著者は、成人外科と新生児のテクニックの学習に関連する彼の指導や議論のためのロチェスターの大学博士 Abdellatif Benraiss を認めたいと思います。著者はまた博士ジェームズ ・ ローダーデール脳定位固定装置のディスカッション用 UGA ではこの手法の方法論と研究大学の科学者 (円弧) 基盤の進歩の設定に関連を認めたいと思います、サポートと (NINDS 付与 F99NS105187-01 ・ R01NS097231-01 R01NS096176 02) 私たちの NIH のサポート。

すべての動物は、南カリフォルニア大学、ジョージア大学のアニマル ・ ケアのガイドライン プロトコルに従ってを使用します。妊娠中のダムと大人のための安楽死方法が承認されたプロトコルに基づいて行われて: 二酸化炭素の窒息、安楽死できるように二次的な方法として頚部転位が続きます。新生児の子犬は斬首で安楽死させた。
注意: 次のプロトコルには処理病原性ウイルスが含まれます。ウイルスを処理しながら、適切な予防措置を取られるべき。すべてのプロトコルは、使用する前に、適切な機関の委員会によって承認されなければなりません。
1. ジカの萌芽期の脳内接種
<ol><li>タイミング妊娠交尾 E0.5 として交配翌日の正午を検討してください。一日の終わりにマウスをペアリングし、交配時期のばらつきを減らすために早朝にプラグをチェックします。</li>
	<li>手術前にガラス針を準備します。針を引っ張ると 1/3 でその長さをカットし、細孔のサイズが 50-70 μ m の範囲チェック針先品質と破損のため万国実体写真の下まで水点滴とマイクロ ピペット グラインダーを使用して 45 ° の角度で研ぐ。</li>
	<li>氷の上に分注ウイルスを保ちます。手術の直前に準備されたガラス注射針に ZIKV 注入ミックスをロードします。ガス タイトな注射器 (50 μ L のボリューム)、ルアーロックの添付ファイル、およびチューブを組み立てるし、鉱物油とチューブで組み立てられた注射器を飽和させます。飽和、一度針を添付し、描画 〜 針に 6-7 μ ZIKV (〜 1 μ L、1.7 × 106 TCID50/mL)。</li>
	<li>(頭蓋内注射) を日 E14.5 胚または塩酸ケタミン (80-100 mg/kg) とキシラジン (5-10 mg/kg) 滅菌生理食塩水の溶液で希釈 (子宮内注射) を E10.5 胚で妊娠 c57bl/6 j または 129S1/SvImJ マウスを注入します。腹腔内に母親の麻酔を誘導します。また、必要に応じて監視イソフルラン イソフルラン吸入、廃ガス清掃、によって提供されると母親を麻酔します。ブプレノルフィン SR (0.5-1.0mg/kg) を皮下麻酔を誘発するを挿入します。</li>
	<li>ピンチ テストつま先先端または尾の母親は麻酔し、動物が承認した加熱パッド (100 x 200 2.5 mm の熱パッド) にそれらを仰臥位置き。つま先ピンチ鉗子は滅菌ではない、手術で組織を処理するは使用されません。また、つま先ピンチ逃避反射をテストする手袋をはめた手を使用する可能性があります。 注: は、最寄りの周術期加熱法の制度的獣医スタッフを参照してください。カバーは、この加熱パッドと動物の間置かれました。</li>
	<li>眼軟膏を目に追加します。</li>
	<li>腹部の表面を削るし、3 回ヨードとアルコール消毒します。代替のヨードとアルコール ワイプ;手術部位から円を描くように拭いてください。</li>
	<li>切開および器械の汚染を避けるため無菌布で手術部位の周囲の皮膚をおいましょう。 メモ: ドレープ オープニングは準備手術サイトより大きくできません。ドレープの開口部に、髪を見てはなりません。</li>
	<li>鉗子で彼女の腹部から母親の皮膚をつまみ、滅菌手術用ハサミで芯矢状線で 1 〜 1.5 cm ラインで下腹部をカットします。これは皮膚に切り取り、胚、現在公開されているので、腹腔内にさらにします。 注: 外科はさみ、皮膚と腹膜の層を切開する使用されます。滅菌器具や手袋は、各手術に使用されます。</li>
	<li>小さな滅菌ガーゼの中央にスリットを切り、外科的開口の上に適用されます。滅菌生理食塩水で水和物します。一度に 1 つの子宮角に焦点を当てよりも 4-5 胚を削除しないように注意して、滅菌ガーゼに残りの部分にスリットから胚を引き出します。</li>
	<li>前に、彼らは乾かないように接種を通して滅菌生理食塩水で胚をメタンハイド レートします。胚が注入されると子宮角内の場所の追跡。個々 の胚は、胚は子宮内で開発しながら位置を変更しないでください、このように個別の実験として扱われます。(子宮内注入用 1.15 を手順に進みます)。</li>
