この研究は、カナダの自然科学・工学研究評議会（NSERC）とカナダ健康研究所（CIHR）からの助成によって部分的に支えられています。ウイニペグのビクトリア総合病院とウイニペグのセブンオークス総合病院の応用臨床教育研究所は、ヒト被験者から臨床サンプルを管理していただき、ありがとうございました。 Hagit Peretz-Soroka博士に、アッセイ操作の戦略についての有益な議論に感謝します。 <style type="text/css">
</style>ワイルドー大学のCarolyn Ren教授とXiaoming（Cody）Chen博士に、撮影プロセスにおける豊富なサポートに感謝します。

すべてのヒト試料採取プロトコールは、ウィニペグのマニトバ大学の共同学部研究倫理委員会によって承認された。 マイクロフルイディックデバイス製造（ 図1A ） <ol><li> デザインと印刷透明マスク。 <ol><li>前に詳述したようにデバイスを設計してください。 図1Aを参照のこと。 注記：デバイスには2つのレイヤーがあります。第1の層（高さ4μm）は、勾配チャネルの横の細胞を捕捉するための細胞ドッキングバリアチャネルを規定する。第2の層（高さ60μm）は、勾配生成チャネル、細胞装填のためのポートおよびチャネル、化学的入口リザーバおよび廃棄物出口を規定する。アライメントマークは、2つの層に対して設計されている。第2の層の場合、上流の蛇行入力チャネルの長さおよび幅は、それぞれ60mmおよび200μmであり、下流の長さと幅蛇行入力チャンネルはそれぞれ6mmと280μmです。 </li><li>高解像度プリンタを使用して、第1および第2のレイヤーのフィーチャを透明マスクに印刷します。 注：印刷解像度は、デザインの最小機能によって異なります。現在の設計では、10μmの最小フィーチャに対して32,000dpiが選択された。 </li></ol></li><li> シリコンウェーハをクリーニングします。 <ol><li>プラズマクリーナにシリコンウェーハを3枚入れます。 3分間真空を適用する。 </li><li>プラズマパワーをオンにし、レベルをHIGHに設定します。シリコンウェハを30分間処理するために酸素プラズマを使用する。 </li><li>プラズマクリーナーをオフにしてシリコンウェーハを取り出します。シリコンウェーハはデバイスモールドを製造する準備が整う。 </li></ol></li><li> クリーンルーム施設でフォトリソグラフィーによって第1の層を製作する。 注記：正確な製造パラメータは、製造施設によって異なる場合があります。 <ol><li> 10mLのSU-8 2025を10mLのSU-8 2000をガラスブレーカに入れて設計されたフォトレジストを調製した。泡が消えるまで、混合物をヒュームフードに10分間放置する。 </li><li>洗浄したシリコンウェーハを注意深くスピナーに適切なチャックで置き、真空をかけてシリコンウェーハを固定します。 </li><li>慎重に、3 mLのフォトレジスト混合物をシリコンウェーハの中心に注ぎます。 500rpmで5秒間回転させる。次に、3000rpmで30秒間回転させて、シリコンウェーハ上に最終的な4μmの厚さのフォトレジストコーティングを得る。 </li><li>慎重にスピンナーからシリコンウェーハを取り出し、ホットプレート上でシリコンウェーハを95℃で4分間ベークします。 </li><li>マスクアライナーにシリコンウェーハを慎重に置き、UV暴露時間を6秒に設定します。粘着テープを使用して透明ガラス板上に第1層の透明マスクを慎重に取り付ける。 </li><li>マスクが貼られた透明ガラス板をアライナーに静かに置き、マスクをシリコンウェーハに合わせます。 siを公開するliconウェーハをUVに曝して細胞ドッキング構造をパターニングする。 </li><li>慎重にガラス板を取り外し、露出したシリコンウェーハを取り出します。 95℃で4分間、ホットプレート上でシリコンウェーハを焼く。 </li><li>シリコンウェーハをヒュームフードに移し、SU-8デベロッパーが入っているガラスパンに置きます。これを30秒間静かに振ってください。 </li><li>新鮮なSU-8現像液を使用してシリコンウェーハを洗浄し、次にヒュームフード内のイソプロピルアルコール（IPA）を洗浄します。