作者は感謝して特注の圧力制御システムの構築のために原稿の校正のためのトム·ロビンソン、C.BärtschiおよびH.ベンツを認める。我々はまた、両方のスイス連邦工科大学チューリッヒ、クリーンルーム施設FIRST光学顕微鏡センター（LMC）の使用を承認したいと思います。作業は第7次フレームワークプログラム（ERCの開始グラント、プロジェクト番号203428、nμLIPIDs）の下でメルクセローノと欧州研究会議（ERC）によって賄われていた。

1。 SU-8マスター作製以下のプロトコルが異なるマスクパターンで（回路図や寸法は、図2を参照してください、流体および制御）チャネルの両方のマスター金型を準備します。プロセスは、 図3aに示されている。 <ol><li> 180℃で10分間、4インチのシリコンウェハを加熱することによって開始するスピンコーター上で脱水ウェハをロードし、スピンコート法、SU-8 2015年に次のプロトコルを使用します。 <ol><li> （分注の後、このステップ、開閉蓋の間にSU-8を分配、スピンコーターのオープン蓋）20秒間100rpmでウエハを回転。 </li><li> 10秒500でスピンウエハ（これはウエハ全体上にレジストを広がっていく）。 </li><li> 30秒間、1,750 rpmでスピンウエハ（20ミクロンにレジストの高さを定義します）。 </li></ol></li><li>これがそうでない場合、次の手順でホットプレートに固執するようにアセトン（綿棒を使用）と、ウエハのエッジからレジストを除去。ああにウエハを搬送4分間95℃、熱でotplate。ソフトベーク後に、（365nmで測定された150ミリジュール/ cm 2で）UV光でマスクアライナにおいてソーダ石灰ガラスをテーピングするフォトマスクを介してレジストを露光する。 </li><li>露光後、ホットプレート上で95℃で5分間再度ウェハを加熱する。 RTにウェーハを冷却した後、4分間のSU-8現像液のお風呂にそれを浸す。未露光SU-8を削除するにはやさしく振る。クリーンルームグレードのイソプロパノールでウェーハを洗浄し、窒素でブロー乾燥。開発は（特に細胞トラップ）成功した​​場合、顕微鏡下で確認してください。細胞トラップが完全に開発されている場合は、シリコンウェハの反射が見えるはずです。必要に応じて、数分間、再びウェハを開発しています。 </li><li>全ての残留溶媒を除去し、180℃で2時間、オーブン内でウェハを焼く。ステッププロファイラを有するチャネルの高さを確認してください。高さが所望の高さと異なる場合は、新たなウェハとステップ1.1から始めて、このプロトコルを繰り返し、スピン速度（ステップ1.1.3）を変更。 1H、1H、2H、一晩デシケーター内2H-パーフルオロ-ジメチルクロロシランとのウェハをシラン化によってマスター型の製作を最終決定。 </li></ol> 2。マイクロコンタクトプリント用のマスター作製<ol><li>マイクロコンタクトプリンティングのためのマスターモールドを製造するために、180℃で10分間、シリコンウェハを脱水（レジストシラン化表面に良く付着）30秒間、7,500 rpmで、このウェハ上に1ミリリットルのHDMSをコートにスピン。 AZ1518のスピンコート2ミリリットルを正、このプロトコルのレジスト： <ol><li>ウェハに上のレジストの静的注する。 </li><li> 500 rpmで5秒間ウェハを回転。 </li><li> 4000 rpmで60秒間ウェハを回転。 </li></ol></li><li>ホットプレート上で100℃で50秒間ソフトベークした後、フォトマスクを介して、マスクアライナ上にUV光（21ミリジュール/ 365 nmでのcm 2）のレジストを露光する。 75秒間AZ 726の浴槽にレジストを開発しています。 DI水とブローdで開発されたウェーハをリンス窒素でRY。 50秒間115℃でウェハを加熱して残留溶媒を除去。真空下で一晩ウェハSilanize。 </li></ol> 3。マイクロ流体チップの作製二層デバイスの設計は、これらの実験のために使用される。チップは最終的にガラススライド（ 図3b）上に接合される前に、二つの層は、別々に調製され、接合されている。このステップは、PDMS層の製造およびマイクロコンタクトプリント用PDMSスタンプを説明しています。 <ol><li> 10時01 PDMSの混合物と硬化剤を準備します。 （私たちのデザインを使用して、これは10チップになります）、合計で約80グラムのPDMSを準備します。積極的に両方の部分を混合し、混合物は、バブルフリー（〜30分）になるまで、PDMSを脱ガス。 </li><li>シャーレとテープそれを底部に内部の制御層ウエハを配置します。次に、上にPDMSの約50グラム入れて完全な保証するために80℃のオーブンで少なくとも2時間、ウェハを置くPDMSの硬化。この〜20グラムのPDMSが必要なため、マイクロコンタクトプリント用ウエハに対して同じ手順を繰り返します。 </li><li>スピンコートウェーハ上にPDMSを2000回転の回転速度で流体層と約40μmの高PDMS層を形成した。 80℃で少なくとも1時間オーブンにPDMSを治す</li><li>両方の部分が硬化されると、ウエハから制御層を除去し、カミソリの刃を有する小片に切断した。 1mmの生検パンチャーを用いて圧力接続穴パンチ。ストレージのためには、チャネルを介してテープ片を置くことをお勧めします。 </li><li>二つの層を接合するには、スピンコートされたウェハおよび上部を取り、プラズマクリーナー23に配置します。プラズマ処理後、速や​​かに大きな作動距離を有する顕微鏡下で両方の部品を整列させる。設置されたトップ部分の周りにいくつかの予備のPDMSを追加します。このステップは、しかし、それは、ウェハからPDMSの除去を容易に、必須ではありません。少なくとも1時間80℃のオーブン中にウェハを置き。 </li><li>慎重にウェハからPDMSを除去し、マイクロチップをカットするメスを使用してください。 1.5ミリメートル生検パンチャーと流体接続のためのアクセスホールパンチ。 </li><li> PDMSチップは完了し、ヶ月間保存することができる。オプション：チップ貯水池で使用されている場合は、200μlのピペットチップの上部をカットし、その上に、それを接着するためにいくつかの予備、半硬化PDMSを使用しています。少なくとも1時間、80℃で再びオーブンにチップを置きます。 </li></ol> 4。スライドガラスに接着直接酵素アッセイ用のデバイスを使用するには、接合後に必要な唯一のステップでは、表面のブロックしています。このプロトコルでは、イムノアッセイまたはELISAのためのマイクロ流体チップを使用するように、しかしAに進み、唯一の（ つまり全反射顕微鏡またはSPR用）ガラススライドに結合部位を制限するプロトコルBを参照してください。この制限が重要でない場合は、Aを参照してください。ただし、手順4.3でビオチン化複合体を使用し、ステップ4.8に進んでプロトコルBで完全に機能面を作成します。 プロトコルAとBを実行する前に：それはチップにそれらを導入する前に使用したタンパク質のソリューションのすべてをフィルタリングすることをお勧めします。デブリおよびタンパク質凝集体は、そうでなければ、それによって分析のために使用することができるチャンバの数を減少させる、細胞トラップをブロックすることができる。この目的のために、チャネルにそれらを導入する前にすべてのソリューションをフィルタリングする非タンパク質吸着フィルターユニットを使用する。 プロトコルA（酵素アッセイ） <ol><li>マイクロ流体デバイスを完成させるために、スライドガラス上にPDMS部分を接着。これを行うには、まず、石鹸、蒸留水とエタノールでガラススライドを清掃してください。窒素気流を用いてスライドを乾燥させる。スコッチテープでのPDMS部分を清掃してください。 </li><li> PDMS部分と洗浄されたガラススライドはタイトな結合を保証するために18 W.にて45秒間、プラズマクリーナーに入れ、5分間、ホットプレート（100°C）上のチップを置く。 </li><li>接合後、F、チップを埋めるLUIDは。これを達成する簡単な方法は、遠心力を使用することである。 200μlのピペットチップの下の部分をカットします。流体チャネルは、ブロッキング溶液でそれらを埋める（ウシ血清アルブミン（4％w / v）の、またはポリ-L-リジン）グラフト化ポリエチレングリコール（0.05％w / v）のおよび入口に先端を配置する。のいずれかで、水または等張液、 例えば PBSで制御層入口を埋める。 5分間遠心（800×g）でにチップを置きます。チャンネルは、現在は完全に流体を充填する必要があります。いない場合は、この手順を繰り返します。 </li><li>室温で少なくとも30分間ブロッキング溶液をインキュベートする。シリンジポンプを用いて10μL/分の流速でPBSで流体層の外溶液を洗浄する。デバイスは現在、細胞実験の準備ができています。 </li></ol>プロトコルB（イムノアッセイ） 以降のステップ4.7からの表面改質の完全な概要については、 表1を参照してください。 <ol start="5"><li>でBBSA / BSA溶液（ 例えば 1-100）とマイクロコンタクトプリント用cubate PDMSスタンプ。 30分後、蒸留水で十分にスタンプをきれいにし、窒素気流下でスタンプを乾燥させる。すぐに洗浄したガラススライドさせます（ 図4）にスタンプを配置します。 </li><li>プラズマクリーナーの最大電力で45秒（18 W）の酸素プラズマにマイクロ流体チップの上の部分と一緒にスタンプをガラススライドを公開します。プラズマ処理後、スタンプを削除して、デバイスのマイクロチャンバーの下に印刷面を合わせます。 50℃のホットプレート上で30分間チップを配置</li><li>残りの表面をブロックするには、遠心分離器を有するチップに滅菌ろ過したBSA溶液（4％（w / v）のPBS中）（ステップ4.2を参照）を導入。 1時間インキュベートし、PBSで流体層（ステップ4.3参照）から解決策を洗う。チップは、次いで、湿ったボックス内に4℃で直接使用するか、最大2週間保存することができる。 </li><li>完全に機能的結合surfac用電子、リザーバ内アビジン（0.025％（w / v）のPBS中）を導入する。流体チャネルを介してアビジン溶液を引き出すために、30分間に5μl/分の流速を使用する。その後、10分間、PBSをフラッシュします。徹底的に貯水池をすすぐ。 </li><li>その後、プロテインG（0.0025％（w / v）のPBS）で、さらに30分間のフラッシュを追加する。その後さらに10分間PBSで洗浄します。次に、10分間、目的の抗体（0.0001％（w / v）のPBS中）を添加する。 10分後、結合を可能にする15分間の流れを止める。次に、10分間、PBSで洗浄する。 </li></ol> 5。細胞実験プロトコルは、可能性があるため、種々のアッセイの一般的な用語で書かれています。一例としてG6PDH毒性アッセイに必要な試薬が挙げられる。デバイスの初期細胞捕捉効率、 すなわち 200個の細胞のう ​​ち5がトラップされ、約2.5％です。細胞トラップの最終的な占有率が強く使用される細胞株、サスペンドするプロトコルに依存し細胞株および細胞がチャネルを通ってフラッシュされる時間。天然に（例えば、U937など）、懸濁液中で増殖する細胞は、単一細胞は、数分後にチャンバの約75％において見出され得る。他の室のいずれかを充填し、2種類以上のセルによって占有されていない。一般に、単一のセル占有率は、接着細胞株についても小さい。ここに提示むしろ軽度の懸濁化プロトコルを使用する場合、割合は約30％（HEK、MLT細胞）に減少する。単一セルの占有率は、細胞のトリプシン処理によって改善することができるが、これはまた、実験の結果を変化させることができる。 標的分子に依存して、PDMSへの吸着または吸収が結果に影響を与えることができる。