	<li>胎児の頭の下のへらをそっと置きます。頭と頭蓋骨の縫合を視覚化するランプとともに胚を照らします。 注: 無菌技術の後、滅菌手術用手袋や楽器など。後 (ランプ) などの非滅菌の項目を操作している、手袋は滅菌器具やエリアを処理する前に新しい滅菌手袋に置き換える必要があります。</li>
	<li>胚の頭まで (可視性のための頭部) の背後にあるランプと無料の指の両方を持つ胚を操作することによりヘッドの位置は、子宮の壁に直接プッシュされ、非利き手で開催。 注: は胚を位置決めの重要な部分、ほとんどの練習法です。あまりにも多くの指圧は、致死に至る胚膜を損傷することが、十分な圧力注入を困難にすることができます。</li>
	<li>ガイドとして頭蓋骨縫合線に沿って実行している血管を使用します。ZIKV ウイルスを注入 (〜 1 μ L、1.7 × 10 6/mL の TCID50 メキシコ分離 MEX1-44) 組み立てられた注射器と針で E14.5 胚脳の側脳室に。シャム注射としてメディア コントロールを使用します。</li>
	<li>妊娠の保持を高めるためには、卵巣の横にある 2 つの胚と上部膣 (図 1 a) の横にある 2 つの胚をウイルスの投与を避けます。全体的にみて、手術の時間が短縮され、胚の損失を防ぐためにリットル当たり以上 6 胚が注入されます。</li>
	<li>妊娠中のダムに戻し注入胚、腹部腔を埋める 〜 0.5 mL 滅菌生理食塩水。閉じるには、最初両方腹部腹膜筋を縫合し、4.0 滅菌縫合糸で外部の皮膚層を第二に縫合します。縫合; を使用することが望ましい。マウス咀嚼の縫合、創傷の裂開の可能性があります。</li>
	<li>部分的に必要な場合、非加熱の領域に脱出するマウスを許可するように加熱パッドで休んでケージにマウスを配置します。麻酔から回復 (1-2 時間) いる間、母親を監視します。個々 の実験によると時間は異なりますの手術後は、胚を開発します。</li>
	<li>
子宮内注入
	<ol>
<li>1 つの子宮角と胚、100 μ L ジカ (106 TCID50単位 100 μ L DMEM で中断) を注入する 1 mL 注射器および 27 G 針を使用またはコントロール中、子宮内の空間や胎盤の組織に。胚は、胚段階解離の注入されているに注意してください。詳細詳細18以前に公開された作品を参照してください。</li>
		<li>妊娠中のダムに戻し注入胚、腹部腔を埋める 〜 0.5 mL 滅菌生理食塩水。閉じるには、まず腹部の腹膜筋を縫合し、4.0 滅菌縫合糸で外部の皮膚層を第二に縫合します。縫合; を使用することが望ましい。マウス咀嚼の縫合、創傷の裂開の可能性があります。</li>
		<li>部分的に必要な場合、非加熱の領域に脱出するマウスを許可するように加熱パッドで休んでケージにマウスを配置します。麻酔から回復 (1-2 時間) いる間、母親を監視します。個々 の実験によると時間は異なりますの手術後は、胚を開発します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ジカの新生児脳内接種: P0 ・ P1
<ol><li>ガス タイトな注射器 (10 μ L のボリューム) と針が詰まっていないことを確認します。きれいにし、26 g 針で 20 mL 注射器 3 をロード テスト: 生理食塩水との 1 つ、70% エタノール、ソリューションをオフに空気で一つ。ウイルス注射用を使用した場合を 10% の漂白剤で殺菌します。</li>
	<li>氷の上のウイルスを保ちます。シリンジのデッド ボリュームを減らすために生理食塩水とそれを充填して注射器をロードし、0.75 μ L 注入材料から食塩を分離する空気を描画します。</li>
	<li>注入された子犬を温め加湿回復室を設定します。暖房のブロックを使用して、滅菌ガーゼで閉めコンテナー (空ヒント ボックス) などを置き、生理食塩水で湿らせます。注射を開始する前にそれを予熱します。</li>
	<li>ポンプおよびコント ローラーを含むマイクロインジェクターを設定します。特定の注射器のデバイスの種類コードを確認する (すなわち、10 μ L のシリンジは、デバイスの種類には"D")。注入の速度を決定します。</li>
	<li>手術のセットアップの近く生後 0 または 1 子犬 (P0 ・ P1) を収集します。ウイルスと注射器をロードします。70% で子犬のヘッド マウントを消毒エタノール。</li>
