改善し、実際の状態にこれらのテクニックを絞り込むに役立つ演習の古いメンバーに感謝したい: 博士シーリア ・ マルティネス-モーラ;博士アンナ Mrowiec、博士カタリナ ルイス自慢、博士アントニア ・ アルカラス ガルシア。これらの技術の開発を強く支援病院臨床ウニベルシタリオ ビルゲン デ ラ Arrixaca にお世話になっております。セルバンテス ・ デ ・またサラッド カルロス 3 世、フォンド ・ デ ・研究 Sanitarias。Estatal を計画私 + D + 私とセルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III Subdirección 一般 06 y 開発デ ラ危惧 (許可番号: PI13/00794);www.isciii.es. Fondos ・ フェダー「Una manera デ hacer エウロパ」。我々 も行政も支援をグァテマラ ・ デ ・ ムルシア、IMIB Arrixaca、外国金融機関に感謝します。最後に、我々 は博士イサベル ・ マルチネス-Argudo と Facultad デ芸術報 Ambientales y Bioquímica、キャンパス ′ デ ラ Fábrica デ アルマス、グァテマラ カスティーリャ ・ ラ ・ マンチャ州、トレド喜んで譲ることで彼らの親切なサポートのおかげでスペシャルを与えたい、バイオ医薬品と本稿の撮影の一部を実現するためのバイオ テクノロジー研究室。

1. 人工傷スクラッチ アッセイ定量的研究
<ol>
	<li>セル膜の準備
	<ol>
		<li>無菌状態の下で働いて、シードし、血清添加培地を用いた培養フラスコに Mv1Lu または HaCaT 上皮細胞を成長します。一度、すべての 24-48 h 媒体を更新します。電池が 80% の合流点に達する後、適切な方法、すなわちtrypsinization9を使用してセルをデタッチします。 注: Mv1Lu と実装された EMEM と DEMEM の培養液を使用して上皮細胞株を培養している HaCaT それぞれ 2 mM L-グルタミンを添加したし、5% CO2の制御された雰囲気と 37 ° C で培養しました。すべての細胞株は細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する徹底的に試金する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の x 10 の4または 104細胞/ウェル、x 4-6 2 4 それぞれがシード 175 cm2培養用フラスコのと最大 35 x 106 Mv1Lu または 1 × 107 HaCaT 細胞 80% で合流点が得られます。</li>
		<li>どちらかの 12、または 24 ウェル培養プレートの各ウェルの細胞の 2 mL の種子します。すべて 24-48 h. 確認セル番号が 2 または 3 日後 100% の合流点に到達するために十分に高い媒体を更新します。</li>
		<li>細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除き、新鮮な無血清培地で 2 回洗います。スクラッチ前に 24 h の無血清培地で細胞を保ちます。 注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、セルライン無血清条件下で自発的にデタッチに影響を受けやすいためポリ L リジン溶液を用いた培養プレート面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>単分子膜傷
	<ol>
		<li>しっかりと 20 μ L またはスクラッチの幅に応じて、200 μ L 滅菌ピペット先端の狭い端をドラッグして文化単層をスクラッチ無菌環境で作業します。先端のギャップの均質性を最大化する文化面に垂直を維持します。<ol>
			<li>明らかに単層細胞を監視する暗い表面上培養皿に置きます。必要な場合は、各ウェル 4 移行の領域まで勉強するの (十字型) 2 つの垂直の傷を実行します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>軽く培と優しく追加新鮮な無血清培地を削除して剥離細胞を洗ってください。2 回繰り返す最も接続されていないセルを削除するまで、または。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>実験の手順とデータ収集
	<ol>
		<li>まあ CCD カメラを組み込んだ倒立位相差顕微鏡を使用して各からスクラッチのギャップを中心とした最大 4 前処理参照画像を取る。傷の隣接する交差点に顕微鏡フィールドの端を合わせて、関心領域を選択します。 注: 通常、画像を用いている 10 倍の倍率、1,280 x 1,024 ピクセルのイメージ サイズ。前述のローカライズを容易およびウェルあたり最大 4 測定法の検証のために役立ちますようの関心領域を選択します。</li>
		<li>一度すべての画像を取得、指定治療井戸;選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。 注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。</li>
		<li>観測範囲 90% スクラッチ ギャップ閉鎖条件まで傷プレート (5% CO2を含む制御された雰囲気の 37 ° C) を孵化させなさい。完全な閉鎖を避けるため。 注: 合計ギャップ閉鎖の後処理の画像コレクションを無効リファレンス領域が検出されないし、ギャップの閉鎖のために参照を確立できません。Mv1Lu または HaCaT 細胞の場合 16-19 h は 90% の合流点に到達する必要があります。</li>
		<li>したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。 注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。</li>
		<li>傷後キャプチャ元の参照領域から各ウェルの治療後の参照画像を取る。同じ機器 (倒立光学位相差顕微鏡 CCD カメラを組み込んだ) と一致する画像の設定 (倍率とデジタル解像度/密度) を使用します。 注: 個々 のセル移行速度の計算ができる可能性があります時間コース画像を個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める細胞としていること。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移行の画像解析と定量
	<ol>
		<li>画像処理ソフトウェア (例えばImageJ) を使用すると、スクラッチ ギャップ制限を定義し、治療前の写真で 4 つまでの測定のための gap 表面を決定します。「表面前処理ギャップ」としてデータを記録 (PREGAP)。治療後の写真は、同じ手順を繰り返します。「治療後ギャップの表面」としてデータを記録 (POSTGAP).<ol>
			<li>ImageJ を使用して記録された画像を開きます。「画像」メニューで画像の種類を 8 ビットに設定します。「プロセス」メニューで「フィルター」サブメニューに移動し、、"変動"のフィルターを適用。</li>
			<li>「画像」メニューで"調整"サブメニュー黒と白に設定されたしきい値を入力してください (B &#38; W)、「暗い背景」が選択されていないことを確認します。「プロセス」メニューの"バイナリ"サブメニューに移動し、「穴を埋める」を選択します。</li>
			<li>「分析」メニュー「測定を設定」を選択、「エリア」アクティブに。測定領域次のギャップを区切る移行のエッジの輪郭を描画します。</li>
			<li>「分析」メニューの「粒子の分析」を選択し、描画エリア表面の「合計領域」の値を記録します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>ギャップ表面測定の差として個々 のサンプルのセットごとに絶対移行を定量化するスプレッドシートの PREGAP、POSTGAP の総面積値を紹介: プリギャップ − POSTGAP [任意単位]。さらに、各コントロールのサンプル条件の絶対移行データを正規化: (サンプル ・制御) * 100 [%]。 注: セルを個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める、絶対移行により計算できる中央に侵入セルをカウントのいずれかのストリップコントロールまたは扱われたサンプル。</li>
		<li>(図 1参照) 数量出力をプロットします。必要であれば、統計分析を実行します。</li></ol></li></ol>2 つの条件または条件の大きい数のための分散分析のテストを比較するときは、スチューデントの t 検定を検討してください。
	
