この研究は、国立がん研究所（NCI）助成金U54CA143798とU54CA143907の資金提供を受けて、ダナファーバー癌研究所と南カリフォルニア大学で物理科学 - 腫瘍センター（PS-OC）を確立しました。 SM Mumenthalerはこの作業の一部をサポートするPS-OCトランスネットワーク賞を受賞しました。 私たちは、Operetta HCSプラットフォームの寄付について、私たちの慈善団体、特にStephenson家、Emmet、Toni、Tessaに深く感謝したいと思います。 J. Foo博士、Applied Molecular Medicineのチームメンバーでもあります。D.臨床的指導と指導のためのAgus、実験デザインとの有意義な議論のためのK. Patsch、R. Rawatによる画像解析プロトコールの支援、Operettaの技術援助のためのJ. Katz、そして有用な議論とフィードバックのためのP. MacklinとD. Ruderman。

1.細胞培養注：ここでは肺線維芽細胞（CCD-19Lu GFP）と共培養したときのEGFRターゲッティング剤であるエルロチニブに対するNSCLC細胞（H3255）の表現型応答を調べた。同じデータセットについて、2つの細胞集団（H3255およびCCD-19Lu GFP）の蛍光ベースおよび形態ベースの分類を、それらの一致度を例示するために行った。しかしながら、1つの分類方法のみが使用される必要があり、その用途に基づいて選択されるべきである。 <ol><li> 10％熱不活性化FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した500mLのRPMI-1640を調製する。 注：増殖培地およびサプリメントは、他の細胞タイプの必要に応じて交換することができます。 </li><li> 37℃で5％CO 2中の純粋な集団として10cm 3プレート中の細胞を培養し、3〜4日ごとに適切な割合で通過させる。 </li></ol>細胞の調製<ol><li>細胞懸濁液を調製するために、c5mLの1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄する。 </li><li> PBSから吸引し、37℃で加温した0.05％トリプシン1 mLを添加し、37℃で5分間（または細胞がもはやプレートに付着しなくなるまでインキュベートする）インキュベートする。 </li><li>トリプシンを中和するために、4mLのRPMIをH3255およびCCD-19Lu GFPプレートに加え、細胞溶液を15mLコニカルチューブにピペットで分注する。 </li><li>室温で5分間150xgで細胞を遠心分離する。 </li><li>上清を吸引し、円錐管のRPMI培地10mLに細胞ペレットを再懸濁して、播種の準備をします。 </li></ol> 3.セルメッキ<ol><li> シードを標準化するために細胞を数える。 <ol><li>チューブを反転させて細胞を溶液中に混合する。各細胞懸濁液10μLをマイクロ遠心管にピペットで入れ、10μLのトリパンブルーを加える。 </li><li>この溶液10μLを細胞計数スライドにピペットで入れ、自動細胞計数器に挿入する。 注：細胞計数の他の方法（ すなわち、。血球計算盤）を使用することができる。 </li><li>細胞カウントを少なくとも3回、または得られたカウントが一致するまで繰り返す。 </li></ol></li><li> マルチウェルプレート上にシード細胞を接種する 注：シードするプレートの数は、画像化される時点の数に依存します。あるいは、細胞がヒストン-2B-GFP（または適切な核セグメント化を提供する他の安定なレンチウイルス核染色）で形質導入される場合、1つのプレートを経時的に再撮像することができる。 <ol><li> 100μLのRPMI中に合計で1,500細胞/ウェルで播種する。 H3255、CCD-19Lu GFP、および50％H3255 + 50％CCD-19Lu GFPの3つの細胞集団をプレートするための3つの細胞懸濁液を調製する。それぞれの時点で同一のプレート設定で3通りずつ実行します。 注：初期播種密度は、細胞株およびプレートサイズごとに最適化する必要があります。 </li><li>マルチチャネルピペットを用いて3×96ウェルプレートに細胞を播種する。細胞を37℃、5％CO 2でインキュベートする。 </li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> 4.薬物投与<ol><li>エルロチニブ粉末にDMSOを添加して、10mM濃度の最終的なエルロチニブ原液を作製する。 注：薬物は必要に応じて置換することができます。 </li><li>細胞培養培地で薬物を希釈して最終濃度10μMの最終濃度で最終濃度を2倍にし、1:10の比で4回連続して希釈して合計5種類の薬物濃度と無薬物対照とする。 注：最高薬物用量でDMSOの濃度が0.1％v / vに等しいかそれを超える場合、観察された観察された効果がDMSOの毒性によるものでないことを確実にするために、無薬物対照は同等量のDMSOを含むべきである。 </li><li>適切なウェルに薬物溶液100μLをピペットし、最終薬物濃度を培地で1倍に希釈する。 </li></ol> 5.画像取得注：0日目、2日目および3日目に画像を取得した。研究されている細胞型および細胞プロセスに応じて、所望の時点を研究することができる。 <ol><li> イメージングの準備のために細胞を染色する。 <ol><li>以下の最終濃度で色素溶液を調製する。 <ol><li>蛍光ベースの分類のために、5μg/ mLの核染色およびPBS中の5μMの死細胞染色を調製する（ 表の表を参照）。 </li><li>形態学的分類のために、5μg/ mLの核染色剤、5μMの死細胞染色液、およびPBS中の5μM細胞染色液を調製する（ 表の表を参照）。 </li></ol></li><li>各ウェルに20μLの色素溶液を添加する。光から保護された37℃で30分間インキュベートする。 </li></ol></li><li> 画像の最適化と取得。 <ol><li>インキュベーターからウェルプレートを取り出し、プレートの底を70％EtOHで拭き取り、プレートをイメージングチャンバーに置きます。 </li><li> [設定]タブで、[チャンネル選択]の下の[+]ボタンをクリックして、適切なチャンネルを追加します。画像（ すなわち、明視野、核染色、死細胞染色、GFPおよびRFPシグナル）。 </li><li> 「レイアウト選択」をクリックし、焦点面を特定するために、0μmで始まり2μmで始まるzμmのテスト画像を2μmごとに撮影します。 &#39;Height&#39;の下の各チャンネルのこの距離を入力します。 </li><li>各チャネルの下にある「スナップショット」をクリックして強度を評価し、露光時間を最適化します。必要に応じて、「時間」の下にある値を上または下に入力します。 </li><li>画面の右側で、プレートの回路図の適切なウェル（画像化される）を強調表示します。下の井戸の概略図では、イメージングされる25のフィールドを同様の方法で強調表示します。 </li><li> &#39;Run Experiment&#39;の下で、左のタブの &#39;Plate Name&#39;でプレートを識別し、 &#39;Start&#39;ボタン（下）をクリックして10X対物レンズで画像取得プロトコルを実行し、前述のチャンネルでグレースケールTIFF画像を生成します。 注：ステップバイステップのinstイメージングプロトコルの破損は計測器によって異なる場合がありますが、パラメータ値は依然として最適化されていなければなりません。 </li><li> 2、3日目にイメージングを繰り返します。 </li></ol></li></ol> 6.画像解析注：すべての画像解析は、独自のソフトウェアを使用して実行されました。しかし、これは一般に公開されていないため、CellProfiler 2.2およびCellProfiler Analyst 2.0で以下の簡単なプロトコルと詳細なプロトコルを補足資料として提供しています（テストイメージはすでにワークフローをテストするためにパイプラインに読み込まれています）。この実験からの画像を、各ウェルを個別にロードすることができるようにウェルごとにまとめた。以下のCellProfilerパイプラインには、各イメージファイル名のメタデータ情報を解析し、チャネル別にイメージをグループ化できる正規表現が含まれています。 <ol><li>オープンソースソフトウェアをダウンロードしてインストールする： &#39;CellProfiler9;および &#39;CellProfiler Analyst&#39;インストール時にすべてのデフォルトオプションとアドオンを受け入れます。 </li><li> 異種細胞培養物を亜集団に分類する。 <ol><li> &#39;CellProfiler&#39;ソフトウェアを開き、 &#39;ファイル&#39;をクリックします。 &#39;パイプラインのインポート&#39; | &#39;From File&#39;を選択し、適切なファイル（蛍光ベースの分類の場合は 「Fluorescence_Classification.cppipe」、形態ベースの分類の場合は「Morphology_Classification.cppipe」）を選択します。 注：これらのファイルには、基本的な画像処理と核/セルセグメンテーションのためのプロトコルが含まれています。これらの細胞全体に存在する不均一なHoechst染色のために、核を分割して拡大し、次いで画像をマスクしてより低い強度の核のセグメント化を可能にした。 <ol><li>蛍光ベースの分類パイプラインを選択して、細胞をeGFP強度に基づいてH3255またはCCD-19Luとして分類し、形態学的特徴を計算する。 注：CCD-19Lu細胞にGFPを形質導入した。 </li><li>モルフォロジーに基づく分類パイプラインを選択して、核および細胞をセグメント化し、形態学的特徴を計算する。 注：分類のために &#39;CellProfiler Analyst&#39;のさらに下流の分析が必要です。死細胞は、蛍光に基づく分類によって分類される。 </li></ol></li><li>画面の左下にある[出力設定の表示]をクリックします。分析用のイメージファイルの場所（ &#39;Default Input Folder&#39;）と抽出されたデータの保存先（ &#39;Default Output Folder&#39;）を選択します。 </li><li> &#39;Analyze Images&#39;をクリックして分析を開始します。分析が完了したら、[OK]をクリックして、[Default Output Folder]に移動して、計算されたデータを表示します。 注記：パラメータ値の例と画像は補足ファイル1-CellProfilerProtocol.pdfで利用できます。 </li><li>形態ベースの分類（のみ）については、以下のことを行う。 <ol><li> 「CellProfiler Analyst」ソフトウェアを開き、CellProfilerで生成されたデータベースプロパティファイルを選択し、「開く」をクリックします。 </li><li>画面の左上にある[クラシファイア]タブをクリックします。実験からランダムなセル画像を呼び出すには、[フェッチ]をクリックします。画像が未分類のウィンドウに表示されます。 </li></ol></li><li>適切なビンに細胞を選択してドラッグすることにより、細胞を陽性（H3255）または陰性（CCD-19Lu）として手動で分類する（ 補足ファイル2-Pipeline.pdf ： 図B参照）。サブ集団ごとに少なくとも50個の細胞を分類した後、「Train Classifier」をクリックして、「Progressを確認」をクリックします。 注：セルは、ユーザが管理するランダムフォレストマシンラーニングアルゴリズム12によって分類されます。精度が承認されたしきい値（&gt; 90％）を上回らない場合は、「CellProfiler」のセルセグメンテーションを元に戻すか、セルを最適化する必要があります形態学的に怒っている。 </li><li>各小集団の細胞数を含む表を生成するには、[スコアすべて]をクリックします。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