	<li>ガーゼの薄層で子犬をラップし、完全に麻酔状態を達成するために氷でそれらを埋めます。子犬は、cryoanesthetized 5 分子犬が応答なし尾/つま先ピンチを実行することによって十分に麻酔注入のことを確認してください。これは、約 15 分間の麻酔状態が得られます。</li>
	<li>ヘッド マウントに子犬を置いて、滅菌のヨウ素と、エタノールの頭の表面 (3 回)、それから滅菌ワイプで拭きます (イソプロパノール 70 %etoh)。</li>
	<li>黒のマーカーでラムダをマークし、脳定位固定装置を使用してラムダで座標を記録します。目とラムダの定位座標から始まりのラムダからエッジまでの距離測定は、(の場合は両方を注入、両半球) 目にラムダから 2/5 距離を計算します。</li>
	<li>注射部位の穴を作成する前に麻酔の深さを再確認します。26 ゲージの針を使用して、慎重に、表面的には、注射針用の開口部を作成する頭皮と頭蓋骨 (頭蓋骨は新生児で非常に柔らかい) 射出位置を穿刺します。</li>
	<li>パンクした場所に注射針を下げ、針が皮膚を破らだけ計算脳定位固定装置を用いた注射部位 (側脳室) の深さ 1 mm。</li>
	<li>針は、注入深さに下げている、一度プログラムを注入するマイクロインジェクター: 10 nL/s、1.5 分間かけて約 1 μ L 注入の割合でウイルスの 1 μ L (〜 1 μ l 3.4 × 105 TCID50/mL ZIKV)。</li>
	<li>注入が終了したとき、待機 30 秒し、針を撤回 (背側)、ネジを回転させることにより、0.5 mm 刻みで 30 を待っている各インクリメント後 s。 注: これは注入されたウイルスの漏れを低減します。</li>
	<li>多くのウイルスとは、針と注射器をすばやくロードどちらか削除されると、(別のウイルスまたはモック コントロールに読み込む別の注射器・針) またはあらかじめ加温加湿チャンバーにヘッド マウントから子犬を削除します。数分おきの子犬を監視すると、ゲージの回復。子犬をくずに置き換えます。</li>
</ol>3. 大人の脳内接種ジカの
<ol><li>麻酔を誘導する滅菌生理食塩水で希釈した塩酸ケタミン (80-100 mg/kg) とキシラジン 5 〜 10 mg/kg 腹腔内の成体を注入します。ブプレノルフィン SR (0.5-1.0mg/kg) を皮下麻酔を誘発するを挿入します。つま先/尾ピンチ マウスをその麻酔状態を確保し、その後手術中に頭部を固定する (加熱パッド) と脳定位固定装置でそれをマウントします。</li>
	<li>マウスの目の手術中に完全に乾くことを防ぐために目に眼軟膏を追加します。耳の初めに目の後ろに開始頭皮を剃る。ヨウ素と 70% の露出した皮膚の消毒エタノール 3 回。代替のヨードとアルコール ワイプ;手術部位から円を描くように拭いてください。</li>
	<li>皮膚を切開する前に麻酔の深さを再確認します。メスを使用して、前の公開滅菌場所に頭の芯矢状線に沿って 0.5 cm の切開を作ることが。注射部位から皮膚を同時に押しながら硬膜組織の頭蓋骨の表面をオフに綿の先端アプリケータ、圧延動きの使用します。</li>
	<li>前から始まって、手術ドリル ビットを合わせ、次の座標を使用して注入のサイトを識別: AP-0.50 mm、ML: ± 1.5 mm します。 コントロールのフットペダルを使って、ゆっくりと針の穴がクリアされるまでだけ骨をドリルとして頭蓋骨にドリル。</li>
	<li>マイクロインジェクター ポンプとガス タイトなシリンジ (10 μ L のボリューム)、定位のドリルを交換してください。食塩とウイルスとの間の小さな気泡を残して、描画 〜 ウイルスの 4-5 μ L。特定のシリンジ ボリューム (すなわち、10 μ L のボリュームのシリンジの D) のデバイス タイプのコードを決定します。DV に針を下げ: 脳表面から-1.50 mm。1 μ L のウイルスを注入するには、10 nL/秒、1.5 分間かけて約 1 μ L 注入のレートをプログラムします。</li>
	<li>注入が終了したとき、待機 30 の 30 を待って、0.5 mm 刻みで針を外し各回転の後の s。これは逆流と注入されたウイルスの漏れが減少します。</li>
	<li>Injection(s) が完了したときは、皮膚を緩めるし、露出の頭蓋骨を回復する鉗子を使用します。縫合頭皮 4.0 縫合糸を使用して、脳定位固定装置から、マウスを削除します。麻酔から必要な場合は、非加熱領域に脱出し、彼らは回復 (1-2 時間) を監視するマウスを許可する場所部分的加熱パッドの上に休んでケージ内マウス。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

