、国家自然科学基金、中国の (91232720 および 9163210042)、中国アカデミー科学 (CAS) の (GJHZ201302 および QYZDY SSW SMC015) 部分で支えられましたビルとメリンダ ・ ゲイツY. 朱の ca 財団 (OPP1119434)、および 100 の才能プログラム。

1. 供給区域を準備し
注:染料ラベル供給の試金のため餌の商工会議所は、2 部構成: (カバー) と外のコンテナーと内側 (食物) としてコンテナー。
<ol><li>(31.8 mm の内部の直径) と 80 mm の高さを持つショウジョウバエを培養するためガラスの瓶から外のコンテナーを変更 (図 1 a, 1 C)。餌のセットアップを正しく保つために 1% の agarose (5 mL) の層で容器の底加湿歩く (図 1 b) 時にハエの柔らかい基質として機能でカバー。コンテナーはそれにより最小限のストレスやハエに外乱を運ぶ制御するが、自然主義的な設定を提供します。<ol>
<li>外の容器を準備します。頻繁に撹拌、熱、二重蒸留水を 50 mL の agarose の 0.5 g を中断し、沸騰熱板取付けマグネチックスターラーで完全に溶解します。</li>
		<li>とき約 60 ° C に 1% のアガロース冷却 5 mL の 1% の agarose を空のコンテナー (図 1 b) の外部に転送し、コンテナーは、アガロース パッドを生成するための部屋の温度に冷却するまで開いたまま。</li>
	</ol>
</li>
	<li>食品の色素標識を準備します。染料ラベル食品の組成は、異なった実験目的によって異なります。ショ糖のみを含む色素ラベル食品を準備する例です。<ol>
<li>頻繁に撹拌、熱、二重蒸留水を 50 mL に agarose の 0.5 g を追加し、沸騰熱板取付けマグネチックスターラーで完全に溶解します。</li>
		<li>上記の 1% の agarose を約 60 ° C に冷却、ショ糖の 1.71 g を 100 mM ショ糖を取得するアガロースに追加します。</li>
		<li>アガロース溶液 0.5% (w/v) 色素標識食べ物を得るために青い色素 (erioglaucine ナトリウム) の 0.25 g を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>内部を準備コンテナー。平坦な水平サーフェス上のコンテナー内空を置くし、追加 750 μ L の個々 の食品コンテナーに青い色素ラベル食品では、少なくとも 5 分を固めるせて。 注:内部コンテナーは 13.6 mm の内部の直径と高さ 7.5 mm (図 1 a 1 C) 小さなプラスチックの皿。染料ラベル食品でいっぱいですしては外のコンテナーの agarose パッドの中心に配置されています。</li>
	<li>準備された外のコンテナーにコンテナー内に転送、アガロース パッドのセンターに配置。外容器の壁が結露の無料になるまで 40 分間室温で開いたまま授乳室ができます。 注:乾式壁は、ハエが水滴に連絡して壁に立ち往生しているを防ぐために必要です。</li>
	<li>色素フリー食品と授乳室を準備 (同じ組成なくて染料) バック グラウンド減算。</li>
</ol>2. ハエの準備
注:大人の女性は、5 に 10 日後、羽化は通常使用の試金を餌に飛ぶ。遺伝的コントロールを含む、異なる遺伝子型のハエを準備して並列でテストすることをお勧めします。(1 つの餌箱) から 20 ハエは、1 つのデータ ポイントを生成します。
<ol><li>成虫を飼育の人口密度を検討してください。通常、緊張によると親のハエの数と培養ボトルの寸法を変化させることにより人口密度を制御します。例として、(31.8 mm の直径)、80 mm の高さを持つ文化ボトル 15 男女カントン-S の 30 名に転送させ 1 日それから大人のハエの卵を産む女性。</li>
	<li>Thermogenetic の活性化のためには、ハエを準備します。<ol>
<li>UA dTrpA1 飛ぶ異なる GAL4 ドライバー行 (図 2 b) との交雑による様々 なニューロンの dTRPA133を表現する Gal4/UAS システム38を使用します。</li>
		<li>22 ° C、相対湿度を 60%、12 時間/12 時間の明暗周期で標準的な食品の成虫を維持します。</li>
		<li>アッセイの 2 日前の給餌、並べ替えと生鮮食品のバイアルにステレオ顕微鏡下で CO2フライ パッドのハエを収集およびバイアルあたり 20 ハエの密度を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>光活性化のためには、ハエを準備します。<ol>
<li>別の GAL4 ドライバー行を横断 UA CsChrimson ハエによって CsChrimson36異なるニューロンを表現する Gal4/UAS システム38を使用します。</li>
		<li>新しく (24 h) 内でこのハエを収集し、400 μ M のすべて-トランス-レチナールを含む標準的な食品のバイアルにそれらを転送します。</li>
		<li>早期活性化を防ぐためには、アルミ箔と飼育容器をラップし、不要な光の刺激からハエを保護するために暗いボックスに入れます。25 ° C、4-6 日の暗闇の中で湿度を 60% にハエを保ちます。</li>
		<li>2 日前の給餌試験種女性ステレオ顕微鏡下で CO2フライ パッドの上飛ぶ。1 つの食品のバイアルに 20 ハエを収集し、テストが給餌前に暗闇の中でそれらを保ちます。</li>
		<li>周囲の光による影響を避けるためにできるだけ早く薄明かりの下ですべての操作を行います。作業領域から遠くに置かれた LED ランプを使用して、作業領域での強度は 5 μ/cm2。 注:飢えた使用カントン S 飛ぶ餌の試金のための肯定的な制御として。食品のこれらのハエを奪うし、給餌テスト前に 24 h の 1% アガロースゲルの維持します。これらのはえの食糧消費のレベル日常的な変動を評価するのに役立ちます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. thermogenetic の活性化
<ol><li>概日リズムによる変化を最小限に抑えるため同調因子時間 4-631,32、周りの日の同じ時間ですべての給餌実験を行います。</li>
	<li>暖房環境としてインキュベーター (または温度制御ヒーターの小部屋) を準備します。</li>
	<li>行動実験の前に (30 ° C) 実験的温準備供給室を平衡させ、温度が授乳室で相対的な制服を確認する 2 時間。</li>
	<li>供給プロセスを開始するには、慎重に転送 20 ハエの家バイアルから予熱した授乳室に穏やかな軽くたたくことによって。60 分. (図 3 a) 30 ° C で給餌を続行します。 注:頻繁に扇動、摂食行動に悪影響をインキュベーターのドアの開閉のようこうしては最小限で済みます。</li>
	<li>30 分間、60 分-80 ° C (または-20 ° C) で授乳室を凍結による栄養補給を停止します。 注:凍結は、同時にすべての部屋で授乳を停止するのに役立ちます。凍結-80 ° C で飛ぶハエを安楽死させると 1 週間均質化までのストレージの 2 つの目的を提供しています。</li>
	<li>温度コントロール グループの染料色食品 22 ° C, 60 分で餌のプロセスを開始するとチャンバーを供給部屋の温度に 20 ハエを転送します。</li>
	<li>30 分間凍結室-80 ° C (または-20 ° C) の温度コントロール グループの供給を停止します。</li>
</ol>4. 光の活性化
<ol><li>概日リズムによる変化を最小限に抑えるため同調因子時間 4-631,32、周りの日の同じ時間ですべての給餌実験を行います。</li>
	<li>1 バイアルから穏やかな軽くたたくことによって餌室に 20 ハエを慎重に転送し、照明のセットアップ (図 4 a, 4 b) 商工会議所横にします。<ol>
<li>光遺伝学的操作、オレンジの Led の配列を使用 (607 nm) 光刺激と餌をサポートする Led 上水平プレキシ ガラス プレート室照明の中に修正のソースとして。インキュベーターに湿度 60% (図 4 a, 4 b) 25 ° C でのセットアップをしてください。</li>
		<li>並行して遺伝的制御ハエを刺激、餮 > CsChrimson 、ハエが、別に授乳室。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オレンジ色の光によってバックの照明と 60 分のための供給プロセスを続行します。<ol>
<li>実験的研究のための最適な照明強度を決定する36。餮 > CsChrimson 餮を刺激するために 0.1 mW/mm2の中間強度を使用して、ハエ、2.2 mW/mm2の強度したがって麻痺 (歩行の停止) と姿勢制御の損失を誘発します。> CsChrimson給餌テスト中に飛ぶ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 分間凍結-80 ° C (または-20 ° C) で授乳室で授乳を中止します。</li>
</ol>5 食品消費の視覚的評価
注:得点方法は、視覚は、食品消費の半定量的推定を提供します。光法、客観的である、タイムリーに適して最初のそれ以上のテストのための候補者のリストをすばやく絞り込むに遺伝学的スクリーニングのラウンドに飛ぶ系統の数が多いを介して行くためこのメソッドができます。
<ol><li>供給プロセスの後麻酔し、得点は CO に乗って飛ぶ2ステレオの顕微鏡の下で飛ぶパッド。ボリュームと (図 2 a) 腹部の色素着色された食品の強さに基づいて各フライに個々 のスコアを与えます。 注: 視覚的評価基準: スコア システムが別のボリュームと腹部に着色した食品の強度に対応する食品の摂取量の 4 つのレベル。<ol>
<li>スコアが 0 のスコア検出の染料色の食べ物がなくても飛ぶこれらのかすかな (かろうじて検出可能) 青い色素や腹部の容積の 3 分の 1 未満を占める色素着色された食品に 1 のスコアを与えます。</li>
		<li>腹部の半分を占める強烈な色素着色された食品とハエのスコア 2 のスコア。</li>
		<li>腹部の半分を超える強烈な染めコンテンツ占領とのそれらはスコア 3 (図 2 a) のスコアです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各実験条件 (図 2 b) で異なるスコアとハエの割合を計算します。</li>
</ol>6 食料消費の比色定量
<ol><li>給餌停止を注ぐ授乳からすべての 20 ハエ部屋の一枚紙の重量を量るにし、柔らかいブラシを使って 1.5 mL チューブにそれらを転送します。 注:冷たい部屋に結露のため商工会議所壁に付着してハエを避けるために同時に-80 ° C のストレージの部屋のすべてをしないでください。</li>
	<li>チューブに PBST の 500 μ L を追加し、60 Hz で 5 の粉砕機を使用してハエを均質化 s。<ol>
<li>体の部分の検出可能なフラグメントがないとき観測による十分な均質化を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>がれき 13,000 rpm で 30 分間乳剤チューブをスピンします。</li>
	<li>遠心分離の後 96 ウェル プレートのウェルに清の 100 μ L を転送します。</li>
	<li>すべてのサンプルをロードした後は、630 でサンプルの吸光度を測定するプレート リーダーに皿を置く nm。</li>
	<li>バック グラウンドの吸光度を取り外すには、青い食品供給ハエから上清の吸光度から色素なし食品供給のハエから培養上清の吸光度を引きます。 注:この手順は省略可能、使用食品の組成に応じて。(染料) なしはえの食糧が 630 で吸光度を生成するとき nm、バック グラウンドを除去するためにこの手順を実行する必要があります。</li>
</ol>

<ol>
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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+-+Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and+mouse.">Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+starvation-induced+hyperactivity+by+insulin+and+glucagon+signaling+in+adult+Drosophila.">Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and+mouse.">Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+short+neuropeptide+F+regulates+food+intake+and+body+size.">Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size.</a> J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).</li><li>Marella, S., Mann, K., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Modulation+of+Sucrose+Acceptance+Behavior+in+Drosophila.">Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila.</a> Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).</li><li>Albin, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subset+of+Serotonergic+Neurons+Evokes+Hunger+in+Adult+Drosophila.">A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila.</a> Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).</li><li>Ro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+signaling+mediates+protein+valuation+and+aging.">Serotonin signaling mediates protein valuation and aging.</a> eLife. 5, e16843 (2016).</li></ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

このレポートは、thermogenetic のコンテキストにおける食料消費の染料ラベル供給の試金の技術的なプロセスに焦点を当てと神経細胞を操作する光遺伝学的活性化制御を供給します。このシンプルで信頼性の高いプロトコルは、候補送り制御、ハエ、嗜好を測定し、供給ベース遺伝的画面24を介して給電制御回路の新規プレーヤーを識別するニューロンの働きを解明するのに役...

食品摂取量の定量化は餌 (飢餓状態) などで必要な内部および外部要因 (食品の品質および食味) など1,への応答では、脳によるコントロールのさまざまな側面を評価するために重要です2,3,4,5,6,7,8,9. 近年、ショウジョウバエの送り制御の神経基盤を解読の努力は直接摂取食品の量を定量化したりモチベーションを餌の指標として複数のアッセイの開発につながる10,11,12,13,14,15,16。
キャピラリー フィーダー (カフェ) アッセイ12,13ガラス マイクロキャピ ラリーで液状の食品の消費量を測定するため開発されました。カフェ アッセイで高感度・再現性の高い17食品の消費、特に長期的な供給18を定量化するための測定が簡単になります。ただし、このアッセイは、マイクロキャピ ラリーの先端に登るとフィード逆さまにすべての株に適しているないハエを必要です。さらに、カフェ アッセイを用いたテストするハエは、流動食に飼育する必要がある、ために、これら代謝状態または潜在的な栄養失調の飼育の効果は決定するのまま。
テング拡張応答 (PER) アッセイ11,14食品滴の優しいタッチに向けたテング拡張機能の応答回数をカウントします。評価するための優れた方法として証明されるアッセイごと食味の影響や食品18,19のコンテンツ個々 のフライとロバの動機を供給します。しかし、摂取量の直接定量ではないです。
最近では、半自動式方法、餌アッセイ (アジア パシフィック)15マニュアルが開発されました。アジア パシフィック、1 つの固定されたフライは食品を含むマイクロキャピ ラリーを手動で供給されます。テング拡張応答と食物摂取を同時に監視できる、アジア パシフィックは栄養価と薬理学的操作の影響の評価に適しています。ただし、フライを固定可能性がありますパフォーマンスに悪影響その行動、摂食を含みます。
さらに、テングを飛ぶ、アクティビティ検出器 (FlyPAD)10が自動的に摂食行動を定量化する開発されました。マシン ビジョン メソッドを使用して、FlyPAD はフライと動機を餌の指標として頻度とテングの拡張の期間を定量化する食品の物理的な相互作用を記録します。感度とこのシステムの頑健性はより確認されてさらに残っているが、可動式のハエの摂食を監視する高スループット方法研究12FlyPAD を提供します。
ラベリング戦略は、ハエの食物摂取を推定するよく使用されます。化学トレーサーを食品にラベルを付けるし、授乳後摂取したトレーサーの食物摂取量を計算するの量を測定するが一般的です。放射性トレーサー16,17,20,21,22,23,24,25キューティクルによる検出を可能にします。なく、ハエの均質化。このメソッドは、著しく低い変動と高感度18を提供し、食品の摂取量の長期調査の実行可能なです。ただし、使用可能な放射性同位元素の可用性と吸光度と排泄量必要があります考慮するこのアッセイを操作するとき。
ラベリングと非毒性食品の色と食品摂取量をトレースは、安全でシンプルな代替の2,の3,26,27,28です。ハエは水溶性と非吸収性の染料を含む食物と一緒に授乳後均質化し、摂取の色素の量は、分光光度計3,24,28,29 を用いて定量化は後.ラベリングの戦略を実行するはたやすいし、高効率を提供しますが、注意。摂取の色素から推定した食物摂取量が排泄開始 15 分早ければハエ17に送り込むので実際の量よりも小さい。さらに、アッセイは、短期的な摂食行動24,28の調査のためにだけ適している 60 分期間内通常食品を摂取を評価します。さらに、遺伝子型17、男女17など、複数の内部および外部要因交配状態17, 飼育密度30、概日リズム31,32、および食品の品質の3,8,16、影響食品の摂取量。したがって、給餌期間は、特定実験条件に応じて調整する必要があります。食品の色は食物摂取量の定量化を容易にするほか、食品の選択肢2,19,27を評価し、カフェ アッセイ12マイクロキャピ ラリーのメニスカスを視覚化するも使用されます。
色素標識による神経活動の結合のプロトコル操作を紹介します。この戦略は、大人の果実ハエ24の送り制御に関する私たちの遺伝研究に有用な証明されています。得点方法は、食品消費量の簡易推定したがって、タイムリーに系統の数が多いを通じて検診に便利です。画面からの候補者は、目的と追加調査で正確な定量を提供する比色法を用いて詳細に分析しています。
餌の試金のほか thermogenetic27,33,34,35と光36メソッドを強制的にターゲットショウジョウバエのニューロンを活性化について述べる。Thermogenetic、ニューロンをアクティブ化する操作が簡単・便利にショウジョウバエ過渡受容体潜在的アンキリン 1 (dTRPA1)、神経の興奮性を増加、温度と電位依存性陽イオン チャネルであるとき周囲23 ° C33,37; 上記の温度上昇します。しかし、高温動物をテスト動作に悪影響を及ぼすを生成可能性があります。ショウジョウバエのニューロンをアクティブにする別の効果的なアプローチが使っている光遺伝学 CsChrimson36ライトに露出されたときのニューロンの興奮性を増加チャネルロドプシンのレッドシフト バリアントであります。研究では、高い時間分解能と thermogenetics よりも動作にあまり障害を提供しています。神経活動の操作と食物摂取の定量的測定を組み合わせること供給の神経機構を研究するための効果的な方法を表します。
テストする授乳室とハエの準備について詳細に述べる。餮 Gal4ハエを使用すると、モデル24thermogenetics、光遺伝学による活性化ニューロンをについて説明します。染め分類された食糧と食糧消費の数量の 2 つの試金はプロトコルでも説明されます。