	

2. 人工移行フロント アッセイ地形の研究
<ol>
	<li>セル膜の準備
	<ol>
		<li>無菌状態での作業は、プレートの表面が完全に覆われるまで空培養皿に滅菌ラウンド coverslips の 1 つのレイヤーを配置します。 注: 12 と 33 coverslips までに収まる 5 cm と 10 cm 径プレート、それぞれ。</li>
		<li>培養プレートに 2 〜 3 日後 100% 合流ができる濃度で細胞の十分な量を優しくシードします。Coverslips が滅菌ピペット先端で穏やかな圧力を適用することによって浮遊するを防ぐし、coverslip が隣接 coverslips 重なっていないかどうかを確認します。媒体ごとの 24-48 時間を更新します。 注: すべてのセルの行を徹底的にで検定して細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の 2-3 x 10 の6または 10 の6セル/10 cm 径プレート x 2.5-4、それぞれシードされます。小さめの皿で細胞数をスケール ダウンする必要があります。</li>
		<li>細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除きし、新鮮な無血清培地に置き換えます。人工傷を実行する前に、24 h の無血清培地で細胞を維持します。 注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、細胞無血清条件下で自発的にデタッチの影響を受けやすいのポリ L リジン溶液を用いた培養面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>単分子膜を傷つける
	<ol>
		<li>滅菌ピンセットを使用して、優しく新鮮な無血清培地を含むクリーン 10 cm プレートに観察を移動します。ピンセットで周囲に、coverslip を保持することによって、単分子膜の損傷を防ぐ。Coverslip 破損の恐れのある過度の圧力を避けます。</li>
		<li>人工傷を作成するには、coverslips の中央に横ラインの殺菌かみそりの刃をドラッグします。中央の単分子膜のストリップを完全に削除するために戻って来たり、3-4 mm をドラッグします。細胞の残骸残って負傷のエッジに接続されていないことを確認します。 注: 12 mm 径の coverslip、ラウンド、切開で、半ば、カバーガラスの。以下の手順でカバーガラスの傾斜を避けるために (少なくとも 2 mm 幅) 十分に大きい主な正面の反対側セルの連勝を残してください。</li>
		<li>きれいな 6 ウェル プレート含む少なくとも 2 mL 新鮮な無血清培地に、上向きのセルと負傷者 coverslips を転送します。最大 4 負傷 coverslips/よくに合います。</li>
		<li>水洗いして 2 回使用新鮮な無血清培地戸建のセルを削除します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>実験方法及びサンプリング
	<ol>
		<li>優しく選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。 注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。任意の潜在的な細胞の剥離を避けるために慎重に進みます。</li>
		<li>目的の実験的タイミング (37 ° C、5% CO2) セル インキュベーター内のプレートを保ちます。</li>
		<li>したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。 注: コース実験の時間のため培養プレートからサンプルを削除、その他、継続的な実験条件に影響を及ぼすホルマリン煙を避けるために別皿でそれらを修正します。</li>
		<li>過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。 注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛍光抗体法 (IF) とトポロジー解析
	<ol>
		<li>IF の染色を行いとして個々 coverslips にイメージングは別記3,4,11。<ol>
			<li>Coverslips PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液を浸すことによって 10 分間 permeabilize します。</li>
			<li>次のブロックのソリューションを使用して 30 分間ブロック: 0.3% ウシ血清アルブミン。10% 牛胎児血清;5% のスキムミルク。PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液。 注: ミルクなし解決を妨げること事前に準備ができ-20 ° C で保存</li>
			<li>牛乳無料ブロッキング液で希釈した一次抗体と湿ったチャンバ内の室温で 1 時間インキュベートします。Coverslips に逆さまの状態で適切な配分を確保するため 15 μ L 抗体溶液を配置します。 注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ウサギ抗 c 6 抗体は 1/100 希釈を必要とします。</li>
			<li>PBS での 0.1% トリトン X-100 溶液で coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。</li>
			<li>30 分間無料のミルク ブロック バッファーで希釈した二次抗体に coverslips を孵化させなさい。 注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ヤギ抗うさぎ (488) は、最適な解像度の 1/400 希釈を必要とします。ヘキスト 33258 ファロイジンなど他の標識化合物は、この段階でインキュベーション バッファーに追加できます。</li>
			<li>PBS で 0.1% トリトン X-100 溶液 coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。</li>
			<li>Coverslips 逆さまの状態で 10 μ L マウント メディア ドロップ (例えばVectashield) 顕微鏡スライド上に配置をマウントします。取付中硬化一晩室温で暗闇の中でスライドを残します。その後、無期限に暗闇の中で 4 ° C で保存します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>落射蛍光または移行の前面の端で発生した構造変化の共焦点顕微鏡画像のいずれかを取得します。 注: トポロジー研究は、内側の膜に移行する前から写真を並べて実行できます。半定量的な研究がローカル蛍光強度に基づくソフトウェア分析によって可能です。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+wound+healing.">Cutaneous wound healing.</a> N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).</li><li>Davidson, J. 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著者は、利害の対立がないことを宣言します。