吸着は、BSA又はPLL-gの-PEGで表面を遮断することによって低減することができる。吸収はほとんどの親水性生体分子のための可能性は低いですが、それは（小）親油性の細胞成分を確認する必要があります。 <ol><li>特定のプロトコルに従って細胞を調製（ 例えば </EM&gt;薬剤添加）。浮遊細胞の場合は、チップを直接セルを追加。接着細胞株については、細胞懸濁液を生成するための酵素を含まない解離緩衝液を使用する。細胞クラスターの量を減らすために、チップにそれらを導入する前に細胞を絞り込む。 </li><li>シリンジポンプと順方向の流れを使用してチップ上に細胞をロードするのではなく、細胞懸濁液を撤回する。チャネル壁上への細胞の非特異的付着を低減するため、接着剤の懸濁細胞株および10〜20μlの/分の高い流量のために5μl/分の流速を使用する。 </li><li>トラップが満たされると、チャンバーを閉じます。多くの細胞が表面に非特異的に付着すると、10から30μL/分の流速で細胞解離緩衝液でそれらを洗い流すようにしてください。 </li></ol>プロトコルA（酵素アッセイ） <ol start="4"><li>チップを通して溶解バッファーを撤回。この例では、この緩衝液を加えツイーン20（10mMトリス-HCl、10と低浸透圧緩衝液であるのKCl、1.5mMのMgCl 2、1％（v / v）のツイーン20）。溶解のための、すぐに開いたり閉じ室（10〜50μL/分7,21の流量のためのすなわち 500ミリ秒）。 G6PDHアッセイのために、2mMのグルコース-6 - リン酸、0.5mMのNADP、0.5 U / mlのジアホラーゼ、溶解緩衝液に0.3mMのレサズリンを加える。すぐに溶解後、運動反応の監視を開始。 </li></ol> 注意 ：アッセイに適した任意のバッファを選択して、（トリトン、SDSのような）強い洗剤を溶解する細胞は直ちに室開口時の分析物の損失につながることを念頭に置いたが、裸。 プロトコルB（イムノアッセイ） ELISA細胞実験（流量、チャンバー状態など ）の簡単な説明については、 表1を参照してください。 <ol start="5"><li> ELISAのために、直接溶解バッファーに必要な検出試薬（ 例えば二次抗体、標識抗原）を追加します。ここには、気取っを追加しましたN 20は、非特異的吸着を低減します。ステップ5.4に従った細胞を溶解。 （使用される抗原および抗体に応じてインキュベーション時間）に結合できるように、10〜15分間混合物をインキュベートする。 </li><li>チャンネル壁に非特異的に吸着した抗体酵素複合体は、リザーバおよびチャネル内部で既に検出試薬の転換につながることができます。この吸着による問題を低減するために、（チャンバは検出試薬を添加する前に、閉じた状態）インキュベーション時間の間、チップに使用される検出酵素の永久的な阻害剤を洗い流す。 HRPの、永続的に非特異的に吸着した酵素を不活性化するために、水に20 mMの塩酸を使用しています。 </li><li>インキュベーション時間の後、チップへの検出試薬（ 例えば、アンプレックスレッドとHRPのための過酸化水素）を導入する。離れて非結合二次抗体を洗浄するためにすぐにもう一度室を開き、検出試薬を追加する。すぐに運動反応の監視を開始。 </li><li>キャリブレーション：固定化し目的の標的に対する抗体。閉じる室。バッファ内またはオフチップ細胞溶解液中の分析物の異なる濃度を準備します。チップに濃度を適用し、迅速室（開放時間500ミリ秒）内の容積を交換します。この開放時間は、追加の蓄積が検体フラッシングから発生せず、マイクロチャンバーの容積からの分子の特定の数が検出されることを保証するのに十分に短い。ソリューション内部の抗原の既知濃度と室の容量（625 PL）から、室内に金額を計算します。その後、ステップ5.5を続行し、検出部分を紹介します。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