脳の発達における ZIKV による被害の調査のため、新生児、胎児および成体の段階で、ZIKV の脳内接種法は、ここで説明しました。簡単である反面、研究者が研究の質と関係者の安全を確保できるように、いくつかの考慮事項があります。
DENV はフラビ ウイルス属の ZIKV に密接に関連します。DENV ない因果ヒトの小児脳疾患にリンクされています。DENV2 することができます?...

小頭症は、新生児の頭の平均サイズより小さいによって特徴付けられる欠陥脳開発から生じる状態です。小頭症児発育遅延、発作、知的障害、難聴、視覚障害と運動と病気の重症度に応じて、他の間でのバランスの問題を含むことができる症状の範囲を示すと1,2,3が発生します。この条件は多因子遺伝、感染エージェントと小頭症4,5,6,7,8の原因にリンクされている環境要因と自然の中 9。2015-2016 ZIKV 発生前に 10,000 出生 8 子供たちは CDC10によるとアメリカ合衆国に小頭症と診断されました。上 2 月 1日st 2016 年の世界保健機構宣言ジカ小頭症診断母親11、ZIKV 感染症に関連付けられての警急の増加に伴い、国際的懸念の公衆衛生緊急事態 12。アメリカ合衆国の ZIKV 例を CDC から最近の研究アメリカから感染個体と ZIKV 感染した母親の 4% と比較して小頭症を開発する子供のための 20 の高められた危険で母体の ZIKV 感染の結果がで起因したことを示唆しています。小頭症11児。小頭症関連付けられているブラジルの ZIKV 感染症から妊娠中に先天性欠損症の率は感染した母親が、ラテン アメリカの他の要因が高められた危険に貢献するかもしれないことを示す赤ちゃんの 17% まで影響を受けていると報告されています。13私たち知っている、ZIKV の小頭症と病態を神経前駆細胞 (NPC) 人口7,8,14がことが、脳の開発の ZIKV の完全な病態。とらえどころのないままです。さらに ZIKV 感染に伴う脳異常の基礎となる疾患のメカニズムを調査する動物モデルを開発することが重要です。
直接、ZIKV が脳の発達に与える影響を調査するには、最初 ZIKV7日 14.5 (E14.5) 脳の脳内接種を用いたマウス モデルを開発しました。この段階は、人間の妊娠14の最初の学期末の代表と見なされますとして選ばれました。この萌芽期の脳内注入法と子犬が生後第 5 (P5) 日まで生き残ることができる (〜 1 μ L 106組織培養感染量 (TCID50/mL) × 1.7)。これらの出生後の子犬は、同様に脳室の拡大、神経細胞の損失、軸索の希薄、アストログリオーシス、ミクログリア活性化12,15など感染した人間の幼児にみられる表現型の範囲を示します。新生児マウス脳が比較的成熟し、妊娠中期16, 人間の脳の発達段階に似ているとマウスの脳の発達に産後の主要なコンポーネントが含まれています。後妊娠期感染症研究では、生後感染症法が説明もされています。P1 で ZIKV に感染した新生児は、13 日間投与後に生き残ることができます。血生まれ大人の段階の感染は以前17を使用する必要がマウスに記載されているインターフェロン (IFN) 規制要因 (IRF) トランスクリプション要因 IRF-3、-5、-7 トリプル ノックアウトひずみ。このプロトコルでは、成人のマウスモデルの抗ウイルス応答を無効にすることを回避するために intraventricularly ZIKV を接種の方法について説明します。これはマウスの免疫回避中、注入のこのルートは典型的な感染経路を直接模倣しません。この矛盾に対処するため、直接、実験者は頭蓋内のルートの代わりに ZIKV の子宮内感染を実行できます。以前の仕事18から採用、この胚性感染症プロトコルでこの手法を簡潔に説明が。
ジカ ウイルスの系統がこの手法で実装 MEX1 447,19メキシコの分離、アフリカを分離氏-766 1947年20で分離があります。ジカ MEX1 44 感染したネッタイシマカから 2016 年の 1 月にメキシコのチアパス州で分離された蚊。テキサス大学医学部ガルベストン (UTMB) でアクセス権を持つこのウイルスを得た。さらに、デング ウイルス血清型 2 (DENV2) の比較研究ではこの手法を使用して接種しました。DENV2、ひずみ S16803 (GenBank GU289914 シーケンス)、1974 年にタイからの患者検体から分離され、c6/36 細胞で継代されました。ウイルスは継代 Vero 細胞で二度世界参照センター新興ウイルスのアルボ ウイルス媒介能 (WRCEVA) マウス注入前に。これはこのテクニックが同様に動作することを示して ZIKV と脳の発達に影響を与える可能性があります他の発現の多様な分譲。

<table><tbody><tr><td>Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor</td><td>Leica</td><td>39416001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stereotax</td><td>Kopf</td><td>04557R</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Microsyringe Pump Controller</td><td>WPI</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 UltraMicroPump</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Modulamp</td><td>Schott</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock tubing (19-gauge)</td><td>Hamilton</td><td>90619</td><td></td></tr><tr><td>Melting Point Capillary</td><td>Kimble</td><td>34500-99</td><td>Glass needle</td></tr><tr><td>Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25</td><td>No dilution; Use for practice injections</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L, Model 1701 LT SYR</td><td>Hamilton</td><td>80001</td><td>for embryonic inoculation</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>for neonate/adult</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon Nylon Sutures</td><td>Ethicon</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>VWR</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Fastgreen FCF Dye</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td>inject with 0.5% Dye</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flavivirus group antigen antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB10216</td><td>ms IgG2a 1:400 (&lt;strong class=&quot;xfig&quot;&gt;Figure 2&lt;/strong&gt;, &lt;strong class=&quot;xfig&quot;&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>Pax6</td><td>DBHB</td><td>Pax6-s</td><td>ms IgG1 1:20</td></tr></tbody></table>

establishing mouse models for zika virus-induced neurological disorders using intracerebral injection strategies: embryonic, neonatal, and adult

ジカ (ZIKV) は北、中央、南アメリカで現在流行フラビ ウイルスです。それは今、ZIKV が小頭症と他の脳の異常を引き起こす可能性が確立されます。しかし、発展途上の脳における ZIKV の発症メカニズムは不明のまま。脳内手術方法、正常と異常な脳の発達と脳の機能について質問に対処する神経科学の研究でよく使用されます。このプロトコルは、古典的な手術手技を利用し、マウス神経系におけるモデル ZIKV によるひと神経疾患を 1 つを許可する方法について説明します。直接脳接種ウイルス伝達の通常モードをモデル化しない、発展途上の脳の ZIKV 感染後結果に関しターゲットを絞った質問に調査官メソッドことができます。このプロトコルでは、ZIKV の脳室内投与の胎生期、新生児、および大人の段階について説明します。一度マスター、この方法は簡単で再現性のある手法を実行するいくつかの時間を取るだけであるになることができます。

胎生期脳の ZIKV 接種の注入方式の代表的なイメージが脳内注入 (図 1 a) を描いた図に示すように、子宮と胎盤注射 (図 1 b) を示す、妊娠中ダム方法、胚を閲覧、手術 (萌芽期接種プロトコル) を指向する必要があります。図 2 aは、E18.5 大脳皮質における ZIKV (MEX1-44) 感染 (緑フラビ ウイルス抗原に対する...

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Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

ここでマウスでジカ ウイルス小頭のモデルを確立するための手法について述べる。このプロトコルには、ジカの新生児、萌芽期、成人期の脳内接種法が含まれています。

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

establishing-mouse-models-for-zika-virus-induced-neurological

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K ビュー.  University of Georgia. ここでマウスでジカ ウイルス小頭のモデルを確立するための手法について述べる。このプロトコルには、ジカの新生児、萌芽期、成人期の脳内接種法が含まれています。

ビデオ: Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカ ウイルス感染症

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

発生生物学

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

神経科学

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

免疫・感染学

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions in newborn infants. While mosquitos are the main route of viral transmission, it has also been shown to spread via sexual contact and vertical mother-to-fetus transmission. In this latter case of transmission, due to the unique viral tropism of ZIKV, the virus is believed to predominantly target the neural progenitor cells (NPCs) of the developing brain.
Here a method for modeling ZIKV infection, and the resulting microcephaly, that occur when human cerebral organoids are exposed to live ZIKV is described. The organoids display high levels of virus within their neural progenitor population, and exhibit severe cell death and microcephaly over time. This three-dimensional cerebral organoid model allows researchers to conduct species-matched experiments to observe and potentially intervene with ZIKV infection of the developing human brain. The model provides improved relevance over standard two-dimensional methods, and contains human-specific cellular architecture and protein expression that are not possible in animal models.

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

This protocol describes a technique used to model Zika virus infection of the developing human brain. Using wildtype or engineered stem cell lines, researchers may use this technique to uncover the various mechanisms or treatments that may affect early brain infection and resulting microcephaly in Zika virus-infected embryos.

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.

デングウイルス誘発急性ウイルス脳炎様疾患のマウスモデル

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

神経炎症と神経毒性を評価するためのリポ多糖の仔魚への脳室マイクロインジェクション

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Developing an In Vitro Model of Zika Virus Infection in Cerebral Organoids

Source: Salick, M. R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56404">Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the establishment of an in vitro model of Zika virus infection in a developing brain. Human cerebral organoids containing rosettes of stem cells, neural progenitor cells (NPCs), and neurons are infected with the Zika virus. The virus infects NPCs and triggers apoptosis, disrupting organoid development.

脳オルガノイドにおけるジカウイルス感染のin vitroモデルの開発

1. Creating Cerebral Organoids from iPSC / hESC 2D Culture (Day 0)
Note: This protocol assumes that stem cell (SC) maintenance is conducted in xeno-free ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Infectious Diseases

Generation of a Murine Model with a Central Nervous System Infection

Source: Shen, T., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59132">A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the generation of a mouse model with a CNS infection. A suckling pup is injected with the virus both intracranially and intraperitoneally. The virus spreads, infecting the CNS causing neuronal cell death and inflammation. The pup is assessed for symptoms of infection as the disease progresses.

中枢神経系感染症を発症したマウスモデルの生成

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Establishing a Model of Zika Virus-Induced Neurodegeneration in an Adult Mouse

Source: Herrlinger, S. A. et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56486">Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates intracerebral injection of Zika virus suspension in an adult mouse to induce neurodegeneration. An anesthetized mouse is secured in a stereotaxic frame, and a hole is drilled into the exposed skull for injection. A suspension of the Zika virus is injected into the brain tissue. The viral infection causes inflammation, leading to neurodegeneration.

成体マウスにおけるジカウイルス誘発性神経変性のモデル確立

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Adult ...

脳内注入戦略を使用してジカウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

要約

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この動画の章

培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカウイルス感染症

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

ジカウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカウイルス感染症をモデル化

デングウイルス誘発急性ウイルス脳炎様疾患のマウスモデル

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

神経炎症と神経毒性を評価するためのリポ多糖の仔魚への脳室マイクロインジェクション

脳オルガノイドにおけるジカウイルス感染のin vitroモデルの開発

中枢神経系感染症を発症したマウスモデルの生成

成体マウスにおけるジカウイルス誘発性神経変性のモデル確立

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

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培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカ ウイルス感染症

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化

デングウイルス誘発急性ウイルス脳炎様疾患のマウスモデル

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

神経炎症と神経毒性を評価するためのリポ多糖の仔魚への脳室マイクロインジェクション

脳オルガノイドにおけるジカウイルス感染のin vitroモデルの開発

中枢神経系感染症を発症したマウスモデルの生成

成体マウスにおけるジカウイルス誘発性神経変性のモデル確立

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培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカウイルス感染症

ジカウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカウイルス感染症をモデル化