ヒュームフード内の窒素ガスでシリコンウェーハを乾燥させる。最初のレイヤーが準備完了です。 </li></ol></li><li> 第1層の第2層を製作する。 <ol><li>接着テープを使用して、第1層のアライメントマークをカバーします。慎重に、スピナーの真空チャック上に第1の層を有するシリコンウェーハを置き、真空を適用してシリコンウェーハを固定する。 </li><li>シリコンウェーハ上に3 mLのSU-8 2025フォトレジストを注ぎます。シリコンウェーハを500 rpmで5秒間回転させます。次に2000rpmで30分間回転させるシリコンウェーハ上に最終的な厚さ60μmのフォトレジストコーティングを得る。 </li><li>スピンナーからシリコンウェーハを慎重に取り出し、ホットプレートに移します。 65℃で2分間焼く。 </li><li>粘着テープを静かに取り外して、第1層のアライメントマークを露出させます。ホットプレート上にシリコンウェーハを置き、95℃で6分間ベークします。 </li><li>マスク・アライナにシリコン・ウェーハを慎重に置き、UV照射時間を18秒に設定します。 </li><li>透明なガラス板の上に第2層の透明マスクを粘着テープで注意深く取り付けます。 </li><li>アライナーのガラスにマスクを貼った状態で慎重にアライナーに置き、アライナーの検査用顕微鏡を使用して、交差アライメントマークでマスクと第1層をシリコンウェハー上に合わせます。 </li><li>フォトレジストでコーティングされたシリコンウェハをUVに暴露して、細胞負荷および勾配チャネルをパターン化する。 </li><li>慎重にガラス板を取り出してシリコンwを取り出しますアファー。シリコンウェーハをホットプレート上で65℃で2分間ベークし、次にシリコンウェーハを別の95℃ホットプレートに移し、6分間ベークする。 </li><li>シリコンウェーハをヒュームフードに移し、SU-8デベロッパーが入ったガラス皿に置きます。静かに6分間振とうする。 </li><li>新鮮なSU-8現像液を使用してシリコンウエハを洗浄し、次にヒュームフード内のIPAを洗浄する。 </li><li>ヒュームフード内の窒素ガスを用いてシリコンウェーハを乾燥させます。ホットプレート上にシリコンウェーハを置き、金型を150℃で30分間ハードベークします。第2層は準備ができている。 </li></ol></li><li> マスターモールド表面改質。 注：ソフトリソグラフィにおけるモールドからのポリジメチルシロキサン（PDMS）の放出を容易にするために、SU-8モールドにシラン処理表面改質工程を適用する。 <ol><li> 10μLのトリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル（トリクロロシラン）溶液をマイクロピペットチップに入れます。マイクロピペットチップを15mLプラスチックチューブに入れ、チューブのキャップを緩めます。 </li><li>チューブとSU-8パターニングされたシリコンウェーハをデシケータの中に置き、1時間真空を適用する。マスクモールドは、PDMSデバイスを製造する準備が整う。 </li></ol></li><li> PDMSデバイスを製作します。 <ol><li>プラスチックビーカーにPDMSベース40gと硬化剤4gを混合してPDMS溶液を調製します。準備されたSU - 8マスター型をペトリ皿に置き、44g PDMS溶液を注意深く鋳型上に注ぐ。 </li><li>ペトリ皿をデシケーターに入れ、PDMS溶液を20分間脱気するために真空を適用する。次に、ペトリ皿をオーブンに入れ、PDMSを80℃で2時間硬化させます。 </li><li>ベーキング後、ペトリ皿を取り出してクリーンベンチに置きます。 PDMSスラブを慎重に切断してSU-8モールドから剥がします。 </li><li>直径3mmのパンチャーを使用して、細胞ローディングポートを打ち抜きます。直径6mmのパンチャーを使用して、化学薬品注入口リザーバーと廃棄物排出口を打ち抜きます。 </li><li>埃を取り除く粘着テープを使用してPDMSスラブの表面に塗布する。 PDMSスラブときれいなスライドガラスをプラズマ装置に入れます。真空を3分間適用する。 </li><li>プラズマパワーをオンにし、レベルをHIGHに設定します。静かに空気弁を調整し、PDMSスラブとガラススライドを3分間プラズマで満たします。 </li><li>プラズマパワーをオフにし、真空を解放する。慎重に、ピンセットを使用してPDMSスラブとスライドガラスを取り出します。 </li><li>スライドガラスの上にPDMSスラブを（直面しているフェイスダウンの）チャンネル構造に直ちに置きます。軽くPDMSスラブを押してガラスに接着させます。すぐに脱イオン水でマイクロ流体チャネルを満たしてください。マイクロ流体デバイスの製造および組み立てが完了する。 </li></ol></li></ol> 2.マイクロ流体細胞の移動アッセイの準備<ol><li> マイクロ流体装置の準備。 <ol><li>ストックフィブロネクチン溶液（1 mg / mL）50μLを950に希釈して50μg/ mLのフィブロネクチン溶液を調製する81;バイオセーフティーキャビネット内のLダルベッコリン酸緩衝食塩水（DPBS）。 </li><li> Roswell Park Memorial Institute培地（RPMI-1640）9 mLとRPMI-1640 1 mLを4％ウシ血清アルブミン（BSA）と混合して遊走培地を調製する。 </li><li>装置から脱イオン水を除去する。 </li><li>フィブロネクチン溶液100μLをコンセントからデバイスに加えます。全てのチャンネルがフィブロネクチン溶液で満たされるように3分間待つ。カバーされたペトリ皿にマイクロ流体デバイスを室温で1時間置く。 </li><li>デバイスからフィブロネクチン溶液を除去する。出口から100μLの移動培地を加える。 3分間待って、すべてのチャンネルが移動媒体で満たされていることを確認します。 </li><li>デバイスを室温でさらに1時間インキュベートする。この装置は次に走化性実験の準備が整う。 </li></ol></li><li> ケモタキシス実験のための化学誘引物質溶液調製。 <ol><li> tで100nMのfMLP溶液を調製する。1mLの移動培地で培養した。ストック溶液FITC-デキストラン（10kDa、1mM）5μLをfMLP溶液と1.5mLチューブに混合する。 注：FITC-Dextranはグラジエント測定に使用されます。あるいは、グラジエントインジケータとしてRhodamineを使用してください。次いで、fMLP化学誘引物質溶液は、走化性実験のために準備される。 </li></ol></li><li> 喀痰試料の調製。 注：COPD患者の喀痰標本の勾配によって誘発された好中球走化性を、このオールオンチップ法の臨床診断用途として試験した。 <ol><li> COPD患者から喀痰サンプルを採取するためのヒト倫理プロトコールを取得する。 注：ウィニペグのセブンオークス総合病院（マニトバ大学認可）でサンプルを採取する承認を取得しました。 </li><li>すべての被験者から書面による同意書を入手する。 </li><li> COPD患者の自発的な喀痰検体を採取する。 500μLの喀痰サンプルを1.5mLのチューブに入れます。 </li><li> 500μLの0.1％ジチオトレイトールを1.5mLチューブに入れ、静かに混合する。チューブを37℃の水浴に15分間置きます。 </li><li>サンプルを753×gで10分間遠心分離し、上清を集める。上清を865×gで5分間遠心分離し、最終上清を集める。使用前に、回収した上清を-80℃冷凍庫に保存してください。 </li><li>走化性実験の準備ができたら、痰溶液を解凍する。 900μLの移動培地を1.5mLチューブに移し、バイオセーフティキャビネット内で100μLの痰溶液と混合する。次に、喀痰溶液は走化性実験の準備が整う。 </li></ol></li><li> 血液サンプル収集。 <ol><li>健康なドナーから血液サンプルを採取するための人間倫理プロトコールを取得する。すべての献血者から書面による同意書を入手する。 注：ここでのサンプルは、ウィニペグのヴィクトリア総合病院で得られたものである（マニトウ大学共同学術研究倫理委員会）。 </li><li>静脈穿刺により血液試料を採取し、EDTA被覆チューブに試料を入れる。実験の前にチューブをバイオセーフティキャビネットに保管してください。 </li></ol></li></ol> 3.オールオンチップ走化性アッセイ操作<ol><li> オンチップの細胞分離（ 図1B ）。 <ol><li>バイオセーフティキャビネット内の1.5 mLチューブに全血10μLを入れる。 注：血液サンプル採取の詳細はセクション2.4にある。 </li><li>好中球単離キット（材料の表を参照）から2 mLの抗体カクテル（Ab）と2μLの磁性粒子（MP）を1.5 mLチューブに添加し、穏やかに混合する。これは、好中球以外の血液中の細胞を標識する。 </li><li>血液-Ab-MP混合物を室温で5分間インキュベートする。 注：これは、血液中の抗体標識細胞を磁気的に標識する。 </li><li> 2つの小さな磁気ディスクをセルローディングpの両側に取り付けますデバイスのort。装置のすべてのポートから培地を吸引します。 </li><li> 2μLの血液-Ab-MP混合物を細胞装填口からマイクロ流体装置にゆっくりとピペットで移す。 注意：磁気標識された細胞は、細胞ローディングポートの側壁に捕捉され、一方、好中球は、デバイスに流入し、細胞ドッキング構造に捕捉される。 </li><li>十分な好中球が細胞ドッキング領域に閉じ込められるまで数分間待ちます。 </li></ol></li><li> 走化性アッセイ（ 図1C ）。 <ol><li>マイクロ流体装置を37℃の温度制御された顕微鏡ステージ上に置く。 </li><li> 2つのピペッターを使用して、100μLの化学誘引物質溶液（fMLPまたは痰溶液）および100μLの移動培地を指定の注入口リザーバーに加えます。これは、加圧によって補助される連続的な層流化学的混合によって、勾配チャネル中に化学誘引剤勾配を生成するバランス構造。 注：COPD患者の喀痰採集の詳細は2.3節に記載されている。 <ol><li>培地対照実験では、両方の入口リザーバに移動培地を加えるだけです。 </li></ol></li><li>勾配チャネル中のFITC-デキストランの蛍光画像を取得する。 </li><li>コマンド &quot;File | Open&quot;を使用してImageJソフトウェアにイメージをインポートします。 </li><li> &quot;Analyze | Plot Profile&quot;コマンドを使用して、グラジエントチャンネルの蛍光強度プロファイルを測定します。 </li><li>さらにプロットするために測定データをスプレッドシートにエクスポートします。 </li><li>温度制御された顕微鏡ステージまたは従来の細胞培養インキュベーターで15分間装置をインキュベートする。 </li><li>データ分析のために細胞の最終位置を記録するために10X対物レンズを用いてグラジエントチャネルをイメージ化する。 </li><li>必要に応じて、デバイス内の細胞移動を経時顕微鏡で記録します。 </li></ol></li></ol> 4.細胞移動Data分析（ 図1C ） <ol><li>下記のように、ドッキング構造からの細胞移動距離を計算することにより、走化性アッセイを分析する。 図1Cを参照のこと。 </li><li>イメージをNIH ImageJソフトウェアにインポートします（ver.1.45）。 </li><li>グラデーションチャンネルに移動した各セルの中心を選択します。 </li><li>選択したセルの座標を最終的な位置として測定します。ドッキング構造の端にある点の座標を初期基準位置として測定します。 </li><li>測定された座標データをスプレッドシートソフトウェア（Excelなど）にエクスポートします。セルの移動距離を、セルの最終位置と勾配方向に沿った初期基準位置との間の差として計算する。 </li><li>マイクロメーターまでの距離を較正する。走化性の尺度として全細胞の移動距離の平均および偏差を計算する。 </li><li> Migの比較スチューデントt検定を用いた培地対照実験に対する化学誘引物質勾配の存在下での非定量距離。 </li><li>細胞移動の時間経過画像が記録されている場合、細胞の移動および走化性を細胞追跡分析15によってさらに分析することができる。 注：オールオンチップ走化性アッセイを構築および実施するために必要な材料は、材料表に詳述されている。 </li></ol>

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開示する利益相反はありません。

この論文では、全血から好中球を直接単離した後、走化性試験を単一のマイクロ流体チップ上に直接行うための詳細なプロトコールが記載されている。このメソッドは、簡単な操作、高純度好中球のネガティブ選択、迅速なサンプルから結果の走化性試験、試薬とサンプルの使用量の削減、正確な細胞移動データ解析の有用な機能を提供します。大まかな見積もりとして、入力全血試料から?...

化学走性は、可溶性化学物質濃度勾配への細胞の移動の過程であり、免疫応答1,2,3 、組織発生4および癌転移5を含む多くの生物学的過程に決定的に関与する。好中球は最も豊富な白血球のサブセットであり、身体の本来の宿主防御機能を可能にし、適応免疫応答を媒介するのに重要な役割を果たす6,7 。好中球には、高度に制御された走化性機構が装備されており、これらの運動性免疫細胞は、病原体由来の化学誘引物質（ 例えば、 fMLP）および宿主由来の化学誘引物質（ 例えば、インターロイキン-8）好中球遊走および走化性は、様々な生理学的問題を媒介する炎症や癌などの疾患1,9。したがって、好中球走化性の正確な評価は、好中球の生物学および関連疾患を研究するための重要な機能的読出しを提供する。 広く使用されている従来の走化性アッセイ（ 例えば、トランスウェルアッセイ10 ）と比較して、マイクロ流体デバイスは、正確に制御された化学勾配の生成および小型化のために、細胞遊走および走化性の定量的評価に大きな期待を寄せている11,12,13 。過去20年の間に、様々な生物学的細胞型、特に好中球11の走化性を研究するために、様々なマイクロ流体装置が開発されてきた。時空間複合体における好中球遊走の特徴づけに多大な努力を注いだ<html>マイクロ流体デバイス14,15内に構成されたマイクログラディエントを含む。生物学的研究と並んで、マイクロ流体デバイスの応用は、疾患評価のために臨床試料を試験するために拡張されている17,18,19。しかしながら、多くのマイクロ流体デバイスの使用は、専門の研究室に限られており、大量の血液サンプルから長時間の好中球単離を必要とする。したがって、迅速な好中球走化性分析のための統合されたマイクロ流体デバイスを、一滴の全血から直接的に開発する傾向が高まっている（20,21,22,23 ）ef &quot;&gt; 23,24。 この方向に向かって、磁気陰性好中球精製とそれに続く走化性アッセイとを単一のマイクロ流体装置25に統合したオールオンチップ法が開発された。このオールオンチップ法は、1）接着に基づく細胞捕捉または細胞サイズに基づく濾過によって好中球を血液から単離する従来のオンチップ戦略とは対照的に、この新しい方法は、少量の全血からの好中球のオンチップ磁気分離、ならびに化学誘引物質刺激による走化性測定; 2）細胞ドッキング構造は、好中球の初期位置を化学勾配チャネルに近づけるのを助け、単一細胞追跡なしで簡単な走化性分析を可能にする。 3）好中球単離とケモトの統合単一のマイクロ流体デバイス上での軸解析により、実験ステップ間に中断がない場合、25分で迅速なサンプル - 結果の走化性分析が可能になる。 このペーパーでは、このオールオンチップ走化性アッセイの構築、操作およびデータ解析方法の詳細なプロトコールを提供します。この論文は、既知の組換え化学誘引物質および複雑な走化性試料を患者から試験し、続いてトラブルシューティングの戦略、限界および将来の方向性について議論することによって、好中球走化性を行うための開発された方法の有効な使用を実証する。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Device fabrication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum dessicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Digital scale</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 thinner</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 photoresist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Microchem</td><td>SU-8 developer</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>Silicon, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane&lt;br/&gt; (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Cutting pad</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>Punchers</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Source&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;On-chip cell isolation and chemotaxis assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&lt;br/&gt; (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>VWR</td><td>CACB356008</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic disks</td><td>Indigo Instruments</td><td>44202-1</td><td>5 mm in diameter,&lt;br/&gt; 1 mm thick</td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa stain solution</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Direct Human&lt;br/&gt; Neutrophil Isolation&lt;br/&gt; Kit</td><td>STEMCELL&lt;br/&gt; Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope environmental chamber.</td><td>InVivo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

an all-on-chip method for rapid neutrophil chemotaxis analysis directly from a drop of blood

好中球の移動と走化性は私たちの体の免疫系にとって重要です。マイクロ流体デバイスは、リアルタイムビジュアライゼーション、化学濃度勾配生成の正確な制御、および試薬およびサンプル消費の低減におけるそれらの利点のために、好中球移動および走化性を調べるためにますます使用されている。近年、全血から直接的に、統合された、容易に操作される微小流体走化性分析システムを開発するために、マイクロ流体研究者によってますます努力がなされている。この方向では、最初のオールオンチップ法が、好中球の磁気陰性浄化と小血液量試料からの走化性アッセイとを統合するために開発された。この新しい方法は、25分で迅速なサンプル - 結果好中球走化性試験を可能にする。本稿では、このオールオンチップ走化性アッセイの詳細な構築、操作、およびデータ分析方法について、トラブルシューティング戦略、limi将来の方向性を示しています。この全オンチップ法を用いて、定義された化学誘引物質、 N-ホルミル-Met-Leu-Phe（fMLP）および慢性閉塞性肺疾患（COPD）患者からの痰を試験する好中球走化性アッセイの代表的結果を示す。この方法は、多くの細胞移動関連の調査および臨床応用に適用可能である。

好中球は、マイクロ流体デバイス内の直接の一滴の全血から陰性に選択される。単離された好中球の純度は、Giemsa染色で確認され、その結果は、好中球の典型的なリング形状およびローブ形状の核を示した（ 図2A ）。これは、少量の全血から高純度で効果的なオンチップ好中球単離を示す。さらに、ドッキング構造は、化学勾配（ <strong class="xf...

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An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

an-all-on-chip-method-for-rapid-neutrophil-chemotaxis-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K ビュー.  Chinese Academy of Sciences. この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。 

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A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

生物工学

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

免疫・感染学

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

ヒト好中球におけるβ2インテグリン活性化阻害剤のスクリーニング

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

著者スポットライト:β2インテグリン活性化の低分子アンタゴニストを同定する方法の開発 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

要約

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単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

定量的な

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウスリンパ球の定量化

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

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未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

定量的な

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウスリンパ球の定量化