皮膚または粘膜の破壊、線維芽細胞、上皮や免疫細胞など、様々 な細胞タイプの行動によってバリア機能が復元されます。相まって、これらの細胞を受ける複雑なアポトーシス、増殖、分化、重要なは、線維芽細胞を含むプロセスと上皮細胞の移行、混乱の組織の修復のための責任の究極のメカニズムであると表在性上皮ギャップ1,12細胞遊走を勉...

上皮のギャップの最終的な閉鎖と混乱の表面1の修復を担当しており、細胞遊走は創傷治癒に必要です。動物モデルにおける人工傷を実行できるように生理的条件2の近くでこの複雑なプロセスを複製するため。しかし、このアプローチは多くの場合コストがかかり、複雑な実験の手順、可能性のある創傷治癒過程の複雑な性質のための明確なプロセスの研究の精度を欠いている結果します。
上皮細胞の体外培養は、創傷治癒や処理セルの回遊行動に及ぼす影響のこれらの細胞が果たす役割を研究するため動物モデルの有用な代替を提供します。上皮細胞の生理学は非合流文化3,4,5,6; を使用して分子技術によってよく勉強しました。ただし、上皮整合性の破壊は結構機械的切開により通常。細胞培養、細胞のほとんどの数は、傷のギャップにさらされるかもしれないし、彼らは分子生物学の技術のための余りに小さいサンプルを表すこれを意味します。ただし、これらの病変は、ミンク肺上皮細胞 (Mv1Lu) または自然不死化ひと表皮細胞 (HaCaT) セルなど、いくつかの上皮細胞ラインの生得的な渡り鳥の特性を利用して、顕微鏡のスケールで学ぶことができます。ライン。
ここでは創傷治癒の3,4,7,8のコンテキストにおける上皮細胞の移行に関する定量的データを取得する適切な顕微鏡法について述べる。また、移行上皮膜で発生した質的分子および形態学的変化を研究に役立つその他の方法を提案する.全体的にみて、これらのメソッドは、創傷治癒過程におけるダイナミクスと上皮細胞の挙動と治療への応答に関与の形態的変化を研究するためのフレームワークを提供します。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td>L0102-500</td><td>Optional 10 % FBS supplement</td></tr><tr><td>Eagles&amp;rsquo;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12 -662F</td><td>Optional 10 % FBS supplement</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Use at 2 mM</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA</td><td>DE17603A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T4049</td><td>Dilute as appropriate</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14200-067</td><td>Dilute to 1x</td></tr><tr><td>24-well culture plates</td><td>BD FALCON//SARSTED</td><td>734-0020</td><td></td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>SARSTEDT</td><td>83-3920</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>E9644</td><td>Used 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Round cover glass</td><td>MENZEL-GL&amp;Auml;SER</td><td>MENZCB00120RA020</td><td>SHORT DEPTH OF FIELD</td></tr><tr><td>Reinforced razor blade no. 743</td><td>Martor (through VWR)</td><td>MARO743.50</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l sterile aerosol pipet tips</td><td>VWR</td><td>732-0541</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l sterile aerosol pipet tips</td><td>VWR</td><td>732-0528</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera coupled phase contrast microscope</td><td>Motic Spain</td><td>Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>ZEISS Microimaging, Germany</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Culture dish</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1694</td><td>Used 1:100</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Used 1:400</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>14530</td><td>Used 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Used 1:100</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2323</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk</td><td>BD DIFCO</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>Release 1.50i</td><td></td></tr><tr><td>Zen LSM 510 image processing software</td><td>ZEISS Microimaging, Germany</td><td>Release 5.0 SP 1.1</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopy based methods for the assessment of epithelial cell migration during in vitro wound healing

