Name: differentiating chondrocytes from peripheral blood-derived human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2017-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
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著者らは彼のプラスミドについてXiaobin Zhangに感謝したい。私たちはまた、実験中に彼らの親切な助けをしてくれたShaorong GaoとQianfei Wangにも感謝します。この研究は、中国国立自然科学財団（No.81101346,81271963,81100331）、北京215高水準人材養成プロジェクト（No.2014-3-025）、北京チャオヤン病院基金（No CYXX-2017-01）、中国科学アカデミー青年イノベーション推進協会（YL）

PBCsからhiPSCを生成するためのプロトコールは、我々の以前の研究5に見出すことができる。この研究は、私たちの機関の機関審査委員会によって承認されました。 1.胚様体（EB）形成<ol><li> 5％ウシ胎児血清（FBS）、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、2mM L-メルカプトエタノール、2mM L-メチオニン、および2mM LPSを補充したノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） - グルタミン、および8ng / mL塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含む。 </li><li> 50mLのEB形成培地を調製する：15％KSR、5％FBS、1x非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを添加したDMEM。 </li><li> 20％FBS、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを補充した基礎培地50mLを調製する。 </li><li>ディスパーゼ溶液10 mLをノックアウトDMEMで1 mg / mLに調製する。 </li><li>カルチュフィーダー細胞（ すなわち、照射されたマウス胚線維芽細胞の単層）を有する60mm組織培養皿上に再平滑化した。細胞が80〜90％コンフルエントである場合、細胞をディスパーゼで解離させ、4〜5日ごとにhiPSCs1：3を通過させる。 37℃および5％CO 2インキュベーターに細胞を入れる。 </li><li> iPSCsが80〜90％コンフルエントである場合、未分化hIPSCコロニーを火で引かれたガラス針を用いてより小さな断片（直径約50〜100μm）に解剖する。一般に、100mmのペトリ皿にEBを生成するために60mmの皿にhiPSCコロニーを使用します。 <ol><li> 10mLのEB形成培地を含む100mmの付着していないペトリ皿に100個未満の小さなコロニーを培養する。皿を37℃および5％CO 2インキュベーターに入れる。 </li></ol></li><li>初期培地の約25％を2日ごとに等量の基礎培地に交換する。 EBを落ち着かせるためにディッシュを傾けます。注意深く3 mL新鮮な基礎培地4 mLを添加する。 EBを邪魔しないでください。 注：EBは、コロニーの断片によって形態学的に特徴付けられ、顕微鏡下で滑らかな境界を有する丸い外観をとる。 </li><li>非粘着性のペトリ皿で10日間培養した後、使用前に37℃で30分間、4℃の0.1％ゼラチンで新しい100mm組織培養皿をコーティングする。 </li><li>培地とEBを100 mmの付着していないペトリ皿から15 mLコニカルチューブに移す。 EBを4〜5分間沈降させる。上清を注意深く吸引し、培地+ EBの0.5 mL未満を残す</li><li> 10mLの基礎培地を含む100mmのゼラチン被覆組織培養皿上に100個未満のEBを種子に接種する。皿を37℃および5％CO 2インキュベーターに入れる。 </li></ol>細胞ペレット形成および軟骨細胞分化<ol><li> 0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）10 mLを調製する。 basの80 MLを作るα培養培地：20％FBS、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを補充したDMEM。 </li><li> 10％インスリントランスフェリンセレン溶液（ITS）、0.1μMデキサメタゾン、1mMアスコルビン酸、1％ピルビン酸ナトリウム、および10ng / mLのトランスフォーミング増殖因子 - セレン溶液を補充したDMEM（高グルコース） β1（TGF-β1）である。 </li><li> 48時間後に培地を10 mLの基礎培地で再び分けます。