<table><tbody><tr><td>UAS-CsChrimson</td><td>Bloomintoon</td><td>55135</td><td></td></tr><tr><td>UAS-dTrpA1</td><td>Bloomintoon</td><td>26263</td><td></td></tr><tr><td>TDC1-GAL4&amp;nbsp;</td><td>Bloomintoon</td><td>9312</td><td></td></tr><tr><td>TDC2-GAL4</td><td>Bloomintoon</td><td>9313</td><td></td></tr><tr><td>sNPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Z. Zhao</td></tr><tr><td>NPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>TH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>5-HT-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>AKH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>dip2-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>Taotie-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by J. Carlson</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Erioglaucine disodium salt</td><td>Sigma</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>all-trans-retinal&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>R2500</td><td>stored in darkness</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-01</td><td></td></tr><tr><td>Fly food</td><td></td><td>1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;1x PBS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td>1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td><td></td></tr><tr><td>PBST buffer</td><td></td><td>1X PBS with 1% Triton X-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Grinding mill</td><td>Shang Hai Jing Xin</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ning Bo Jiang Nan</td><td>HWS-80</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer with a heat plate</td><td>Chang Zhou Bo Yuan</td><td>CJJ 78-1</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Thorlabs</td><td>CCS200/M</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence stereo microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>&amp;nbsp;M205FA</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>Outside container</td><td>Jiang Su Hai Men</td><td>glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)</td><td></td></tr><tr><td>Inside container&amp;nbsp;</td><td>Beijing Yi Ran machinery factory</td><td>plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tubes</td><td>Hai Men Ning Mong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;96 well plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>&amp;nbsp;Costar 3599</td><td></td></tr><tr><td>LEDs</td><td>Xin Xing Yuan Guangdian</td><td>607 nm, 3W&amp;nbsp;</td><td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td></tr></tbody></table>

combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in drosophila

食糧消費は、生理学的状態、嗜好、食品、および開始または給餌を停止するコマンドを発行の栄養の内容を統合する脳の厳格な管理下です。タイムリーかつ適度な送り制御に関連する生理学的な心理的な障害の理解に運ぶ主要な含意を餌の意思決定の基礎となるプロセスを解読します。単純な定量的、かつ堅牢な方法特定のターゲットのニューロンの活動を強制的に増やすなどの実験操作の後動物の食物摂取を測定する必要があります。大人のショウジョウバエの送り制御の遺伝研究を促進する色素ラベルに基づく摂食アッセイを紹介しました。利用可能な供給アッセイを確認して、thermogenetic を組み合わせて分析し、色素ラベル食品摂取量試金の摂食刺激を制御する神経細胞の光遺伝学的操作のセットアップから順を追って手法を述べる。利点と読者適切な試金を選択するために、他の餌アッセイと比較して, 本手法の限界についても述べる。

Thermogenetic 画面。
食欲異常増加が高い食物摂取、生理的欲求に関係なく発生します。高スループットを設計するこの方式を利用神経細胞の遺伝的ハンドルを取得行動画面飢餓に関連、飽食状態 (図 1)。画面には、餮 Gal424が得られました。餮 Gal4ニューロンが 30 ° C で強?...

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Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

着色食品と定量的食物摂取の試金を提供、高スループット意味摂食意欲を評価します。Thermogenetic と食料消費分析を組み合わせて光の画面は大人で食欲の神経回路を調査するための強力なアプローチとキイロショウジョウバエ。

定量的食物摂取の試金を組み合わせると強制的にショウジョウバエの食欲を勉強するニューロンを活性化

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

combining-quantitative-food-intake-assays-forcibly-activating-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

8.2K ビュー.  University of Science and Technology of China. 着色食品と定量的食物摂取の試金を提供、高スループット意味摂食意欲を評価します。Thermogenetic と食料消費分析を組み合わせて光の画面は大人で食欲の神経回路を調査するための強力なアプローチとキイロショウジョウバエ。

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

神経科学

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

で食欲連想嗅覚学習<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

での採餌行動のためのシングル·フライアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

行動学

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定します<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

ショウジョウバエ幼虫を用いた熱遺伝学的神経細胞スクリーンにおけるマクロ栄養素摂取量の定量化

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

ショウジョウバエにおける急速な食品嗜好アッセイ

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

Taste Preference Assay: A Method for Measuring Feeding Behavior in Drosophila

Source: Bantel, A. P. and Tessier, C. R. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/54403/" target="_blank">Taste Preference Assay for Adult Drosophila</a>. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the taste preference assay, a behavioral method used to measure attraction or avoidance towards colored solutions that taste differently by assessing the fly&#39;s abdominal coloration after ingestion of the preferred substance. The featured protocol demonstrates the procedure used to measure flies&#39; preference towards solutions of varying sucrose concentrations.

Taste Preference Assay:ショウジョウバエの摂食行動を測定する方法

Source: Bantel, A. P. and Tessier, C. R. Taste Preference Assay for Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the taste preference ...

定量的食物摂取の試金を組み合わせると強制的にショウジョウバエの食欲を勉強するニューロンを活性化

要約

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この動画の章

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ

で食欲連想嗅覚学習

での採餌行動のためのシングル·フライアッセイ

ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法

キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定します

ショウジョウバエ幼虫を用いた熱遺伝学的神経細胞スクリーンにおけるマクロ栄養素摂取量の定量化

ショウジョウバエにおける急速な食品嗜好アッセイ

インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

Taste Preference Assay:ショウジョウバエの摂食行動を測定する方法