細胞ベースのアッセイは、基礎研究および医薬品開発のセッティングにおいて重要な役割を果たしてきました。しかし、これらの標準的なアッセイの限界は、インビトロおよび臨床データ間の不一致およびFDAの承認を受けるためのほとんどの薬物の不具合によってますます明らかになってきている。ここでは、関連する共存する環境刺激に応答して異種細胞表現型を同時に分析するために、定量的イメージングを利用するための新規な方法を提示する。 細胞生存率を測定するために使用される従来の細胞ベースのアッセイには、トリパンブルー排除アッセイ、MTT / MTS、およびアネキシンV-FITCフローサイトメトリー染色が含まれる。トリパンブルー排除アッセイは、単純かつ安価でありながら多数の細胞を必要とし、時間がかかり、しばしばユーザバイアス1の影響を受ける。 MTTおよびMTSアッセイは、ミトコンドリアの代謝速度の測定を介して間接的に細胞生存率を測定する。しかしながら、代謝活性物質（培地や酸素濃度など）の影響を受ける可能性があり、不正確な結果を招き、細胞の種類や状態を問わず標準化を妨げる2,3 。これらの技術のもう一つの大きな欠点は、複数の細胞タイプを区別できないことです。ほとんどの生物システムは異種細胞です。フローサイトメトリー法は複数の細胞集団を区別する能力を有するが、細胞標識が必要であり、動的サンプリングが困難であり、付着細胞を用いる場合、この適用は時間がかかり、誤りを起こしやすい。 形態学的変化を含む他の重要な細胞表現型は、環境刺激に応答して生じるが、伝統的な細胞ベースのアッセイによっては捕捉されない。形態学的特徴付けおよびサンプル間の類似性マッピングによって細胞状態をプロファイリングすることは、a基本的な細胞生物学や創薬を含む、基礎と翻訳の研究の多くの側面に新しい洞察を提供する可能性4 。さらに、腫瘍細胞の形態学は、腫瘍亜型5および攻撃性6と相関することが示されている。したがって、これらの細胞の特徴およびそれらがどのような特定の環境摂動に関連するかを研究することは、大きな関心事である。さらに、形態学的特徴の相違を用いて、共培養系における亜集団を識別することができる。蛍光標識細胞は、欠点（ すなわち 、固有の細胞特性の変更、時間のかかる）を有し、したがって、細胞型を分類するためのさらなる方法が有利である。 顕微鏡検査に基づくイメージングは​​、細胞表現型を多重化し、定量的かつ堅牢な方法でプロファイリングするための代替方法である。この原稿では、定量的なイメージングパイプラインを適用して、エボリューション腫瘍内の異種細胞集団のダイナミクス。私たちは、非小細胞肺癌（NSCLC）細胞と癌関連線維芽細胞（CAF）との相互作用に焦点を当てています。 CAFは、腫瘍の開始、進行および治療応答に関与している。したがって、CAFの非存在下で腫瘍細胞に対して表現型アッセイを行うことは、誤解を招く可能性がある7,8,9。特に、本発明者らは、NSCLCの臨床処置においてしばしば使用される上皮増殖因子受容体（EGFR）を標的とする小分子であるエルロチニブに応答する腫瘍細胞に対するCAFの効果を評価した。我々は、評価のためにハイコンテンツスクリーニングプラットフォームおよびそれに付随する画像分析ソフトウェアを利用した。しかし、この方法論を他の研究者が利用できるようにするために、私たちはオープンソースソフトウェアを使って同等の下流プロトコルを開発しました。CellProfiler 10およびCellProfiler Analyst 11ほとんどの画像ベースの高含量スクリーニングアッセイは、所定の機器モデルに特有の商品化されたソフトウェアで分析される。基礎となるアルゴリズムはしばしば専有であるため、異なるソフトウェアを使用する他のラボでは結果を複製することは困難です。この画像ベースのパイプラインを用いて、蛍光および形態学的分類の両方を用いた薬物治療に応答した異種細胞培養の各亜集団の細胞増殖、死および形態を測定した。以下のプロトコルは、複雑な細胞プロセスをプロービングするための堅牢な方法を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

細胞プロセスは複雑であり、複数の細胞タイプとそれらの環境との間の相互作用から生じる。既存の細胞生物学技術は、しばしばこの相互作用の正確な解釈を可能にしない。定量的イメージングベースのアプローチを用いて、我々は、異種細胞集団の動的表現型応答（ すなわち、形態変化、増殖、アポトーシス）を環境刺激の変化に特徴付けるための高含量プロトコルを提示する。用途に応じて、蛍光強度または固有の形態学的特徴に基づいて細胞タイプを区別する能力を強調する。このプラットフォームは、伝統的な細胞生物学的アッセイより短い時間、より少ない量の試薬およびエラーの可能性を利用しながら、摂動に対する亜集団応答のより包括的な特性決定を可能にする。しかし、場合によっては、細胞集団は複雑な細胞に基づいて同定および定量するのが困難な場合があります追加機能のトラブルシューティングが必要になります。私たちはこれらの状況のいくつかを議定書で強調します。我々は、癌モデルにおける薬物に対する応答を用いて、この適用を実証する。しかし、それは他の生理学的プロセスに対してより広範に容易に適用することができる。このプロトコルは、共培養系内の亜集団を同定し、それぞれの外部刺激に対する特定の応答を特徴付けることを可能にする。

我々は、合計4,050個の個別画像のために、3枚のプレートにわたり25個のウェル/ウェル、54個のウェル/プレート（3個の細胞集団×6個の薬物濃度×3個の複製物）からなる画像セットを生成した。実験の過程で生成された画像セットは、独自のソフトウェア（材料の表参照）を用いて細胞の様々な定量的性質（ すなわち形態、蛍光）を抽出し、細胞亜集団を分類するために使用することができた。しかし、使用される商用ソフトウェアにはアクセスが制限されているため、CellProfilerとCellProfiler Analystの同等の下流パイプラインが作成されました。 サブ集団への異種細胞分類核はDNA染色（ここではHoechst）に基づいて同定され、セグメント化され、細胞集団は、蛍光またはモレキュラーに基づいて分類された（ 図1 ）。蛍光に基づく分類のために、線維芽細胞（CCD-19Lu）は、予めGFP-レンチウイルスで形質導入された。 GFP強度レベルを各核について測定し、許容された閾値（バックグラウンドシグナルに基づく）を超えて計算したものをCCD-19Luと分類し、以下のものを腫瘍細胞（H3255）として同定した。形態学的分類のために、細胞を以前に非毒性細胞染色（材料の表参照）で染色し、これを用いて細胞質を同定し、セグメント化した。機械学習アルゴリズムを、各集団から約50〜100個の細胞で訓練した。集団間で有意に異なる形態学的特徴が同定され、次いでそれを用いて、CCD-19Lu細胞とH3255細胞とを区別する線状分類器を設計した。蛍光および形態分類プロトコールは、2つの細胞集団を区別する際に97.4％（n = 1403）の一致性であった（1μMエルロチニブ）で92.5％（n = 916）の一致がみられた（ 図2 ）。 サブポピュレーションの表現型解析細胞型を区別することに加えて、我々は各亜集団の表現型特性を特徴付けることを目指した。マルチプレックスアッセイは、時間と試薬を節約し、一貫性を高め、研究されているシステムに関する追加情報を提供します。多くの潜在的な表現型産物が存在し、関心のある質問に基づいてそれらを選択すべきである。ここでは、エルロチニブ治療に応答した細胞形態および生存能力状態の変化を調べた。 3日間の薬物処理後、H3255細胞の核領域の減少および細胞面積の増加が観察された（ 図3A ）。核の平均面積の差「無薬物」および「薬物」処置集団は、2型2型（等分散） t検定 （ p = 7.92×10 -16 ）を介して統計的に有意であることが判明した。我々は、この観察は薬物治療によって課せられたストレスに対する細胞応答であると仮説を立てる。 これは、臨床的に重大な影響を及ぼすため、薬物が細胞毒性（ すなわち 、時間の経過とともに死細胞の数が増加する）または細胞分裂抑制（ すなわち 、時間の経過とともに細胞の出生の数が減少する）効果を有するかどうかを調べることもまた興味深い。例えば、細胞増殖抑制薬物効果は成長停止を誘導するが、腫瘍から細胞を排除しないので、薬物が除去されると癌細胞が細胞増殖を再開する可能性がある。薬物効果はしばしば文脈、濃度、および細胞型に依存し得る。我々は以前にエルロチニブが1つの細胞型で細胞傷害性応答を誘発するのを観察したが、ac別の13の反応である。 伝統的な生存能力アッセイは、相対細胞数を出力し、したがって、成長停止と細胞死とを区別しない。ここでは、ヨウ化プロピジウム染色に基づいて死細胞を同定した（ 図3B ）。 H3255細胞に対するエルロチニブの細胞毒性および細胞増殖抑制効果の両方が観察され、薬剤処置後の死亡数および出生数の減少が見られた（ 図3C ）。死亡細胞の数は、細胞クリアランスのため1日後に低下することは注目に値する。 CCD-19Lu細胞は薬物の影響を受けなかった。このプラットフォームのもう一つの利点は、量的データの生成です。例えば、我々の共培養実験では、エルロチンを含まないか、またはエルロチンを含まない3日後に、1,118（75.8％）のH3255細胞の初期亜集団が2,817（87.9％）または396（57.2％）であることが見出された（ 図4 ）。相対的な割合ではなく実際の細胞数を生み出すことができるので（フローサイトメトリー法のように）、薬物処理中の組成の変化はH3255細胞の減少によるものであり、CCD-19Luの増加によるものではないと結論する。細胞のクリアランスのために死亡率が過小評価される可能性は何もありません。これは実験的に評価するのが難しく、細胞タイプによって異なる可能性があります。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> 図1：画像解析プロトコルの概要形態学ベースの分類または蛍光ベースの分類のいずれかを使用して異種細胞集団を分類する2つの潜在的な下流画像分析パイプライン。スケールバー=100μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>この図のより大きなバージョンを表示します。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> 図2：形態学と蛍光に基づく分類との間の一致。 （ A ）2つの分類プロトコルの重複を示すコンコード図。同じ細胞を形態学的および蛍光に基づく分類の両方を用いてH3255として分類した。 2つのプロトコールは、97.4％（n = 1403）の未処理細胞および92.5％（n = 916）のエルロチニブで処理された細胞の分類（注：白色領域は視覚化するには小さすぎる）で一致した。 （ B ）蛍光ベースの分類と形態ベースの分類との間の良好な一致および劣悪な一致の例を示す10X画像。白い矢印は、プラットフォーム間で一貫して分類されていない細胞を指し示します。入力画像：青 - 核（Hoechst）;緑 - CCD19Lu（GFP）。 Classiイメージ画像：赤 - H3255;緑 - CCD-19Lu。スケールバー=100μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> 図3：単一の実験的セットアップからの多重表現型測定。 （ A ）薬物の存在下および非存在下での単一細胞レベルで、核および細胞面積などの形態学的特徴を計算した。注：100μm2未満のセル面積は残骸とみなされ、分析から除外されています。ボックスプロットは、第1および第3四分位範囲および95％信頼区間エラーバーを有する中央値を示す。 （ B ）H3255（青色）とCCD-19Lu（緑色）細胞を共培養し、プロティドの強度に基づいて死細胞を同定したヨウ化銀染色（赤色）し、10倍の対物レンズを用いて画像化する。スケールバー= 1mm（上部パネル）。 100μm（下の画像）。 （ C ）生きた細胞および死んだ細胞の総数は、薬物処理の有無にかかわらず、エルロチニブの添加により生存細胞の数が明らかに減少し、死細胞が増加して3日間にわたって計算された。エラーバーは、3回の反復に基づく平均の標準誤差を表す。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> 図4：時間の経過に伴う亜集団ダイナミクス 0日または3日目にH3255（青色）およびCCD-19Lu（緑色）を含むウェルの代表的な10X画像。各亜集団に属する細胞を数え、比例円グラフはaサンプル間の集団組成の実際の変化。スケールバー= 1mm（中央のパネル、面取りされたパネル、最上部のパネル）、1mm（上の画像）、100μm（下の画像）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

我々は、摂動に応答して異種細胞集団動態を研究するための新規プロトコールを開発した。この原稿では、異種細胞集団の複数の細胞表現型を堅牢な方法で同時に特性決定するための定量的データセットを作成する画像ベースのプラットフォームについて説明します。

定量的イメージング技術を用いたヘテロ細胞集団の識別と特徴付け

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.4K ビュー.  University of Southern California (USC). 我々は、摂動に応答して異種細胞集団動態を研究するための新規プロトコールを開発した。この原稿では、異種細胞集団の複数の細胞表現型を堅牢な方法で同時に特性決定するための定量的データセットを作成する画像ベースのプラットフォームについて説明します。 

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

発生生物学

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

定量的免疫蛍光法を用いて腫瘍におけるタンパク質発現の不均一性のマッピング

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

医学

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

遺伝学

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

生物工学

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

マイクロパターンと定量イメージングを用いた哺乳類細胞の新しい空間組織のマッピング

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either fluorescence detection approaches, such as immunofluorescent staining or transfection with fluorescent proteins or edge detection techniques, which are often error-prone due to noise and other non-idealities in the image background. 
We designed a new algorithm that could accurately count and distinguish macrophages and fibroblasts, cells of different phenotypes that often colocalize during tissue regeneration. MATLAB was used to implement the algorithm, which differentiated distinct cell types based on differences in height from the background. A primary algorithm was developed using an area-based method to account for variations in cell size/structure and high-density seeding conditions. 
Non-idealities in cell structures were accounted for with a secondary, iterative algorithm utilizing internal parameters such as cell coverage computed using experimental data for a given cell type. Finally, an analysis of coculture environments was carried out using an isolation algorithm in which various cell types were selectively excluded based on the evaluation of relative height differences within the image. This approach was found to accurately count cells within a 5% error margin for monocultured cells and within a 10% error margin for cocultured cells.

We present a method, which utilizes a generalizable area-based image analysis approach to identify cell counts. Analysis of different cell populations exploited the significant cell height and structure differences between distinct cell types within an adaptive algorithm.

マクロファージ-線維芽細胞共培養の定量化のための領域ベースの画像解析アルゴリズム

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

生物学

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.