Name: plant promoter analysis: identification and characterization of root nodule specific promoter in the common bean
Uploaded: 2017-12-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
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この仕事は部分的に総局・ デ ・ Asuntos ・ デル ・によって支えられた個人的な Académico、DGAPA/PAPIIT-ウナム (付与なし。蘇州妙林鋼と M K に IA205117 IN219916A) と国立ナシオナル デ サイエンス y Tecnològia (CONACYT グラント号 240614 ミリリットルに)。

1. 識別、分離、およびp. 尋常性ニン プロモーターのクローニング
<ol>
	<li>興味の遺伝子のプロモーターを識別します。Phytozome、Ensembl 植物、NCBI、等A マメ科植物プロモーター P. 尋常性ニン (PvNIN; などの植物に使用できるいくつかのゲノム データベースと解析ツールがあります。Phvul.009G115800) はこの研究20で使用されました。</li>
	<li>デザイン oligos ゲートウェイまたはクローニング ベクトル システムによって従来の制限の酵素のためには、(図 1 a) が使用されます。 注: 標準 (25-35 bp) 脱塩プライマー作業罰金。プロモーターと遺伝子との間に逃げ逆オリゴ シーケンスがお勧めです。</li>
	<li>新鮮単離P. 尋常性から PvNIN プロモーター領域 (または興味の遺伝子のプロモーター領域) を増幅する DNA のプロモーター固有オリゴ セットを使用して。高品質なポリメラーゼを使用し次の PCR 条件: 95 ° C、5 分。30 サイクル (95 ° C、30 s、55 ° C、30 秒、1 分の 72 ° C);5 分のための 72 ° C。</li>
	<li>60 V 7 × 10 cm ゲル トレイ上で 1% アガロースゲルで増幅されたフラグメントを実行し、対応する私アンプリコンを溶出 (700 bp、図 1 b) と製造元の指示に従って力がある pENTR/D ・ TOPO ベクターにクローン。</li>
	<li>2 μ L の有能なエシェリヒア属大腸菌に反応を変換ホストゲノム弟 (LB) 50 mg/L カナマイシン (Kan50) を添加した製造元の指示と変換の混合物のプレート 150 μ L を用いた細胞します。37 ° C でめっきされたセルを一晩成長します。</li>
	<li>3-6 植民地およびそれらは Kan50 を含む LB 培地で一晩培養を選択します。プラスミッドの選択法を用いた DNA を分離し、ベクトル特定 M13 oligos を用いた PCR によるプラスミドを分析します。PCR プラスミド 12:03 oligos の使用 100 ng の 10 X PCR バッファーの U Taq DNA ポリメラーゼ、10 mM dNTPs の 0.5。</li>
	<li>使用して、次の PCR 増幅条件;95 ° C、3 分。30 サイクル (95 ° C、30 s、58 ° C、30 秒、75 のための 72 ° C s);72 ° C で 7 分間は 1% の agarose のゲルの PCR の製品を可視化します。正しい挿入が 324 bp バンド (図 1) を持っている 1,024 の bp とベクトルの挿入はなしでバンドを持っていることを確認します。</li>
	<li>LR 反応エントリ ベクトル (力がある pENTR/D-トポ-PvNIN) と宛先ベクトル pBGWFS7.021を製造元の指示に従って市販酵素ミックスを使用してを実行します。</li>
	<li>2 μ L の有能なエシェリヒア属大腸菌に LR 反応を変換スペクチノマイシン (Spe100) 100 mg/L を添加したポンドに製造元の指示と変換の混合物のプレート 150 μ L で説明したように標準的な手法を用いた細胞します。37 ° C でめっきされたセルを一晩成長します。</li>
	<li>約 5 コロニーをピックアップし、Spe100 を含む LB 培地で一晩培養それら。プラスミッドの選択法を用いた DNA を隔離し、プロモーター固有 oligos を用いた PCR によるプラスミドを分析します。</li>
	<li>手順 1.3 の PCR 条件を使用します。増幅を確認する 1% の agarose のゲルの PCR の製品を視覚化します。Amplicons が 700 bp。</li>
	<li>チップの信頼性を検証するプロモーター固有 oligos と肯定的なプラスミド pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (図 1) をシーケンスします。</li>
	<li>A. 体の獲得ひずみ K599 (ただし、 a. 体の獲得の他の系統を使用可能) に、プラスミドを変換します。次の設定で electrocompetent 細胞と 1 mm キュベットで electroporate を 50 μ l 添加するプラスミッドの準備の 2 μ L を追加: 1.8 kV、25 μ F、200 Ω。</li>
	<li>細胞を回復 〜 500 μ L の SOC 媒体振る 2 英ポンド Spe100 のプレートの 28 ° c と 28 ° C で 2 日間の成長します。</li>
	<li>前述のステップ 1.7 でコロニーのスクリーニングを実行し、手順 1.3 のように PCR 条件を使用します。肯定的なクローンからグリセロールを行い、-80 ° C で保存</li>
	<li>A. 体の獲得文化陰性対照として空 pBGWFS7.0 ベクトルをかくまっているを使用します。</li>
</ol>
2 A. 体の獲得は一般的な豆の毛状根を変換。
<ol>
	<li>蒸気滅菌する (P. 尋常性品種黒人 Jamapa) の種子 (約 20) 1 分の 96% エタノール 50 mL とエタノール; を破棄層流フードの一定の混合での 10 分間 20% の漂白剤 (次亜塩素酸ナトリウム) の 50 mL を加えます。漂白剤を削除し、過剰な滅菌水で 3 回洗います。 注: 他のP. 尋常性品種は、毛状根の誘導に使用できます。</li>
	<li>ブロートンで湿らせた滅菌フィルター ペーパーに滅菌の種子を発芽 &#38; ディルワース (B &#38; D) ソリューション22 (表 1) の 28 ° C で暗闇の中 2 日間</li>
	<li>変換前に、の日は、次のものを準備してください。
	<ol>
		<li>固体の LB Spe100 のバイナリのベクトル (1.13 と 1.14 の手順で準備) をかくまっているA. 体の獲得文化の 150 μ L を連勝、一晩 28 ° C で育ちます。</li>
		<li>15 mL チューブを詰めて B &#38; D ソリューションと置換二重層状アルミ箔でスクリュー キャップ。B の 10 mL を含む 22 cm のガラス管を組み立てる &#38; D ソリューション (図 2) とオートクレーブそれ。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>変換の日、次の滅菌材料の層流フードを組み立てる: 手順 2.2 から種子、培養プレート ステップ 2.3.1、ステップ 2.3.2 からチューブ、滅菌二重蒸留水 (10 mL)、ピペット、ピペット チップ、滅菌鉗子から発芽・ 3 mL 注射器。</li>
	<li>曲がって 200 μ L tip を使用して、遠心管にプレートからA. 体の獲得細胞をこすりし、二重の滅菌水 1 mL で再懸濁します。同様に、ベクトル制御の細胞を個別に準備します。
	<ol>
		<li>再懸濁しますに優しく細胞をミックスします。ボルテックスにかけないでください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2.3.2 滅菌ピペット チップを使用しての手順からチューブのアルミ箔に 3 mm の穴を確認します。</li>
	<li>注射器 2.5 ステップからセル (プロモーターまたはベクトル制御) を収集し、少し針の先端 (図 2) と発芽種子の胚軸を刺します。 注: 針貫通 (4-6 回) 維管束組織を確認し、小さな注入 (~ 5 μ L) 胚軸まわりの異なった位置で傷の細胞が値下がりしました。</li>
	<li>B を含む 15 mL チューブの 3 mm の穴に挿入された苗の根を慎重に挿入 &#38; D ソリューション。22 mL ガラス管全体のセットアップに戻すし、湿度を維持するためにそれらを封印します。</li>
	<li>16 h 光: 8 の 28 ° C で維持成長槽内管を孵化させなさい h 暗い日長。 ノート: インキュベーション後、3-4 日植物に育つ 22 mL ガラス管の縁。</li></ol>この段階で、キャップをはずし、図 2 iで示すように、幹の周りパラフィルムで縁をシールします。
	<li>5-7 日で負傷のサイトでカルスを観察し、見つける 〜 10-12 日の変換後に 2 cm 毛状根。 注: それは B を維持するために重要な &#38; 常にプラスチックやガラス管で D ソリューション。</li>
	<li>2 週間後毛状根の下 2 cm の幹を切断することによってプライマリ ルートを削除し、滅菌バーミキュ ライトを入れたポットに根を移植します。成長室 (16 h 光: 8 h 28 ° C で暗い) の工場を維持し、B と灌漑 &#38; D ソリューション。</li>