細胞遊走は、創傷治癒に必須の側面です。人工を作成する傷を研究の動物モデルにコストがかかり、複雑な実験手順の結果にしばしば潜在的精度に欠けている間。上皮細胞の体外培養は、創傷治癒と細胞の治療法の影響で細胞の回遊行動の研究のため適切なプラットフォームを提供します。上皮細胞の生理学は非合流条件でよく勉強しました。ただし、このアプローチは、自然治癒で条件に類似しないかもしれない。機械的手段によって上皮の整合性を中断することは現実的なモデルを生成しますが、分子技術のアプリケーションを妨げることがあります。したがって、顕微鏡技術は上皮細胞の遊走を勉強に最適体外。ここで我々 は, 上皮細胞の渡り鳥の性能に関する量的・質的データを入手できる人工移行フロント アッセイ、人工傷スクラッチ試験 2 つの特定の方法を詳しく説明します。

定量的研究のため人工傷スクラッチ試金: 移行上皮成長因子 (EGF) 推進を評価します。
EGF は、上皮細胞の増殖と移行、およびこうして移行推進を定量化するための肯定的な制御のよく知られている誘導です。Mv1Lu と HaCaT 細胞膜が傷傷試金で使用された、治療前の写真が得られました。10 ng/ml の EGF, 接種後のセルは固定と治療...

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Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

本稿では培養上皮細胞は、どのように切開のような病変便利なモデルの傷癒しの in vitro、共焦点イメージングを可能にするについて説明しますまたはレーザ走査顕微鏡と高品質を提供することができます。細胞の挙動と移行に関与するメカニズムの両方の研究のための質的・量的データ。

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

9.2K ビュー.  IMIB-Arrixaca. 本稿では培養上皮細胞は、どのように切開のような病変便利なモデルの傷癒しの in vitro、共焦点イメージングを可能にするについて説明しますまたはレーザ走査顕微鏡と高品質を提供することができます。細胞の挙動と移行に関与するメカニズムの両方の研究のための質的・量的データ。

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

発生生物学

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the beginning and end of an experiment using a phase-contrast microscope, and the migration abilities of cells are evaluated by the closure of wounds. However, cell movement is a dynamic phenomenon, and a conventional method does not allow for tracking single-cell movement. To improve current wound-healing assays, we use live-cell imaging techniques to monitor cell migration in real time. This method allows us to determine the cell migration rate based on a cell tracking system and provides a clearer distinction between cell migration and cell proliferation. Here, we demonstrate the use of live-cell imaging in wound-healing assays to study the different migration abilities of breast epithelial cells influenced by the presence of TIP60. As cell motility is highly dynamic, our method provides more insights into the processes of wound healing than a snapshot of wound closure taken with the traditional imaging techniques used for wound-healing assays.

Here, we present the real-time monitoring of cell migration in a wound-healing assay using TIP60-depleted MCF10A breast epithelial cells. The implementation of live-cell imaging techniques in our protocol allows us to analyze and visualize single-cell movement in real time and across time.

乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブ イメージング

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

がん研究

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

環境学

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

生物工学

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

免疫・感染学

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

生物学

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

医学

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Here we describe a procedure to test the cell migration in vitro with an automated optical camera microscope. The scratch assay has been widely used where the closure of the scratch is followed for a set period. The optical microscope enables dependable and cheap detection of cell migration.

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

要約

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有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブイメージング

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

要約

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有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

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細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブイメージング