Name: expansion and adipogenesis induction of adipocyte progenitors from perivascular adipose tissue isolated by magnetic activated cell sorting
Uploaded: 2017-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
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Contreras and Watts Laboratoriesとウィリアム・ラファエル博士。これらの実験は、NHLBI F31 HL128035-01（組織消化プロトコル標準化）、NHLBI 5R01HL117847-02および2P01HL070687-11A1（動物）およびNHLBI 5R01HL117847-02（細胞単離および培養）によって支持された。

本書に記載されているすべての手順は、ミシガン州立大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）によって制定されたガイドラインに従います。すべてのバッファーとメディアを光から保護する必要があります。 緩衝液、培地および器具の調製<ol><li> （KRBB）：135mM塩化ナトリウム、5mM塩化カリウム、1mM硫酸マグネシウム、0.4mMリン酸二水素カリウム、5.5mMグルコース、1％抗生物質/抗真菌剤（10,000単位/ mLペニシリン、10,000μg / mLのストレプトマイシン、25μg/ mLのアンホテリシンB）、および10mMのHEPES（pH = 7.4）。この溶液は、4℃で滅菌した場合、3週間安定です。 </li><li>コラゲナーゼタイプ1溶液を調製する：4％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むKRBB中に1mg / mL。この溶液は37℃で保存し、4時間安定です。 </li><li>赤血球溶解緩衝溶液の調製：154mM塩化アンモニウム、10mM重炭酸カリウム、および0.1mMのEDTAを含む。 4℃で1ヶ月間保管してください。 </li><li> DMEM / F12培地、10％ウシ胎仔血清（FBS）、5％正常ロバ血清、40μL/ mL F（ab）断片ロバ抗ラットIgGを調製する。 4℃で1ヶ月間保管してください。 </li><li> MCS緩衝溶液：リン酸緩衝食塩水（PBS、pH = 7.5）、0.5％BSA、および2mM EDTAを調製する。 4℃で1ヶ月間保管してください。ガラス容器内で37℃に加熱し、次いで15秒間真空を適用することによって、脱ガス溶液。使用しないでください。 </li><li> （DMEM）：F12,15％ウシ胎児血清（FCS）、1％抗生物質/抗真菌剤（10,000単位/ mLペニシリン、10,000μg/ mLストレプトマイシン、25μgのストレプトマイシン、 / mLアンホテリシンB）、44.05mM重炭酸ナトリウム、100μMアスコルビン酸、33μMビオチン、17μMパントテン酸塩、2mM L-グルタミン、および20mM HEPES。無菌状態で4℃で2週間まで保存してください。 </li><li> APC＆白血病抑制因子（10 ng / mL）、血小板由来増殖因子BB（10 ng / mL）、および塩基性線維芽細胞増殖因子を含む基礎増殖培地（＃160;培地： 5ng / mL）。無菌状態で4℃で2週間まで保存してください。 </li><li> APC誘導培地：10％FBS、2.5μg/ mLインスリン、0.5mM 2-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）、1μMデキサメタゾン、および200μMT3（トリヨードチロニン甲状腺ホルモン）を含むAPC培地を調製する。無菌状態で4℃で2週間まで保存してください。 </li></ol> 2.脂肪細胞前駆細胞の単離<ol><li>施設ガイドラインに従ってラットを麻酔する。ラットを背臥位に置く。つま先のつまみで麻酔の深さを確認し、この痛みを伴う刺激に対する反射応答の喪失を確認します。 注：このプロトコールは、10週齢のSprague Dawleyラットおよび70mg / kgのペントバルビタールを腹腔内注射によって送達する。 </li><li> 垂直正中線切開を作る胸骨領域の胸骨に沿って、および会陰領域にi番目のはさみ。腹腔に入り、上腸間膜動脈、小腸腸間膜抵抗性血管（mPVAT）および胸部大動脈（aPVAT）を暴露する。 <ol><li>腸間膜および大動脈への接続をすべて切断し、動物から血管を取り除く。解剖顕微鏡とKRBBで満たされたペトリ皿を用いてPVATを分離し、血管を観察し、PVATを単離する。 </li><li>この実験では、非PVAT脂肪蓄積を表す生殖腺（GON）脂肪を収集する。 10mMのHEPES（pH = 7.4）を含むKRBBの氷上に単離された脂肪パッドを置く。 </li><li>バイオセーフティフードでは、約50mgの組織を、1mLのコラゲナーゼI型溶液を含む1.7mLチューブに移し、組織はさみ（1〜3mm片）で切ります。 </li></ol></li><li> Rotisserieインキュベーター（またはオービタルシェーカーを備えたインキュベーター）で37℃で1時間インキュベートしてサンプルを消化する。バイオセーフティフードでは、消化した物質を100および40<html> 50mLのチューブに移した。得られたろ液を4℃で10分間、300×gで遠心分離する。 注記：ここからのプロトコールの全てのステップは、細胞を無菌状態に保つためにバイオセーフティフード内で実施するものとする。 </li><li>上清を除去し、SVF細胞を含むペレットを1×赤血球溶解緩衝溶液1mLに再懸濁し、1.7mLの微量遠心管に移す。光から保護されたRTで5分間細胞をインキュベートし、4℃で300xgで5分間遠心分離する。 </li><li> SVF Basal Mediaに上清を残し、残りの細胞ペレットを再懸濁する。トリパンブルー溶液を用いて生細胞を計数するために20μLのサブサンプルを収集する。 注：隔離可能なSVF細胞の数は、サイトによって異なります。組織1mg当たりに採取されたSVFの平均数は、aPVAT = 5.0±2.0×10 3 、mPVAT = 1.04±0.62×10 4 、GON = 2.4±1.2× 10 5である 。 </li></ol> 3.磁気活性セルソーティング_content &quot;&gt;注：4℃ですべてのステップを実行することにより、CD34およびPDGFRα細胞表面マーカーに基づいてSVFからAPCを単離します。 <ol><li>細胞を300 x gで5分間スピンします。上清を捨て、細胞ペレットを1×10 6細胞/ mLでMCSブロッキング緩衝液に再懸濁し、20分間インキュベートする。 注：1×10 6〜2×10 8細胞/ mLの細胞懸濁液を効果的に分離することができます。 </li><li> 細胞を5μLのFITC結合マウス抗CD34（1μg/ 1×10 6細胞）と共に4℃で30分間インキュベートする。 300 xgおよび4℃で5分間細胞をスピンします。 <ol><li> 4μLの抗FITCマイクロビーズと96μLのMCSバッファー（全量100μL）と4℃で5分間、暗所でインキュベートし、CD34 +およびCD34 -細胞を分離する。 </li></ol></li><li>磁気分離器をスタンドに取り付け、列翼を前面に向けてMultiSort（MS）Columnをセパレータに置きます。 5 mL上部チューブホルダー内のMSカラムの下に置いてください。 </li><li> MCS Buffer SolutionでリンスしてMSカラムを調製します。カラムの上に500μLのMCS Bufferをアプライし、バッファを通過させます。流出液を廃棄し、回収チューブを交換する。 </li><li>抗体標識された細胞懸濁液を調製したMSカラムにロードする。未標識細胞を含むフロースルーを収集する。 </li><li>脱気したMCS緩衝液3×500μLでMSカラムを洗浄する。前のステップからの流れを通過して結合する非標識細胞を収集する。 </li><li>磁気分離器からMSカラムを取り外し、新しいコレクションチューブ上に置きます。 1mLのMCS緩衝液をMSカラムに注ぎます。直ちに磁気標識した細胞でフラクションをただちに洗い流しますが、カラムに供給されたプランジャーをゆっくりと加えて、余分なガスがカラムに入らないようにしてください。 注：単離された細胞数はサイトによって異なります。 SVF集団から単離されたCD34 + APCの平均数組織のmgは、aPVAT = 2.6±0.43x10 2 、mPVAT = 9.6±1.4x10 2 、GON = 1.3±0.22x10 3である 。 </li><li> 細胞を300×gおよび4℃で5分間スピンさせる。 1：200溶液/ 1×10 6細胞ウサギ抗PDGFRα10μL中に集めたCD34 +画分を4℃で30分間インキュベートする。 <ol><li> 300 xgおよび4℃で5分間細胞を再度遠心する。標識された細胞を抗ウサギIgGマイクロビーズ4μLおよびMCS緩衝液96μLとインキュベートし、3.3から3.7のステップを繰り返して単離する。 注：単離された細胞数はサイトによって異なります。組織1mgあたりのCD34 +集団から単離されたPDGFRα + APCの平均数は、aPVAT = 2.4±0.64、mPVAT = 8.4±2.4、GON = 10.4±1.9であり、これは以前に単離された集団の0.5~10％である。 </li></ol></li></ol> 4.細胞培養および脂肪生成誘導<ol><li> SVFの文化および2日間毎に交換する基礎培地中の6ウェル組織培養プレート中のAPCを含む。 3回の連続継代後、8ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、24ウェルプレートで50,000細胞/ウェルで評価される増殖アッセイのために1×10 2細胞/ウェルの黒色96ウェル組織培養プレートにプレートするか、定性的および定量的である脂肪生成アッセイのための48ウェル組織培養プレート中の10,000細胞/ウェル。 </li><li>分化のために示されたように、骨形成タンパク質4（3.3nmol / L）によるコンフルエント後48時間および誘導前のAPC基礎培地の補充。細胞をインキュベートするためにAPC誘導培地を用いて100％コンフルエンシー（0日目）の48時間後に細胞を誘導する。 </li><li> 48時間後、培地を交換して、IBMXおよびデキサメタゾンを含まないAPC誘導培地中で、14時間毎に培地を交換し、48時間ごとに細胞を維持する。 </li><li> FACSによって検証されたMCS分離。 <ol><li>磁気的に分離した50μL（50,000セル）のサブサンプルを取るFACS溶液で洗浄する。 </li><li>細胞を遠心分離し、PDGFRα +細胞を標識するロバ抗ウサギIgG Dylight 405の1：1,000溶液100μL中に再懸濁する。軽く、4℃で30分間インキュベートする。 </li><li>フローサイトメーターで488 nm（FITC）および405 nm（Dylight 405）フィルターを使用して解析するまで、細胞を洗浄し、2％ホルムアルデヒド溶液200μLで再懸濁します。 注：培養細胞による脂質蓄積は、蛍光を測定するマイクロプレートリーダーで脂質親和性脂肪生成蛍光アッセイを使用し、脂質蓄積のキャリブレーターとして前脂肪細胞を使用して定量的に評価する。脂質蓄積はまた、脂質色素を染色するかまたは含まない全細胞のパーセンテージを観察可能にする、カメラを備えた倒立顕微鏡で行われる脂質色素染色およびイメージングによって定性的に測定される。 485nmでの励起および572nmでの発光で蛍光を測定することができる任意のプレートリーダーnmは、デジタル画像を取り込むことができるカメラを備えた顕微鏡と同様に、分析にも適しています。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

本実験の中心的な焦点は、PVATデポからのAPCの単離、拡大、および脂肪生成誘発である。ここでは、表面マーカーCD34およびPDGFRαを発現する細胞の同定に基づいて、APCの単離のためのプロトコールを提示する。これらの表面タンパク質は、APC上で、高い増殖速度および様々な脂肪貯蔵庫14,15中の白色または褐色脂肪細胞に分化する可能性を伴って以前に同定された。これらの?...

脈管周囲脂肪組織（PVAT）は、血管に近接しているため、脈管機能1における主要なパラクリンシグナル伝達成分である。この脂肪組織の拡大は、存在する脂肪細胞前駆細胞（APC）の表現型に依存する2,3 。脂肪組織からの細胞の単離は、主要な脂肪細胞が壊れやすく、浮力があり、大きさの範囲があるため、困難である。特定の単離技術はまた、炎症性タンパク質合成を増加させ、脂肪生成遺伝子発現を減少させることによって細胞表現型および形態を変えることができ、細胞の完全性を維持するプロトコルの重要性を強調する。 初代細胞および特異的前脂肪細胞亜集団の培養は、インビボ増殖に対する還元主義的アプローチを提供し、同等の細胞遺伝的メイクアップ5を維持するが、これらの細胞の私は、老化や老化による劣化のために制限されています6 。皮下および大網デポーを含む様々な脂肪デポーからの前脂肪細胞もまた、特定の解剖学的部位から細胞を集めることの重要性を強調する増殖の差異7を示す。非PVAT白色脂肪細胞由来の前駆細胞は、以前の研究7,8,9において特徴付けられてきたが、PVAT APC表現型についてはあまり知られていない。 ここに記載された技術は、形態学、生存能力、および増殖および分化の可能性に最小限の影響を及ぼしながら、特異的および限定されたAPC集団の分析を可能にする。ビーズが細胞を変えずに溶解するので、磁気活性化細胞選別（MCS）は、培養などの下流の適用に適している。 MCSもまた経済的であり、一旦、抗体の欠点フローサイトメトリーアッセイの必要性は最小限に抑えられています。 PVAT前駆体を用いたインビトロ研究はまた、これらの初代細胞が有する可能性を垣間見ることができる。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Dissection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Dishes</td><td>Handmade with Silicone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture Petri Dish</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 Glass</td></tr><tr><td>Silicone Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 170</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Harvard Apparatus</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>Stereomicroscope MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-150</td><td></td></tr><tr><td>Splinter Forceps</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-55</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Scissors</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>105-400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;KRBB Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-114</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimicotic</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Digestion&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td>1X Working Solution</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2876</td><td>Reciprocal Shaking Bath</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>1385</td><td></td></tr><tr><td>Rotisserie Incubator</td><td>Daigger</td><td>EF4894C</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td>Yellow</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Blue</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Kit</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-108</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM):F12 Medium</td><td>Corning</td><td>90-090</td><td>Medium Base</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35016CV</td><td>USA Origins</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>AbCam</td><td>AB7475</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7324</td><td>FITC-conjugated</td></tr><tr><td>Anti-PDGFR&amp;alpha;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>PA5-17623</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>1X Working Solution</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cell Incubator</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>51030285</td><td>Heracell 160i&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6-Well Plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>TC-Treated</td></tr><tr><td>48-Well Plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>TC-Treated</td></tr><tr><td>96-Well Plates, Black Wall</td><td>Corning</td><td>353376</td><td>TC-Treated</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>144-55-8</td><td>TC-Treated</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td>USA Origins</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>137-08-6</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>61-030</td><td></td></tr><tr><td>Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4)</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-081</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>400-25</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>PeproTech</td><td>250-02</td><td></td></tr><tr><td>Platelet-derived Growth Factor BB</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-740</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Corning</td><td>25-800-CR</td><td>ITS Solution</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28822-58-4</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-02-2</td><td></td></tr><tr><td>T3 (Triiodothyronine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6893-023</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyQUANT Proliferation Assay</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>AdipoRed Fluorescence Assay Reagent</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O Lipid Dye Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391</td><td>In Solution</td></tr><tr><td>M1000 Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Inverted Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital Sight DS-Qil Camera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expansion and adipogenesis induction of adipocyte progenitors from perivascular adipose tissue isolated by magnetic activated cell sorting

パラクラインシグナリングを介した血管機能の主要調節因子である血管周囲脂肪組織（PVAT）の拡大は、肥満時の高血圧の発症に直接関連する。肥大および過形成の程度は、デポの位置、性別、および存在する脂肪細胞前駆細胞（APC）表現型のタイプに依存する。過去10年間のAPCおよび前脂肪細胞分離のために使用された技術は、個々の細胞が特定の細胞表面マーカーに基づいて同定され得る正確さを大幅に改善した。しかしながら、APCおよび脂肪細胞の単離は、特にインタクトな細胞を細胞培養適用のために保持しなければならない場合、細胞の脆弱性のために困難であり得る。 磁気活性化細胞選別（ MCS）は、脂肪組織の重量単位あたりより多くの生存APCを単離する方法を提供する。 MCSによって回収されたAPCは、インビトロプロトコールでプレア成長因子カクテルを使用してそれらを脂肪細胞に分化させ、細胞によって保持された多分性および脂肪生成能の分析を可能にする。この実験は、拡張中の心臓血管疾患の発症において重要な役割を果たす大動脈および腸間膜のPVATデポーに焦点を当てた。これらのプロトコルは、定義されたAPC集団を分離し、拡大し、そして区別するための方法を記載する。このMCSプロトコルは、最小限の設備またはトレーニングで細胞選別が必要なあらゆる実験で分離を使用することを可能にする。これらの技術は、細胞表面マーカーの存在に基づいて特定の細胞集団の機能性を決定するさらなる実験を助けることができる。

前脂肪細胞の増殖能力および脂肪細胞前駆体の脂肪生成能は、インビトロで維持される特性である11 。定量的DNAアッセイを用いてプレーティングした8,24,48および96時間後に、雄ラットのaPVAT、mPVAT、およびGONから単離したSVFおよびAPCのin vitro増殖を評価した。同じサイトのSVF細胞（ 図1 ）と比較して96時間の増殖が?...

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Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

expansion-adipogenesis-induction-adipocyte-progenitors-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K ビュー.  Michigan State University. ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。 

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Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ASCに）

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

発生生物学

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

神経紋の分離、培養、脂肪形成誘導、周食脂肪組織由来の脂肪由来幹細胞

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

<meta charset="utf8"></head><body>マウスの心臓と骨格筋の消化による線維脂肪形成前駆細胞培養

Fibro-Adipogenic Progenitor Isolation, Expansion, and Differentiation from the Spiny Mouse Model

Due to its exceptional repair program, the spiny mouse is an emerging research model for regenerative medicine. Fibro-adipogenic progenitors are tissue-resident cells that are able to differentiate into adipocytes, fibroblasts, and chondrocytes. Fibro-adipogenic progenitors are fundamental for orchestrating tissue regeneration as they are responsible for extracellular matrix remodeling after injury. This study focuses on investigating the specific role of fibro-adipogenic progenitors in spiny mouse cardiac repair and skeletal muscle regeneration. To this end, a protocol has been optimized for the purification of spiny mouse fibro-adipogenic progenitors by flow cytometry from enzymatically dissociated skeletal and cardiac muscle. The population obtained from this protocol is capable of expanding in vitro, and can be differentiated to myofibroblasts and adipocytes. This protocol offers a valuable tool for researchers to examine the distinctive properties of spiny mouse, and to compare them to the Mus musculus. This will provide insights that could advance the understanding of regenerative mechanisms in this intriguing model.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:とげのあるマウスモデルを研究するための革新的なプロトコルによる細胞解析の合理化(英語)

This protocol outlines the isolation of skeletal and cardiac muscle fibro-adipogenic progenitors (FAPs) from spiny mouse (Acomys) via enzymatic dissociation and fluorescence-activated cell sorting. The FAPs obtained from this protocol can be effectively expanded and differentiated to myofibroblasts and adipocytes.

とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

Due to its exceptional repair program, the spiny mouse is an emerging research model for regenerative medicine. Fibro-adipogenic progenitors are ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

免疫・感染学

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

生物学

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

マウス白脂肪組織の半自動単離

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

著者スポットライト:組織解離器を使用したマウス白脂肪組織からの間質血管画分の半自動分離  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

要約

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脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離

神経紋の分離、培養、脂肪形成誘導、周食脂肪組織由来の脂肪由来幹細胞

とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)