マイクロフルイディクス技術は、単一細胞分析のための新しい魅力的な可能性を開いた。具体的には、トラップする可能性と、マイクロ流体ツールで個別に細胞を固定は、単一セルのプロパティと対応に関する体系的な短期的および長期的な研究を可能にした。また、マイクロチップ上に発生した高周波微小液滴、中の細胞のカプセル化は、従来のフローサイトメトリー装置を用いて実施す?...

過去の多くの研究は、特定のシグナル伝達プロセス4、またはこのようなタンパク質は、5,6、代謝産物、および補因子7,8のような細胞内の生体分子の量で、大きな細胞集団1-3内の細胞間の差異を明らかにした。これらの不均一性は、細胞適応と進化9根本的に重要であるが、また、例えば10-13癌などの疾患の出現および治療 ​​に重要な役割を果たすと考えられている。したがって、単一細胞レベルでの研究は、これらの研究は、生物活性化学物質を用いた治療後の異なる細胞応答を明らかにする場合は特に、生物学的および薬理学的研究において高い関心が持たれている。 近年では、多くの分析プラットフォームは、単一の生細胞の分析または細胞内容物の化学組成を容易に開発されている。蛍光活性化細胞選別（FACS）がゴールドSTですがandard単一の生細胞の非常にハイスループット分析のために、この方法は、細胞内または分泌された化合物の定量に用いることができない。マイクロ流体プラットフォームの出現は、単セルの配置、治療および観察のための新規な分析的な戦略を約束した。マイクロ流体中のマイルストーンはクエイクや同僚14,15によって実現フレキシブルなPDMSバルブの統合に達した。これらのバルブは、彼らは例えば、二つの文化16を分離、チップ上の領域を分離することができるので便利です。さらに、それらは、単一細胞解析に特に適用可能であり、したがって、検体の希釈の問題を低減するのに役立つ。単一細胞分析のためのこのアプローチの電力は、最近ハンセンと平行な17の単一の細胞から数百の遺伝子発現を分析した共同研究者によって実証されている。 タンパク質および代謝産物を標的とする場合、分析は、適切なαの欠如のために非常に困難であるmplification方法、様々な本発明の化合物、および化学的性質におけるそのバリエーション多数。さらに、ほとんどの細胞内生体分子は、従って使用される分析方法は、高い感度を持っている必要があり、数千、数10 18のために、低コピー数で存在することが予想される。そのようなイムノアッセイおよび酵素結合免疫測定法（ELISA）のようなより強力なアッセイは、それらがいくつかの洗浄およびインキュベーション工程、ならびに表面固定化を必要とするため、マイクロ流体デバイスに統合することが困難である。 これらの課題に起因し、それは、タンパク質または代謝産物が単一細胞レベルで定量したところ、わずか数例が報告されていることは驚くべきことではない。例えば、蛍光化合物の分泌の研究は19,20が報告されている。近年、ELISAによる実装は、細胞培養物から分泌された（非蛍光）、タンパク質（THP-1細胞）の分析21と、単一の（iについて提示されたmmune）細胞10。細胞内タンパク質を標的とする、市らは、イムノアッセイ11によって腫瘍細胞におけるシグナル伝達経路の解析のための細胞内タンパク質の同定を容易にするマイクロ流体デバイスを開発した。しかし、タンパク質の相対量のみを測定し、まだ酵素的増幅は、低存在量タンパク質に対するシグナルを増加させるために使用されなかった。 最近では、蛍光アッセイ8とイムノアッセイ22（ 図1）とのシングルセルトラップマイクロデバイスを結合することができました。細胞を受動的に供給し、細胞のあらゆる動きのない媒体および他の化学物質の（急速）の交換を可能にするマイクロサイズハードル構造にトラップされる。各トラップの周囲にリング状の弁は、非常に少量（「マイクロチャンバー」）で、細胞を単離することができます。この弁は、彼、細胞溶解（低浸透圧）のバッファを導入した直後に作動するNCE離れて拡散する細胞内分子または分泌される分子を防止することができる。最も重要なことに起因する体積（plの625）のサイズが小さい分子の大きな希釈が回避される。溶解および分析は、チップの同じ位置で行われるので、輸送に起因する分析物の損失はない。ここに記載のチップ設計は、60マイクロチャンバー合計7または8のいずれかのマイクロチャンバ8の交互の行を含む。線に沿った相互汚染が排除されるように、チャンバは、列に作動される。 プラットフォームは、蛍光アッセイ、ならびに免疫学的ア ​​ッセイ（ 図1d）と組み合わせて使用することができる。後者に関しては、チップ製造および組立工程と適合性である抗体の固定化のためのプロトコルを確立した。したがって、プラットフォームは、単一細胞レベルで、信頼性の高い感受性および定量化アッセイのための道を開く。これまで、我々は、iの分析のために装置を使用しているntracellularと分泌される酵素（酵素アッセイによる相対定量化）、細胞内の補因子、タンパク質と小分子（エンドポイントアッセイやELISAによる絶対定量）。以下では、マイクロコンタクト·プリンティングおよび界面化学を用いて多層ソフトリソグラフィーおよび抗体のパターニングのためのプロトコルを用いて、チップ製造プロセスを説明。さらに、チップの使用および操作のいくつかの例が示されている。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name of the Reagent</td><td>Company</td><td>Catalogue Number</td><td>Comments (optional)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane</td><td>ABCR (Karlsruhe, Germany)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &amp;beta;-D-N,N&amp;prime;-diacetylchitobioside hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>AZ 726 developer</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin, biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation buffer</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR developer 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG grafted</td><td>SuSoS, (D&amp;uuml;bendorf, Switzerland)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG grafted biotin</td><td>SuSoS, (D&amp;uuml;bendorf, Switzerland)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Protein G, biotin</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Si-Mat (Kaufering, Germany)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Biorad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material Name</td><td>Company</td><td>Catalogue Number</td><td>Comments (optional)</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m PES syringe filter</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1.5 mm biopsy puncher</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics filter 20 &amp;micro;m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>MA-6 mask aligner</td><td>Karl Suess</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Multizoom AZ100M microscope</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>Microlitho, Essex, U.K.</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Spin Modules SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Step profiler Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

a microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells

私たちは、並行して複数の単一細胞における細胞内の生体分子の測定を可能とマイクロ流体デバイスを提供する。この目的のために、細胞を、受動的にマイクロチャンバーの中央に閉じ込められている。制御層の活性化の際に、細胞は、小さなチャンバ内の周囲の容積から隔離される。周囲の容積は、次いで、単離された細胞に影響を与えることなく交換することができる。しかしながら、チャンバの短い開閉時に、チャンバー内の溶液が数百ミリ秒以内に交換することができる。によるチャンバの可逆性のために、細胞は、インキュベーション、洗浄、そして最後に、細胞溶解のために、例えば、高度に制御可能な様式で異なる溶液を順次に露光することができる。密閉マイクロチャンバは、細胞溶解後の希釈を最小限にし、制御し、溶解物の保持を可能にする。溶解および分析は、同じ場所で発生しているため、高感度が、それ以上のDので保持されている分析物のilutionまたは損失は、輸送中に発生します。マイクロチャンバーの設計は、したがって、個々の細胞から放出され、細胞内の分子の非常に小さなコピー数（アトモル、ゼプトモル）の信頼性と再現性の分析を可能にします。さらに、多くのマイクロチャンバは、適切な光学機器を監視するために使用されることを考えると、一度に多くの細胞の分析を可能にするアレイ形式に配置することができる。我々はすでに、細胞内タンパク質、酵素、補因子および相対または絶対定量化可能な方法で、セカンドメッセンジャーを分析するための概念実証研究のためのプラットフォームを使用しています。

当社のプラットフォームは、細胞内の様々なだけでなく、中に存在するか、単一の細胞によって産生され分泌される分子を分析することができます。ここで、我々は可能な様々なアッセイを強調するために、異なる例の研究を紹介したいと思います。我々は、分泌酵素（ 図5a）だけでなく、細胞内の酵素（ 図5b）とタンパク質（ 図5CおよびD）</stron...

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A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K ビュー.  ETH Zurich, Switzerland. この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。 

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Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

がん研究

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

生物工学

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

化学合成時間分解機構の研究のためのMillifluidics

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

ICPMSサンプル導入のためのマイクロ流体チップ

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

要約

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この動画の章

アドレス指定可能な液滴マイクロアレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

化学合成時間分解機構の研究のためのMillifluidics

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

ICPMSサンプル導入のためのマイクロ流体チップ

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

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アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

化学合成時間分解機構の研究のためのMillifluidics

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

ICPMSサンプル導入のためのマイクロ流体チップ

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

アドレス指定可能な液滴マイクロアレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント