Name: nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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この作品は、GM055279、CA116034 および CA163489 によって賄われていた。

1 バッファーと機器の準備 <ol><li>4時 45 mL 細胞破壊爆弾・ 15 mL チューブ ・遠心管を冷やす ° c</li>。
	<li>準備と 25 mL の 4 ° C 追加 1 つプロテアーゼ阻害剤のタブレットは使用前に 2 x 10 の 7 セルあたり均質化バッファーを寒さ 。
	注: 通常、均質化バッファーの KCl はより塩化ナトリウムが細胞内の塩類組成を反映ではなくに含まれています。このプロトコルで使用する均質化バッファーは、10 mM HEPES ph 7.4 では、10 mM KCl と 1.5 mM MgCl 2 (低張性均質化バッファーとしてという) で構成されます。ほとんどのバッファーは窒素のキャビテーションのために適応することができます (ディスカッション を参照してください).</li>
	<li>の準備で 4 ° C 追加プロテアーゼ阻害剤錠使用前に新鮮なサンプルあたり Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) バッファー x 1 の 6 mL を寒さと 。
	注: このプロトコルで使用される PBS バッファー pH 7.4 では、1.8 mM KH 2 PO 4、137 mM NaCl と KCl 2.7 mM で 10 mm Na 2 HPO 4 で構成されています</li>。
	<li>準備可溶化バッファー使用直前の 4 ° C 追加 1 つのプロテアーゼ阻害剤のタブレットでサンプルごとの 4 つの mL を寒さと 。
	注: このプロトコルで使用される可溶化バッファーは 1 の x Radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファー pH 7.4 では、150 mM の NaCl、0.1 %sds、デオキシ コール酸ナトリウム 0.5%、1%、25 mM Tris から成っている NP 40。4.6 の注を参照してください</li>。
</ol> 2。セル収穫 型のセルの <ol>推奨で 10 9 ティッシュ文化セル x 2 x 10 の成長 7-10 <li>培地。通常、1 つの 15 cm 皿利回り 2 x 10 7 HEK 293 細胞 DMEM で 90% の confluency ( 図 1) にします</li>。
	<li>真空によって成長媒体を削除します</li>。
	<li>付着性のセルのため氷の上の培養皿を配置、チルド均質化バッファー 2 倍 (10 mL 洗浄あたり 15 cm 皿あたり) で軽く文化皿で直接細胞を洗浄し、適切な量で大細胞スクレーパーとセルを収穫均質化バッファー;浮遊細胞の場合収集しチルド均質化バッファー 2 倍 (10 mL 洗浄あたり 50 mL カルチャごと) 4 ° C、5 分で 500 x g スピンに細胞ペレットを洗って、氷の上の均質化バッファーの適切なボリュームで洗浄細胞ペレットを再懸濁します。 注: ボリュームは、細胞破壊爆弾で許可される最小/最大ボリュームと同様に、意図されていた実験の蛋白質の集中の要件に基づく必要があります。一般的なガイドラインは 2-10 10 7 セル/mL、x またはセルの約 10 巻ペレットします。このプロトコルは、2 mL の均質化バッファーの HEK 293 の細胞の 3 つの 15 cm 料理に最適です</li>。
</ol> 3。窒素キャビテーション <ol><li>波紋上氷浴で清潔でチルド爆弾への転送細胞懸濁液プレートします 。
	注意: 爆弾、高圧、低温、窒素ガス &#8211; 適切な個人用保護具 . を着用</li>
	<li>爆弾の中マイクロ電磁攪拌棒を置き、懸濁液の均質性を維持するために攪拌プレートをオンにします</li>。
	<li>懸濁液に 1 つのプロテアーゼ阻害剤タブレットを追加し、メーカーごとの爆弾を閉じます &#39; s 命令</li>。
	<li>徐々 に加圧窒素ガスのタンク メーカーごとに爆弾 &#39; 爆弾圧力計まで s 命令は 300 に 600 psi を読み取ります。すべてのバルブを閉じ窒素タンクを切断しています 。
	注: セルの種類によって必要な圧力が異なります。Jurkat、NIH 3T3 HEK 293 の細胞の 400 に 350 psi でキャビテーションを行ったここ</li>。
	<li>窒素に分解し、細胞内で平衡に達するように 20 分待つ</li>。
	<li>布タオルを使用して吐出バルブ周りの余分な水を削除します。磨砕液の滴下しリリースを達成し、前冷蔵 15 mL チューブに収集に優しく吐出バルブを開きます 。
	注: コレクションの末尾近くあるホモジネートのスパートとシューという音とともにガスが出てくる。ガスがないことを確認してください以前に収集された原因はチューブから撮影する妨 (それ故に 15 mL の使用チューブ 1.5 mL チューブの代わりに)。スパートを開始すると、吐出バルブを閉じて、減圧爆弾と爆弾の残りのセルのキャビテーションを達成するために突然窒素入口弁を開きます。オープンは爆弾の妨の回復と徹底的に掃除します 。
	注: 上の泡と乳白色の外観は、最終的な cavitate 必要があります。ピペット チップ遠心分離前に沈静化して泡を許可すると優しくかき混ぜる 。
	注: は、均質化の効率を判断する位相差顕微鏡による、cavitate を確認します。15 μ L のドロップを追加、coverslip でカバーして顕微鏡スライドの表面に空洞を作る。20 × 対物で 3.4 3.6 多すぎる場合にのみ切れ目のない細胞が検出手順を繰り返します 。
	注: 均質化バッファーに EDTA またはグリコールエーテルジアミン四酢酸を含まない場合に追加収集した退院後 5 分以内 1 mM の最終的な集中を妨します</li>。
</ol> 4。Cytosolic と膜画分の分離 切れ目のない細胞や核を削除する 4 ° C で 10 分間の <ol><li>遠心分離機 500 x cavitate g. 
	注: は遠心分離のステップを繰り返して表示されているペレットは生成されませんし、上部に浮かぶ泡を回避しながらポスト核上清 (PNS) を収集します。必要に応じてさらに収集し、PNS を結合するフォームを再遠心分離機 ( 図 1).</li>
	<li>は、関心の分数を取得する必要に応じて、PNS を処理します。ゾル性細胞質の分離と膜の一部分を目的として遠心チューブに PNS を転送し、必要に応じて遠心を行います。このプロトコルが最適です、&#60; 3.5 mL サンプル 4 で 1 時間 350,000 × g で遠心、ポリカーボネート製遠心管に ° C</li>
	<li>(S 分画) 上清 1 mL ピペットを使用してを収集します</li>。
	<li>は、それを乱すことがなく慎重に 3 mL の冷 PBS でペレットをすすいでください。真空によって PBS を削除します 。
	注: ゾル性細胞質蛋白質によって膜画分の汚染がサンプルの損失より大きい問題は、ペレット寒さの PBS と 4.2 の手順と再遠心の 3 mL に再懸濁します。真空によって PBS を削除します</li>。
	<li>は好みの洗剤を含む可溶化バッファーの適切なボリュームでペレットを完全に再懸濁します。セルの等価を達成、内局として可溶化バッファーの同じボリュームを使用します 。
	注: 効率的な膜蛋白質の抽出のための可溶化バッファーとして 1 x RIPA バッファーを使用してお勧めします。下流のアッセイが膜画分の必要ない場合は、最大膜たんぱく質抽出用 1 x laemmli サンプル バッファーを使用します 。
	メモ: 提案は外れ、最大膜蛋白質の抽出のための 4 ° C で管上クリーン チューブ可溶化バッファーにペレットを転送します 。
	注: ペレットが目から効率的に削除する粘り (あまりにも多くの脂質) の場合e 可溶化バッファーの超遠心機チューブ スナップおすすめペレットを液体窒素で凍結、ペレットは分解する前にすぐにミニ金属ヘラで超遠心機チューブからペレットを外れします 。
	注: また、膜ペレットだけ再停止できない膜小胞懸濁液、遠心分離のステップ 4.6 の場合は不要の P 分数を生成する洗剤を含むバッファー中に溶解しました。膜協会に依存する酵素活性などの機能を調査するときその P 端数が役に立つ</li>。
	<li>4時 10 分卓上遠心分離機で 20,000 × g ステップ 4.5 から完全に可溶化されたペレット懸濁液を遠心分離機 ° C 上清 1 mL ピペット (P の一部) を使用してを収集し、ペレット (不溶性の脂質) を破棄します</li>。
	<li>ゾル性細胞質や膜画分を用いてウェスタンブロッティングなど必要なアッセイを実行または将来使用するため-80 ° C で保存します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+on+the+move:+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies.">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li><li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling.">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li><li>Simpson, R. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1-interacting+adapter+molecule+(RIAM)+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector.">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking.">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li><li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation.">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li><li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46.">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li><li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event.">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li><li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature,+tubulin+concentration,+and+associated+proteins.">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

機械的破壊の他の方法に比べて窒素キャビテーションの利点は多様です。おそらく最も重要なメリットは、静かにはまだ効率的に標本を均質化する能力です。生成の局所加熱ダメージの代わりに減圧冷却試料の物理的原理は超音波など摩擦/せん断ベースの技術。キャビテーションも細胞膜を混乱させるに非常に効率的です。窒素の気泡が解凍、キャビテーション プロセス個々 のセル内では?...

細胞蛋白質は 2 つのクラスに分けることができます: これらの膜に関連付けられています。非膜準蛋白質は、細胞質、核質、小胞体 (ER) などの細胞小器官のルミナで発見されます。膜準蛋白質、整数部と周辺の 2 つのクラスがあります。不可欠な膜タンパク質は、ポリペプチド鎖の 1 つ以上のセグメントが通常は α ヘリックスの疎水性アミノ酸の構成として膜をまたがっているために、膜貫通タンパク質とも呼ばれます。膜貫通タンパク質の生合成の過程で膜に挿入される co-translationally、彼らが異化されてまで、構成されています。周辺膜蛋白質は膜脂質など疎水性分子の翻訳後修飾の結果として通常第二に駆動されます。不可欠な膜タンパク質と対照をなして周辺膜蛋白質の細胞膜との関連付けと戻すことは調整することができます。シグナル伝達経路と膜との規制関連で多くの周辺膜蛋白質機能の有効化または経路を阻害するメカニズムの 1 つであります。周辺膜蛋白質であるシグナリング分子の 1 つの例は、小さな GTPase、RAS です。ファルネシルピロリン酸脂質修飾を含むポスト翻訳の修正のシリーズの後成熟した RAS 蛋白質の修正の C 末端は細胞膜の細胞質のリーフレットに挿入します。具体的には、細胞膜は RAS がその下流エフェクター RAF1 を行っています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路の構成的活性化を防ぐためには、複数レベルの RAS の制御は、場所にあります。GTP を GDP へ加水分解によって RAS を非アクティブなレンダリング以外にもアクティブな RA も解放できます膜から修正またはシグナル伝達を阻害する要因を可との相互作用の。膜協会を評価するための重要な必要性が残っているが、蛍光ライブ イメージングは、細胞生物学者蛍光タンパク質タグ周辺膜蛋白質1の細胞内の局在を観察する機会を与える、シンプル生化学的アプローチを半定量的内因性蛋白質。
タンパク質の膜と可溶性画分の間分配の適切な生化学的評価は 2 つの要因に大きく依存する: 細胞の均一化と膜と可溶性画分の効率的な分離。最も広く使用されている商業キットを含むいくつかのプロトコルは、洗剤を用いた均質化に依存して、これらのメソッドは、可溶性のフェーズ2に膜タンパク質を抽出して解析の難読化します。したがって、セル中断の非洗剤ベース、機械的メソッドは、クリーンな結果を提供します。血液や臓器から収穫栽培におけるセルの機械的破壊のいくつかの方法があります。Dounce 均質化、細針の中断、ボール ベアリングの均質化、超音波処理、窒素キャビテーションが含まれます。ここで我々 は窒素のキャビテーションを評価し、他の方法と比較します。窒素のキャビテーションは高圧下での細胞の細胞質に溶解している窒素の依存しています。平衡後、細胞懸濁液は気圧に公開では突然の沸騰の結果としてセルを開いて涙の細胞質窒素気泡が形成されます。圧力が十分に高い場合は、窒素沸騰核3を破壊できる、膜バインド リソソーム4のような細胞小器官。しかし、圧力が十分に低く保たれ、ない他の細胞器官、それにより細胞質とそのまま細胞内小器官の流出 cavitate5を指定されている磨砕液に、小胞体膜で減圧が中断されます。このため、窒素キャビテーションは、リソソーム、ミトコンドリアのような細胞小器官を分離する最適な方法です。
しかし、膜と可溶性画分に簡単に分離することがでく磨砕液を準備するための優れた方法であるも。キャビテーションの中に使用される圧力容器 (「爆弾」と呼ぶ) タンクと調節可能な放電バルブの出口ポートから窒素ガス配信の入口との高圧に耐える厚いステンレス鋼製ケーシングで構成されます。
窒素のキャビテーションは 1960 年代6以来セル均質化のために使用されています。1961 年に、ハンターと Commerfold7は哺乳類の組織破壊のための実行可能な選択肢として窒素キャビテーションを設立しました。以来、研究者は、各種の細胞や組織、成功とするための手法を適応している、窒素キャビテーション膜準備8,9, 核と細胞小器官を含む複数のアプリケーションで定番となっています。準備10、11、および不安定な生化学的抽出。細胞生物学者は現在、窒素の均質化の利点が広く宣伝されていない、窒素爆弾は高価であり、セルの比較的大きい数は誤解があるのでセルの均質化の他の方法を多く採用します。必須。そのまま核無細胞のホモジネートを達成するために窒素のキャビテーションのためのプロトコルは公開されていない、パブリッシュされた最も評価の 20 mL の細胞懸濁液の量が使用されました。小規模なサンプルの使用の現在の要件に合うようにこの古典的な手法を適応し、培養細胞に適した窒素キャビテーションの修正されたプロトコルを提案する.窒素キャビテーション後磨砕液と分かれています可溶性 (S) 膜 (P) の一部分差動遠心分離によって最初低速スピン核と切れ目のないセルを削除するとし、高速スピン (&#62; 100,000 × g) を分離するには可溶性画分から膜。Immunoblots を分離の効率を解析し、他の機械的破壊技術窒素キャビテーションを比較します。また窒素のキャビテーションの間に均質化バッファーの浸透効果を調べた。

<table><tbody><tr><td>Cell Disruption Vessel (45 mL)</td><td>Parr Instrument</td><td>4639</td><td>Nitrogen cavitation Bomb</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (2 mL)</td><td>Kontes</td><td>885300-0002</td><td>Dounce pestle and tube</td></tr><tr><td>U-100 Insulin Syringe 28G&amp;frac12;</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td>Needle</td></tr><tr><td>Atg12 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>271688</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>47778</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>&amp;beta;-tubulin antibody</td><td>DSHB</td><td>E7-s</td><td>Mouse antibody, use at 1:5000 dilution</td></tr><tr><td>Calnexin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>23954</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Calregulin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>373863</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Catalase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>271803</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>CIMPR antibody</td><td>Abcam</td><td>124767</td><td>Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>EEA1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>137130</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>EGFR antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>373746</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>F&lt;sub&gt;0&lt;/sub&gt;-ATPase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>514419</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>F&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;-ATPase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>55597</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Fibrillarin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>374022</td><td>Mouse antibody, use at 1:200 dilution</td></tr><tr><td>Golgin 97 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>59820</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>HDAC1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>81598</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Hexokinase 1 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2024S</td><td>Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Lamin A/C antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>376248</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>LAMP1 antibody</td><td>DSHB</td><td>H4A3-c</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;/K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; ATPase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>48345</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Rab7 antibody</td><td>Abcam</td><td>137029</td><td>Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Rab9 antibody</td><td>Thermo</td><td>MA3-067</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>RCAS1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>398052</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>RhoGDI antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>360</td><td>Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution</td></tr><tr><td>Ribosomal protein S6 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>74459</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Sec61a antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>12322</td><td>Goat antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Sample tube for ultracentrifugation</td></tr><tr><td>TLK-100.3 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td>rotor for ultracentrifugation</td></tr><tr><td>Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td>ultracentrifuge</td></tr><tr><td>cOmplete protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>protease inhibitors</td></tr><tr><td>Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade</td><td>Corning</td><td>353089</td><td>large cell scraper</td></tr><tr><td>Magnetic Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57SIX</td><td>micro stir bar</td></tr><tr><td>Ceramic-Top Magnetic Stirrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S504501AS</td><td>magnetic stirrer</td></tr></tbody></table>

nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells

培養細胞、末梢膜タンパク質を含む蛋白質の細胞内分布の勉強に役立ちます。蛍光遺伝子エンコード タグ付きタンパク質は細胞内蛋白質の分布の研究をもたらしました。ただし、部分的にゾル性細胞質蛋白質場合は特に、蛍光顕微鏡を用いた分布を定量化することは困難です。さらに、内因性のタンパク質を研究することが重要ですよく。生化学的アッセイ immunoblots まま細胞レベル下の分別後のタンパク質分布の定量化のためのゴールド スタンダードのよう。ゾル性細胞質または特定の膜画分を分離することを目指す商業キットはありますが、これらのキットのほとんどは洗剤、膜から抽出された簡単に周辺膜蛋白質を勉強のために不適当かもしれないと抽出に基づいています。ここで超遠心法による窒素キャビテーション ・ ゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離による携帯電話用洗剤無料プロトコルを提案します。我々 は、種類の異なる細胞で水溶性の細胞小器官の分離とペレットの分数を確認し、一般的な洗剤ベース力学的均質化手法の中での蛋白質の抽出を比較します。いくつかの利点の窒素のキャビテーション繊細な細胞小器官を最小限の物理的および化学的損傷細胞破壊の優れた効率であります。超遠心法と組み合わせると、窒素のキャビテーションは周辺膜蛋白質の細胞質間のシフトを調べる優れた方法と膜の一部分。

図 2は、可溶性細胞質画分 (S) または膜ペレット画分 (P) に PNS から細胞蛋白質の分割を示します。異なる種類の細胞から 3 つの代表的な細胞を調べた: HEK 293 (細胞上皮)、NIH 3T3 (繊維芽細胞) および Jurkat (リンパ球)。Rho グアニン解離阻害剤 (RhoGDI) と陽イオン依存性マンノース-6-リン酸受容体 (CIMPR) のポジティブ コントロールとして使用されたゾ?...

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Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

超遠心法による窒素のキャビテーションとゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離に基づく哺乳類細胞の洗剤無料均質化のためのプロトコルをご紹介します。この方法は可溶性の周辺膜蛋白質の分割監視に最適と膜の一部分。

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.0K ビュー.  New York University. 超遠心法による窒素のキャビテーションとゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離に基づく哺乳類細胞の洗剤無料均質化のためのプロトコルをご紹介します。この方法は可溶性の周辺膜蛋白質の分割監視に最適と膜の一部分。

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Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

生化学

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

生物工学

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質品質の迅速評価(英語)

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

神経科学

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral budding, among other vital cellular processes. For efficient biological activity, cell membranes should be rigid enough to maintain the integrity of the cell and its compartments yet fluid enough to allow membrane components, such as proteins and functional domains, to diffuse and interact. This delicate balance of elastic and fluid membrane properties, and their impact on biological function, necessitate a better understanding of collective membrane dynamics over mesoscopic length and time scales of key biological processes, e.g., membrane deformations and protein binding events. Among the techniques that can effectively probe this dynamic range is neutron spin echo (NSE) spectroscopy. Combined with deuterium labeling, NSE can be used to directly access bending and thickness fluctuations as well as mesoscopic dynamics of select membrane features. This paper provides a brief description of the NSE technique and outlines the procedures for performing NSE experiments on liposomal membranes, including details of sample preparation and deuteration schemes, along with instructions for data collection and reduction. The paper also introduces data analysis methods used to extract key membrane parameters, such as the bending rigidity modulus, area compressibility modulus, and in-plane viscosity. To illustrate the biological importance of NSE studies, select examples of membrane phenomena probed by NSE are discussed, namely, the effect of additives on membrane bending rigidity, the impact of domain formation on membrane fluctuations, and the dynamic signature of membrane-protein interactions.

This paper describes the protocols for sample preparation, data reduction, and data analysis in neutron spin echo (NSE) studies of lipid membranes. Judicious deuterium labeling of lipids enables access to different membrane dynamics on mesoscopic length and time scales, over which vital biological processes occur.

脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

生物学

微生物叢マルチオミクスのための細菌細胞外小胞の単離の強化

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

著者スポットライト:細菌の細胞外小胞の分離と不均一性に関する研究の加速 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

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高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム

蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質品質の迅速評価(英語)

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法

密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語)

密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語)

密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語)