その後、10mLの基礎培地で3日ごとに培地をリフレッシュする。 注：培養10日後、線維芽細胞の細胞の伸長はEBから拡大しているはずです。 <ol><li>使用前に、100 mmディッシュを4 mlの0.1％ゼラチンで30分間37℃でコートします。細胞上清を捨て、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で一度洗浄する。 </li><li>細胞を37℃で5分間0.25％トリプシン/ EDTA 3 mLで消化し、4 mで中和するLの基礎培地を含む。 </li></ol></li><li> 5〜10回上下にピペッティングし、70μmナイロンメッシュに通すことにより、細胞を単一細胞に解離させる。細胞懸濁液を200xgで5分間遠心分離する。新しい100mmゼラチンコート組織培養皿に細胞を基礎培地10mLで再播種する。 </li><li> 48時間後に培地を10 mLの基礎培地で再び分けます。その後、10mLの基礎培地で3日ごとに培地をリフレッシュする。 注：細胞は、均一な線維芽細胞様形態を獲得する。 </li><li> 約90〜100％のコンフルエンスに達したら（ すなわち、約5〜7日）、細胞を37℃で0.25％トリプシン/ EDTA 3mLで5分間採取する。基本培地4 mLで中和する。ピペットで5回上下させることにより、細胞を単一の細胞に解離させる。血球計算盤を使用して細胞数を数えます。 <ol><li> 15mLポリプロピレンチューブに3×10 5個の細胞を入れる。 200 xgで遠心分離機室温（RT）で5分間インキュベートする。 1mLの軟骨形成分化培地で細胞を再懸濁する。 </li></ol></li><li>細胞を300xgで3分間再遠心分離し、小さなペレット形態で細胞を維持する。チューブを37℃および5％CO 2インキュベーターに21日間入れる。蓋をしっかり締めてガス交換をしないでください。 </li><li>新鮮な軟骨形成分化培地で3日ごとに培地の3/4を交換する。 注：培養21日後、hiPSC-軟骨形成ペレット（hiPSC-Chon）が形成されているはずである。陽性対照としてのヒト間葉系幹細胞（MSC）も回収し、軟骨形成性分化培地で21日間培養し、軟骨形成性ペレット（hMSC-Chon）を形成する。 </li></ol> 3.軟骨分化の解析<ol><li> 10％中性緩衝ホルマリン10 mLを調製する。 </li><li> 50mLの0.1％アルシアンブルー試薬と50mLの1％トルイジンブルー試薬を調製する。 </li><li> Pr一次抗体：コラーゲンII（1:50）に対するウサギポリクローナル抗体またはコラーゲンX（1:50）に対するマウスモノクローナル抗体の1mLを発現させる。また、抗ウサギまたはマウス二次抗体を調製する。 </li><li> 1mLのパパイン溶液を調製する：0.1M酢酸ナトリウム、2.4mM EDTA、および5mM L-システインを含むPBS中10U / mL。 </li><li> 100ミリリットルのジメチルメチレンブルー（DMMB）染料溶液を調製する：100μLの16mg / Lの1,9-ジメチルメチレンブルー、40mMのグリシン、40mMのNaCl、および9.5mMのHCl; pH3.0。 </li><li> ペレット切片のアルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色による軟骨形成分化を評価する。 <ol><li> 1mLの10％中性緩衝ホルマリン中で24時間、1つのhiPSC-ChonペレットまたはhMSC-Chonペレットを固定する。 </li><li>ペレットをH 2 O中の70％エタノール1mLに移す。ペレットを1mLの段階的エタノールシリーズ（ すなわち、 25,50,75,90,95,100および100％、それぞれ3分間）で脱水する。 </li><li>ペレットを1％100％キシレンで3回洗浄する。侵入者ペレットを65℃のオーブン中でパラフィンで1時間処理する。通常の組織学的手順6に従って、ペレットをパラフィンブロックに7×7×5mm 3ベース金型で埋め込む。6 。 </li><li>約4μmの厚さのミクロトームで隣接する切片を作る7 。セクションをスライドガラスに貼り付けます。 </li><li>スライドを60℃で2時間オーブンで乾燥する。 100％キシレンを用いて3サイクル（各3分）で切片を脱パラフィンする。 </li><li>再水和（ すなわち、 H 2 O中100,100,95,95,70,50、および25％、それぞれ3分間）のために減少するアルコール系列を使用し、次いで5分間脱イオン水で最終的なすすぎを行う。 </li><li> 0.1％アルシアンブルー試薬または1％トルイジンブルー染色で4〜5時間染色した後、蒸留水ですすいでください。 </li><li>段階的エタノールシリーズ（ すなわち、 25,50,75,90,95,100,100％、各3分）で脱水し、続いて3回連続して100％キシレンでの浄化のeps。スライドをマウントし、顕微鏡で視覚化します。 </li></ol></li><li> 免疫組織化学を行う。 注：追加のペレット切片を免疫組織化学によってさらに評価する。 <ol><li>脱パラフィンおよび再水和後、スライドを1mM EDTA、pH8.0（オートクレーブで沸騰させた水中での防水）中で沸騰させる。それらを沸点以下の温度で8分間放置させ、次にスライドを室温で冷却させる。 </li><li>スライドを脱イオン水で3回すすぐ。切片をメタノール中の3％H 2 O 2溶液に室温で15分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。 </li><li>脱イオン水でスライドをすすぎ、DPBSに5分間浸します。 50-100μLの適切に希釈した（1:50）一次抗体をスライド上の切片に適用し、次にそれらを加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートする。 </li><li> DPBSでスライドを3回（各5分）洗浄する。 saをインキュベートする対応する二次抗体（ すなわち、抗ウサギまたはマウス）と、RTで15分間掛けた。 </li><li> DPBSでスライドを3回（それぞれ5分間）洗浄する。顕微鏡下でDAB検出を行います。 </li><li>スライドをDPBSで3回洗浄する（各2分）。スライドをヘマトキシリン中に1〜2分間浸して細胞核を対比染色する。漸変エタノールシリーズ（25,50,75,90,95,100,100％;各3分）で脱水した後、キシレンで3回連続して清澄化する。最後に、スライドをマウントし、それらを顕微鏡下で視覚化する。 </li></ol></li><li> sGAGコンテンツを検出します。 <ol><li> 60℃で2時間、パパイン溶液中の軟骨形成性のペレットを消化する。 </li><li> dsDNAアッセイキットおよび蛍光光度計システムを使用してDNA含量を決定する。 525 nmの8の吸光度を測定する下DMMB色素溶液と混合することによってのsGAG含量を測定します。 </li><li>標準曲線に対するsGAGの濃度を計算するサメのコンドロイチン硫酸。 </li></ol></li><li> hiPSC-Chonペレット中の軟骨分化マーカーのリアルタイムPCR分析を実施する。 <ol><li> 500μLの氷冷抽出試薬を1本のチューブに加えることにより、同じ軟骨形成性のペレットを3〜4回収穫する。徹底的にボルテックス。サンプルを室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 0.1mLのクロロホルムを加える。サンプルを15秒間ボルテックスし、室温で3分間インキュベートする。 12,000 xgおよび4℃で15分間サンプルを遠心分離する。上水相（約250μL）を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。 </li><li> 25μLの酢酸ナトリウムと1μLのグリコーゲンをサンプルに添加する。 250μLのイソプロピルアルコールと混合してRNAを沈殿させます。徹底的に混合する。サンプルを室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 12,000 xgおよび4℃で10分間遠心分離する。上清を完全に除去する。 RNAペレットを500μLの75％エタノールで2回洗浄する。 </li><li> 5分間遠心分離する7,500 xgおよび4℃で測定した。残りのエタノールをすべて除去し、RNAペレットを5〜10分間風乾します。 10μLのヌクレアーゼフリー水にRNAを溶解する。 </li><li>逆転写酵素システムを用いてRNAをcDNAに変換する。定量PCRキットマスターミックス（2×）を用いて、リアルタイムPCRおよびリアルタイムPCRシステム9にcDNAサンプルを施します。 注：プライマー配列は次のとおりです。 h AGGRECAN -F：TCGAGGACAGCGAGGCC; h AGGRECAN -R：TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA; hβ-ACTIN -F：TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC; hβ-ACTIN- R：GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC; h COL2- F：TGGACGATCAGGCGAAACC; h COL2- R：GCTGCGGATGCTCTCAATCT; h SOX9- F：AGCGAACGCACATCAAGAC; h SOX9- R：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG; h COL10- F：ATGCTGCCACAAATACCCTTT; h COL10- R：GGTAGTGGGCCTTTATGCCT。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

ここでは、iPSCを介してPBCから軟骨細胞を生成するためのプロトコールを提供する。 PBCはより一般的であり、臨床分野で広く使用されているので、それらは再プログラムのための潜在的な代替物として提示される。この研究では、エピソームベクター（EV）を用いて、Zhang らによって確立された方法に従って、PBCをiPSCに再プログラムした。 11 。この統合のない?...

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The corresponding author was updated from:
Yueying Li 
yueyinglee2010@hotmail.com 
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu 
waterkins@163.com 
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

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Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

軟骨組織は、自己修復および再生の能力が非常に低い。様々な外科的介入および生物学的処置が、不十分な結果を伴って軟骨および関節機能を回復させるために使用される。最近の幹細胞技術の発展は、軟骨修復領域全体を変化させる可能性がある1 。様々な幹細胞が種細胞として研究されてきたが、拒絶反応を起こさずに多くのタイプの患者特異的細胞を提供することができるため、ヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）が最も有望な選択肢であるようである2 。さらに、成人細胞の限られた増殖性を克服し、自己複製能および多能性を維持することができる。さらに、特定のタイプの軟骨細胞を得るために遺伝子ターゲティングを用いて遺伝子型を変えることができる。 再プログラミングの可能性も十分に研究されているので、繊維芽細胞はiPSCを生成するために広く使用されている。しかし、患者からの痛みを伴う生検や、線維芽細胞のin vitroでの拡大が必要であり、遺伝子突然変異を引き起こす可能性があるなど、まだ克服しなければならないいくつかの限界が存在する3 。最近、PBCはリプログラミング4にとって有利であることが判明した。さらに、それらは一般に利用され豊富に貯蔵されていた。研究の焦点を皮膚からリダイレクトする可能性があります。しかし、私たちが知る限りでは、軟骨細胞への分化が続くPBCの再プログラミングに関する報告はほとんどありません。 現在の研究では、軟骨細胞の形成を模倣するために、iPSCをそれらをiPSCに再プログラミングし、次いでペレット培養系を介して軟骨系統に分化させることによって、PBCを代替源として利用する。

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td>Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>sh30070.03</td><td>Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture</td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Chemicon</td><td>TMS-001-C</td><td>Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>TMS-002-C</td><td>An amino acid required for cell culture</td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td>Used for hiPSC dissociation for subculture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11960</td><td>Basal medium used for MSC culture medium</td></tr><tr><td>0.1% gelatin</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>Used for cell attachment onto the dishes</td></tr><tr><td>0.25% trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Used for cell dissociation</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>invitrogen</td><td>21985023</td><td>Used as a growth supplement in all the cell culture medium.</td></tr><tr><td>ITS</td><td>invitrogen</td><td>41400045</td><td>Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation.</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>4403</td><td>Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose.</td></tr><tr><td>Transforming growth factor-beta 1</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-21C</td><td>A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation.</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues.</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal antibodies to Collagen X</td><td>Abcam</td><td>ab49945</td><td>This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes.</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>For mounting and long-term storage of slides</td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Sigma</td><td>89640</td><td>Used for proteoglycans detection.</td></tr><tr><td>Alcian blue</td><td>Amresco</td><td>#0298</td><td>Used for glucosaminoglycans detection.</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762-25MG</td><td>Used to digest chondrogenic pellets.</td></tr><tr><td>Dimethylmethylene blue</td><td>Sigma</td><td>341088-1G</td><td>Used to quantitate glycosaminoglyans</td></tr><tr><td>Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage</td><td>Sigma</td><td>C4384-250MG</td><td>Used to draw the standard curve for sGAG content measurement.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851 (100)</td><td>Used to determine DNA content</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Used for RNA isolation from cells</td></tr><tr><td>Reverse Transcriptase System</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>Used to convert RNA into cDNA</td></tr><tr><td>SYBR FAST qPCR kit Master Mix</td><td>Kapa</td><td>KK4601</td><td>Used for Real-time PCR</td></tr></tbody></table>

differentiating chondrocytes from peripheral blood-derived human induced pluripotent stem cells

この研究では、統合された方法で誘導された多能性幹細胞（iPSCs）を介して軟骨細胞を産生するために、末梢血細胞（PBC）を種細胞として使用した。胚様体（EB）形成および線維芽細胞増殖に続いて、iPSCは、無血清および無細胞条件下で21日間軟骨分化のために誘導される。軟骨細胞誘導後、形態学的、免疫組織化学的および生化学的分析、ならびに軟骨形成性分化マーカーの定量的リアルタイムPCR検査によって、細胞の表現型を評価する。軟骨形成性ペレットは、アルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色が陽性であることを示す。コラーゲンIIおよびX染色の免疫組織化学も陽性である。硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）含量および軟骨分化マーカーCOLLAGEN2 （ COL2 ）、 COLLAGEN10 （ COL10 ）、 SOX9およびAGGRECANは、hiPSCsおよび線維芽細胞と比較して非還元性のペレットが得られた。これらの結果は、PBCを軟骨修復のためのiPSCsを生成するための種細胞として使用することができることを示唆しており、これは患者特異的かつ費用対効果が高い。

hiPSCsの軟骨形成分化： EB形成培地および基礎培地を使用してhiPSCを間葉系統に分化させた。多段階培養法を用いた（ 図1 ）。最初に、hiPSCを10日間EB形成により自発的に分化させた（D10; 図2A ）。第2に、細胞はEBからさらに10日間（D10 + 10）逸脱した。これらの2つのステップの間、i...

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Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

我々は、胚様体（EB）形成、線維芽細胞増殖および軟骨形成誘導を含む無組み込み法を用いて、誘導末梢血（PB）から誘導された多能性幹細胞（iPSC）を介して軟骨系統を生成するためのプロトコールを提示する。

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

differentiating-chondrocytes-from-peripheral-blood-derived-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K ビュー.  Capital Medical University. 我々は、胚様体（EB）形成、線維芽細胞増殖および軟骨形成誘導を含む無組み込み法を用いて、誘導末梢血（PB）から誘導された多能性幹細胞（iPSC）を介して軟骨系統を生成するためのプロトコールを提示する。 

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Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 &#215; g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

発生生物学

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial cells, which line blood vessel lumens, from human pluripotent stem cells is crucial for a multitude of tissue engineering and regeneration applications. In vivo, primordial endothelial cells are derived from the mesodermal lineage and are specified toward specific subtypes, including arterial, venous, capillary, hemogenic, and lymphatic. Hemogenic endothelial cells are of particular interest because, during development, they give rise to hematopoietic stem and progenitor cells, which then generate all blood lineages throughout life. Thus, creating a system to generate hemogenic endothelial cells in vitro would provide an opportunity to study endothelial-to-hematopoietic transition, and may lead to ex vivo production of human blood products and reduced reliance on human donors. While several protocols exist for the derivation of progenitor and primordial endothelial cells, generation of well-characterized hemogenic endothelial cells from human stem cells has not been described. Here, a method for the derivation of hemogenic endothelial cells from human embryonic stem cells in approximately 1 week is presented: a differentiation protocol with primitive streak cells formed in response to GSK3&#946; inhibitor (CHIR99021), then mesoderm lineage induction mediated by bFGF, followed by primordial endothelial cell development promoted by BMP4 and VEGF-A, and finally hemogenic endothelial cell specification induced by retinoic acid. This protocol yields a well-defined population of hemogenic endothelial cells that can be used to further understand their molecular regulation and endothelial-to-hematopoietic transition, which has the potential to be applied to downstream therapeutic applications.

Presented here is a simple protocol for the directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells in approximately 1 week.

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a step-by-step method for differentiating induced pluripotent stem cells (iPSCs) into chondrocyte-based spheroids, supporting tissue engineering and cell therapy applications. The differentiation process is carefully structured to promote chondrogenic lineage commitment, beginning with iPSCs cultured in specific media that sequentially guide cells through critical stages of differentiation. Initially, iPSCs are expanded to reach optimal confluency before induction toward chondrogenic lineage using a series of defined media changes. By day 10, cells are transitioned to a chondrogenesis-promoting medium that enhances the formation of chondrocyte-like cells expressing key markers of mature chondrocytes. Further aggregation in 96-well agarose-coated plates leads to the formation of three-dimensional spheroids, which are then cultured in custom mini-bioreactors designed to simulate a microenvironment that encourages extracellular matrix (ECM) deposition. By enabling scalable production of chondrocyte spheroids that mimic native cartilage characteristics, this approach offers a promising, reproducible solution for developing cell-based treatments for cartilage defects, providing broad utility for clinical and research applications in musculoskeletal regenerative medicine.

This study describes a method for producing chondrocytic spheroids by aggregating cells into spheroids under low-adhesion conditions using gravity, followed by culturing the resulting spheroids in mini-bioreactors.

重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...

生物工学

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

生物学

hiPSC駆動MSCにおける表面抗原と増殖能の特性評価

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

著者スポットライト:iPS細胞と遺伝性疾患研究の進歩 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

ヒト人工多能性幹細胞から間葉系間質細胞への分化のための2つの代表的な方法の比較

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

要約

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遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

ヒト人工多能性幹細胞から間葉系間質細胞への分化のための2つの代表的な方法の比較

ヒト人工多能性幹細胞から間葉系間質細胞への分化のための2つの代表的な方法の比較