3. プロモーター解析: ニン プロモーター式、インゲンの根粒菌の結節
<ol>
	<li>根粒の誘導、PY 培 (0.5 g ペプトン、酵母エキスを 0.3 g) 700 ミリメートル CaCl2と 20 mg mL− 1と 100 ml tropici 根粒菌や根粒菌 etli (一般的なマメに対応している) を接種します。ナリジクス酸。24 h の 30 ° C で 300 rpm で振とうしながらインキュベートします。 注: 任意の特定の抗生物質は、形質転換根粒菌の場合される可能性があります。</li>
	<li>常温 2,800 × g で 3 分間遠心分離機でセルをペレットし、10 mM MgSO4の 10 mL で再懸濁します。10 mM MgSO4希釈による外径600 0.6 にセルの外径を調整します。</li>
	<li>あたりの毛状根に根粒の成長を誘導する植物 (プロモーターおよびベクトル制御) (3.2 から準備) 文化の 1-2 mL を接種します。B が付いている植物に水を引く &#38; 根粒形成を促進するために限られた窒素 (2 mM 自演3) D ソリューション。</li>
	<li>実験の必要性によって異なる時点で毛状根を収集します。3-5 日間感染スレッドを勉強するための収集のサンプルの記事接種 (dpi)。 注: 原始結節と若い結節で調査 6 9 dpi と解像度 10-12 日、それぞれ。最後に、成熟しており、機能性結節は 14-21 dpi とで senesced 結節で学ぶことができます &#62; 28 dpi。</li>
	<li>レポーター遺伝子 (ガスまたは GFP) の活動のための根粒を処理します。ジェファーソン23で記述されたプロトコルに従ってガスの利用状況を分析します。GFP を蛍光顕微鏡下で観察します。青いアルゴン イオン レーザーを用いた GFP の蛍光性を刺激 (488 nm)、510 から 540 へ放出される蛍光の収集と nm。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hern&#225;ndez-Garcia, C. M., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+promoters+and+cis-actingregulatory+elements.">Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements.</a> Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).</li><li>Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+Thirst+for+Genome+Sequencing,+Data+Interpretation,+and+Database+Usage+in+Genomic+Era:+The+Road+towards+Fast-Track+Crop+Plant+Improvement.">Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement.</a> Genetics Research International. , 684321 (2015).</li><li>Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplast+isolation,+transient+transformation+of+leaf+mesophyll+protoplasts+and+improved+Agrobacterium-mediated+leaf+disc+infiltration+of+Phaseolus+vulgaris:+Tools+for+rapid+gene+expression+analysis.">Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis.</a> BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).</li><li>Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+localization+of+a+symbiosis-specific+phosphate+transporter+is+mediated+by+a+transient+reorientation+of+secretion.">Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).</li><li>Kryvoruchko, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MtSWEET11,+a+Nodule-Specific+Sucrose+Transporter+of+Medicago+truncatula.">MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).</li><li>Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+regulation+of+cortical+cell+division+during+root+nodule+development+in+Lotus+japonicus+is+accompanied+by+auxin+response.">Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response.</a> Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).</li><li>Suzaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication-mediated+initiation+of+symbiotic+organ+development+in+Lotus+japonicus.">Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus.</a> Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).</li><li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-affinity+phosphate+transporter+GmPT5+regulates+phosphate+transport+to+nodules+and+nodulation+in+soybean.">The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean.</a> Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).</li><li>Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Functional+Analysis+of+a+Novel+Group+of+Legume-specific+WRKY+and+Exo70+Protein+Variants+from+Soybean.">Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean.</a> Sci Rep. 6, 32090 (2016).</li><li>Montiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene+is+required+for+root+infection+by+Rhizobia.">A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia.</a> Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).</li><li>Arthikala, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PvRbohB+negatively+regulates+Rhizophagus+irregularis+colonization+in+Phaseolus+vulgaris.">PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris.</a> Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).</li><li>Arthikala, M. K., S&#225;nchez-L&#243;pez, R., Nava, N., Santana, O., C&#225;rdenas, L., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RbohB+a+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene,+enhances+symbiosome+number,+bacteroid+size,+and+nitrogen+fixation+in+nodules+and+impairs+mycorrhizal+colonization.">RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization.</a> New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).</li><li>Barraza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+PvTRE1+enhances+nodule+biomass+and+bacteroid+number+in+the+common+bean.">Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean.</a> New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).</li><li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autophagy-related+kinase+is+essential+for+the+symbiotic+relationship+between+Phaseolus+vulgaris+and+both+rhizobia+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi.">An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).</li><li>Nanjareddy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legume+TOR+Protein+Kinase+Regulates+Rhizobium+Symbiosis+and+Is+Essential+for+Infection+and+Nodule+Development.">A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development.</a> Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).</li><li>Fr&#252;hling, M., Schr&#246;der, G., Hohnjec, N., P&#252;hler, A., Perlick, A. M., K&#252;ster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+the+Vicia+faba+L.+gene+VfEnod12+encoding+an+early+nodulin+is+active+in+cortical+cells+and+nodule+primordia+of+transgenic+hairy+roots+of+Vicia+hirsuta+as+well+as+in+the+prefixing+zone+II+of+mature+transgenic+V.+hirsuta+root+nodules.">The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules.</a> Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).</li><li>Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+Sesbania+rostrata+leghemoglobin+glb3+gene+5'-upstream+region+in+transgenic+Lotus+corniculatus+and+Nicotiana+tabacum+plants.">Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants.</a> Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).</li><li>Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+network+governing+nodule+organogenesis+and+infection+in+the+model+legume+Lotus+japonicus.">The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus.</a> Nat Commun. 12, 1-10 (2010).</li><li>Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseolus+vulgaris+RbohB+functions+in+lateral+root+development.">Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development.</a> Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).</li><li>Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., G&#243;mez, B. M., Blanco, L., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+expressed+genes+in+mycorrhized+and+nodulated+roots+of+common+bean+are+associated+with+defense,+cell+wall+architecture,+N+metabolism,+and+P+metabolism.">Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).</li><li>Karimi, M., Inz&#233;, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li><li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+leghemoglobin+synthesis+in+snake+beans.">Control of leghemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li><li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+chimeric+genes+in+plants,+the+GUS+gene+fusion+system.">Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system.</a> Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).</li><li>Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+induction+of+soybean+hairy+roots+and+propagation+of+the+soybean+cyst+nematode.">High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode.</a> Planta. 210 (2), 195-204 (2000).</li><li>Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Composite+Plants+in+Medicago+truncatula+used+for+Nodulation+Assays.">Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).</li><li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+expression+of+hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+roots+and+root+nodules.">Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules.</a> Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).</li><li>Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+Root+Transformation+in+Lotus+japonicus.">Hairy Root Transformation in Lotus japonicus.</a> Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).</li><li>Jacobs, T. B., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+CRISPR+Vector+Construction+and+Characterization+of+DNA+Modifications+by+Generation+of+Tomato+Hairy+Roots.">High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots.</a> J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).</li><li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-transformation+of+the+Phaseolus+spp.:+a+tool+for+functional+genomics.">Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics.</a> Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).</li></ol>

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遺伝子の機能解析の中には、遺伝子発現パターンの研究は生体内で遺伝子の空間的で、一時的な規則を理解する上で重要な役割を果たしています。遺伝子発現パターンを勉強するよく知られているメソッドは、興味の遺伝子プロモーター領域のクローンを作成する蛍光マーカー遺伝子(GFP、RFP 等)など β-グルクロニダーゼ レポーター遺伝子の上流。ここで、ルート結節の共生 (RNS...

プロモーターは、興味の遺伝子の発現調節機構を理解する上で重要な役割を果たす重要な分子生物学的ツールです。プロモーターは、dna 塩基配列を上流にある翻訳の系列の遺伝子の開始コドンと彼らを運ぶ遺伝子の中央の規制情報したがって、正しい注釈、特性は、遺伝子の機能を理解することに不可欠です。発現パターンに応じて植物プロモーターは、構成、組織固有または開発段階固有および誘導の1として分類されます。トランスクリプトーム技術、コンピュータ モデルの改善および別の植物種のためのゲノム配列の数の増加の可用性の進歩はプロモーター配列2の大規模な予測を容易にしました。
その一方で、プロモーター評価ツールと、高速で効率的、かつ再現性のある形質転換技術の確立に重要ですも。他のモデル植物とは異なり、豆マメ (P. 尋常性) の共通の遺伝子の機能解析はインゲンマメsp 安定な形質転換のための反抗的な性質のために主に阻害します。一時的な変形システムは、迅速な遺伝子機能解析研究3のための代替として機能します。マメ科共生研究のマメ科植物と根粒菌の相互作用は、根粒特異遺伝子のプロモーターの研究機能の解析に最も扱いやすいモデル システムの 1 つです。これまでのところ、これらの共生に関連するいくつかのマメ科植物プロモーターがされている特徴、すなわち、ウマゴヤシ分子PT44SWEET115、ミヤコグササイクロプス UBQ6VAG17、グリシン最大 PT58Exo70J9, P. 尋常性RbohB10、11,12、TRE113、PI3K14、TOR15、など。Cis要素直接遺伝子に影響を与えます。転写因子 ENBP1A は初期 nodulin VfENOD12 のCisの規制地域 (−692 bp) に結合し、これはソラマメ16の根粒原基におけるレポーター遺伝子の発現を促進します。Cisの規制領域の置換 (−48 bp −161) 根粒特異プロモーターの異種のレグヘモグロビン GLB3 プロモーター δ p35S と δ pNOS、根粒特異性の損失で起因し、プロモーター活性17 低下.
以前のレポートを示す転写因子ニン根毛細胞における根粒菌感染の開始に必要なミヤコグサ18根粒器官形成に欠かせないも.現在の研究では、識別、分離、クローニングおよび一般的な豆毛状根における根粒特異プロモーターのキャラクタリゼーションのためのプロトコルについて述べる。、これを達成するためには、 P. 尋常性の根粒菌共生固有ニン プロモーターを選択され、キメラ記者 GUS enhanced::GFP 転写融合のクローンします。さらに、このプロトコルでは、 A. 体の獲得による毛状根を用いたP. 尋常性における遺伝的変換処理の迅速かつ汎用性の高いシステムについて説明します。このシステムは、変換後の 2 週間以内に毛状根を生成します。最後に、GUS 染色によって植民地化された根粒菌根粒でニン プロモーターの時空間の発現を検討しました。
ここで説明する手順は、だけでなく、マメ科植物の根粒形成と mycorrhization の11の研究でも根19プロモーター発現パターンの調査のために役立ちます。さらに、このプロトコルは、非専門の所で使いやすいです。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Primers for qRT-PCR assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Forward</td><td>CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Reverse</td><td>CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Forward</td><td>GTA AAA CGA CGG CCA G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Reverse</td><td>CAG GAA ACA GCT ATG AC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K243520</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme Mix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791100</td><td></td></tr><tr><td>pBGWFS7.0&amp;nbsp;</td><td>Plant systems biology</td><td>https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>11708013</td><td></td></tr><tr><td>Certified Molecular Biology Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>1613102</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-250G</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological peptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7654</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sigma</td><td>Sigma 1-14K</td><td></td></tr><tr><td>Gel documentation unit</td><td>Carestream</td><td>Gel Logic 212 PRO</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC</td><td>Thermo scientific</td><td>EW-51708-70</td><td></td></tr><tr><td>Plant growth chamber</td><td>MRC</td><td>PGI-550RH</td><td></td></tr><tr><td>Horizantal laminarair flow cabinate</td><td>Lumistell</td><td>LH-120</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Leica</td><td>DM4500 B</td><td></td></tr><tr><td>Petridish</td><td>sym laboratorios</td><td>90X15</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blade</td><td>Fisher scientific</td><td>53223</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>22 mL glass tubes</td><td>Thomas scientific</td><td>45048-16150</td><td></td></tr></tbody></table>

plant promoter analysis: identification and characterization of root nodule specific promoter in the common bean

シーケンスを符号化する遺伝子の上流の配列は、プロモータ配列として名づけられます。プロモーターの発現パターンを勉強している非常に重要な遺伝子発現制御と標的遺伝子の時空間の発現パターンを理解します。その一方で、プロモーター評価ツールと、高速で効率的、かつ再現性のある形質転換技術の確立に重要ですも。この研究では、遺伝子組換えの毛状根のインゲンの根粒菌の共生固有結節創業 (NIN) プロモーターの時空間の発現パターンを調べた。植物ゲノム データベースと我々 を識別、分析ツールを使用して孤立してキメラの記者に転写融合でP. 尋常性ニン プロモーターをクローン (GUS) の β-グルクロニダーゼ活性ガス enhanced::GFP。さらに、このプロトコルは、 P. 尋常性サツマイモネコブセンチュウによる毛状根を用いた遺伝的変容の迅速かつ汎用性の高いシステムを説明します。このシステムでは、変換後 10 〜 12 日間で ≥2 cm 毛状根を生成します。次に、根粒菌接種後接種の定期的な間隔で毛状根におけるニン プロモーターの時空間表現を評価しました。ガスの活動によって描かれた結果表示ニン プロモーターが根粒形成のプロセス中にアクティブだった。一緒に、この議定書は、識別、分離、クローン、および一般的な豆毛状根の植物プロモーターを特徴付ける方法を示します。さらに、このプロトコルは、非専門の所で使いやすいです。

本研究の目的は、根粒特異P. 尋常性ニンの時空間の表現パターンを評価することだった。これを行うには、700 bp の領域は上流のニン遺伝子の翻訳開始コドンが選ばれ、oligos のセットは、図 1 aに示されている、設計されました。高忠実度のポリメラーゼを使用して、ニン プロモーター断片が増幅された、(図 1 b</stron...

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Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

植物プロモーター解析: 同定とルート、インゲンの根粒特異的プロモーターの解析

プロモーター発現解析は遺伝子の規則の理解と標的遺伝子発現の時空間を改善するために重要です。ここを識別、分離、および植物プロモーターのクローンを作成するためのプロトコルを提案する.さらに、一般的な豆毛状根における根粒特異プロモーターの特性について述べる。

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

plant-promoter-analysis-identification-characterization-root-nodule

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K ビュー.  Escuela Nacional de Estudios Superiores Unidad León- Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). プロモーター発現解析は遺伝子の規則の理解と標的遺伝子発現の時空間を改善するために重要です。ここを識別、分離、および植物プロモーターのクローンを作成するためのプロトコルを提案する.さらに、一般的な豆毛状根における根粒特異プロモーターの特性について述べる。

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An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

根の生長およびローカライズされた栄養素に対する反応性を可視化する最適化された Rhizobox プロトコル

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...

環境学

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an Agrobacterium rhizogenes mediated transformation system on pigeon pea. The stem is infected with A. rhizogenes carrying a binary vector, which induced callus after 7 days and adventitious roots 14 days later. The generated transgenic hairy root was identified by morphological analysis and a GFP reporter gene.To further illustrate the application range of this system, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) was transformed into pigeon pea using this transformation method. The transgenic plants were treated with jasmonic acid (JA) and abscisic acid (ABA), respectively, for the purpose of testing whether CcCIPK14 responds to those hormones. The results demonstrated that (1) exogenous hormones could significantly upregulate the expression levelof CcCIPK14, especially in CcCIPK14 over-expression (OE) plants; (2) the content of Genistein in CcCIPK14-OE lines was significantly higher than the control; (3) the expression level of two downstream key flavonoid synthase genes, CcHIDH1 and CcHIDH2, were up-regulated in the CcCIPK14-OE lines; and (4) the hairy root transgenic system can be used to study metabolically functional genes in non-model plants.

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

Here we present an efficient and stable transformation system for the functional analysis of the CcCIPK14 gene as an example, providing a technical basis for studying the metabolism of non-model plants.

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an ...

遺伝学

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

発生生物学

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper describes methods optimized to isolate plant-derived polyribosomes and their associated mRNAs to be analyzed using RNA-sequencing. First, cytoplasmic lysates are obtained through homogenization in polysome- and RNA-preserving conditions from whole, frozen soybean nodules. Then, lysates are cleared by low-speed centrifugation, and 15% of the supernatant is used for total RNA (TOTAL) isolation. The remaining cleared lysate is used to isolate polysomes by ultracentrifugation through a two-layer sucrose cushion (12% and 33.5%). Polysome-associated mRNA (PAR) is purified from polysomal pellets after resuspension. Both TOTAL and PAR are evaluated by highly sensitive capillary electrophoresis to meet the quality standards of sequencing libraries for RNA-seq. As an example of a downstream application, after sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to obtain differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels. In summary, this method, in combination with RNA-seq, allows the study of the translational regulation of eukaryotic mRNAs in a complex tissue such as the symbiotic nodule.

This protocol describes a method for eukaryotic polysome purification from intact soybean nodules. After sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to identify differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels.

ダイズ共生団塊からのポリソーム精製

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

の複合植物の世代ウマゴヤシtruncatula根粒形成のアッセイに使用

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

生物学

遺伝子組み換えダイズ毛根の高効率生産

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with soil-borne microbes that form symbiosis to fix nitrogen and pathogens, which makes research involving soybean root genetics of prime importance to improve its agricultural production. The genetic transformation of soybean hairy roots (HRs) is mediated by the Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB2659 (K599) and is an efficient tool for studying gene function in soybean roots, taking only 2 months from start to finish. Here, we provide a detailed protocol that outlines the method for overexpressing and silencing a gene of interest in soybean HRs. This methodology includes soybean seed sterilization, infection of cotyledons with K599, and the selection and harvesting of genetically transformed HRs for RNA isolation and, if warranted, metabolite analyses. The throughput of the approach is sufficient to simultaneously study several genes or networks and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches.

著者スポットライト:遺伝子機能解析のためのダイズ毛根形質転換  

Here, we present a protocol for the high-efficiency production of transgenic soybean hairy roots.

遺伝子機能解析のためのダイズ毛状根形質転換

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

生物工学

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

側根誘導系で<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;とトウモロコシ

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

植物プロモーター解析: 同定とルート、インゲンの根粒特異的プロモーターの解析

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根の生長およびローカライズされた栄養素に対する反応性を可視化する最適化された Rhizobox プロトコル

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

ダイズ共生団塊からのポリソーム精製

の複合植物の世代ウマゴヤシtruncatula根粒形成のアッセイに使用

遺伝子機能解析のためのダイズ毛状根形質転換

遺伝子機能解析のためのダイズ毛状根形質転換

遺伝子機能解析のためのダイズ毛状根形質転換

側根誘導系で