Name: using in vitro live-cell imaging to explore chemotherapeutics delivered by lipid-based nanoparticles
Uploaded: 2017-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
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エラスムス光イメージング センターの一部である使用される顕微鏡施設とそのサービスの OIC のスタッフに感謝したいと思います。

1 準備 <ol><li>イメージングの商工会議所、2 つの部分から成っている組み立て。。
	<ol><li>場所商工会議所 ( 図 1 a-2) の下の部分と下の部分 ( 図 1 a-3) にネジ上部に 25 mm カバー ガラス ( 図 1 a-1)。ガラスを破ることができるとはあまりにもハードに締めてないです。オートクレーブ全体の部屋 ( 図 1 a-4).</li>
	</ol></li> <li>ダルベッコを補うことで細胞培養培地を準備 &#39; s 修正イーグル &#39; s 媒体 (DMEM) フェノール レッド 10% 熱不活化牛胎児血清 (FCS) と 1 ミリメートル L グルタミン無菌条件下でなし。4 ° C で使用する前に 37 ° c の暖かい店</li>。
	<li>は、標準的な細胞培養の技術を用いたフラスコ培養で細胞培養培地で細胞を維持します 。
	注: ここでは、2 つのマウス細胞株、メラノーマ B16BL6 11 ルイス肺癌 (LLC)、および 2 つのひと黒色腫、BLM 1F6 12、使用されたします</li>。
	<li>、計量し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 37 ° C でにゼラチンを溶解する 0.1% ゼラチンは一晩します。0.22 μ m のフィルターを通してフィルタ リング ソリューションを殺菌し、4 で保存 ° C</li>
</ol> 2。細胞をプレート <ol><li>キャビネット流で滅菌袋からイメージング室を削除慎重にチャンバーを強化し、ペトリ皿に配置します 。
	: 汚染を防止する注意イメージング室ペトリ皿で顕微鏡下でチャンバーを配置ことができますまで</li>。
	<li>コート 1 ml 0.1 %37 ° C、5% CO 2 で 20 分間滅菌ゼラチンのイメージング室のガラスします 。
	注: これは良い細胞接着になります</li>。
	(1.2 と 1.3 の手順を参照してください) 細胞培養フラスコからメディアを取り外し、1x PBS で 1 回洗浄 0.25% トリプシンを使用してセルを外し、<li>。細胞培養液を追加してトリプシンを不活化、細胞を収集、5 分 1,100 x g でそれらをスピンダウンおよび細胞培養液 5 mL にペレットを再懸濁します</li>。
	トリパン ブルー (これは死んだ細胞に取り込まれるが) の 20 細胞懸濁液の希釈 20 μ <li>μ L。診断; 生活と死んでいるセルの数をカウントします。死んだ細胞の数は 10% を超えないようにしてください。</li>。
	<li>は、ゼラチンを吸引し、24 h 以内 70% のカバレッジの最大希釈で細胞をプレートします。たとえば、5 x 10 の 4 または 1 mL の 10 x 10 の 4 セルの希薄を使用します。5% CO 2 と 24 時間の 37 ° C で接着細胞を許可</li>
</ol> 3。微速度顕微鏡観察 ( 図 2) 注: ここでは、オーダーメイド ステージ ホルダーと共焦点顕微鏡、生細胞イメージングのためのインキュベーターの範囲を提供するほとんど製造していますが使用されました。nanoparticulated ドラッグデリバリーを調べるにも適しています。
<ol><li>密度、細胞形態、汚染に顕微鏡下で細胞を評価します。CO 2 インキュベーターにチャンバーを配置します 。
	注: 密度が 70% を超えない。細胞の形態は、一貫性のない (すなわち 細胞が付着しない) かどうか、または汚染が検出されると、イメージングの商工会議所を破棄します</li>。
	<li>蛍光灯 ( 図 1E-2) とコンピューター ( 図 1E-3) 共焦点顕微鏡 ( 図 1E-1) を切り替えます</li>。
	<li>レンズ ヒーターを目的に接続し、35 ° C ( 図 1E-4 + 挿入物) に設定します</li>。
	 図 1 b に示すように、<li>はインキュベーション ユニットを準備します 。
	注: このユニットで構成されています加熱ステージ ( 図 1 b-1) 流期 CO 2 管 ( 図 1 b-2) コネクタと CO 2 のプローブ ( 図 1 b-3)、および赤い終了パッチ ( 図 1B-4)。一時的に部屋が配置されるまでユニットを閉じるにこの修正プログラムを使用します</li>。
	<li>は、顕微鏡ステージ上にインキュベーション ユニットを配置で- とアウト-flow CO 2 管 ( 図 1E-5) を接続します。主な CO 2 バルブ ( 図 1E-6) を開き、CO 2 コント ローラー ( 図 1E-7) に切り替えます。コント ローラーが 5% CO 2 に設定されていることを確認します 。
	注: 湿度、CO 2 は加湿器 ( 図 1E-8) を通過します。低酸素症実験別 O 2 レギュレータ ( 図 1E-9) セットアップに含まれています</li>。
	<li>は、ステージ温度を 37 ° C ( 図 1E-10) に設定します。温熱実験設定温度 42 ° c. 許可する選択した温度と CO 2 の割合に到達するインキュベーション ユニット</li>。
	<li>2 インキュベーターの主な CO からイメージング室を取り出して、顕微鏡の部屋にシャーレに商工会議所を輸送します</li>。
	<li>カスタムメイドにイメージング室 ( 図 1 a-4) を配置して、35 mm 直径 ( 1 a を図-5) ホルダーをステージし特注シールふた付け室を閉じる (図 1A-6). 
	注: ふたを CO 2 を渡すことができ、蒸発や汚染を防ぎます。
	<ol><li>インキュベーション ユニット、赤のパッチを置き換えるイメージング室開閉ユニット ( 図 1)。セルの冷却を防ぐためにできるだけ早くこれを行います。ステージと顕微鏡の間立ち往生しているケーブルがないことを確認します</li>。
	</ol></li> <li>30 分慣らすユニットを残す</li>
	<li>ソフトウェアを開き、レーザーに切り替える 。
	注: ここでは、488 nm のアルゴン、543 nm ヘリウム-ネオン、633 nm ヘリウム-ネオン レーザーを用いています</li>。
	<li>をクリックして新しいデータベースを作成 &#34; 新しい &#34; ファイル タブの名前の下で、データベース保存します</li>。
	<li>をクリックして構成の設定 &#34; 設定 &#34; 取得タブの選択の下で &#34; ・ チャネル ・ モード &#34; と &#34; 単線 &#34; 一分子蛍光を評価するまたは &#34; マルチ トラック &#34; fluorophores が付いていくつかの。蛍光体 (dox と Dox NP など 560 に 615 nm バンドパス フィルター; 参照例について代表結果) と一致する適切な帯域通過フィルターを選択します。トラックの 1 つで明るいフィールド チャンネルを選択します</li>。
	スキャン設定をクリックして <li>&#34; スキャン &#34; 取得タブ セット フレーム サイズ (1,024 × 1,024)、スキャン速度 (最適) の下でスキャン方向 (8 ビット、シングル)、およびクリックして平均 (4) をスキャン &#34; モード &#34; ピンホール (200 μ m) を設定、ゲインおよびオフセット (例えば 580、700、および 835; 図 3 を参照) とレーザーの力 (488 = 10 543 = 100% 633% = 100%) をクリックして &#34; チャンネル &#34;</li> <li>をクリックしてこれらの設定を保存 &#34; 設定 &#34; タブ構成で、構成データベースに保存。</li>。
	<li>をクリックして、時間経過を設定 &#34; マルチ時間 X &#34; ( 図 1) [マクロ] タブをクリックして &#34; の場所をシングル &#34;.</li>
	フォーカスの細胞を維持する <li>マクロでクリックして自動フォーカスを選択する &#34; 自動フォーカス &#34; 。
	注: オート フォーカス633 nm レーザーを基準点として、ガラスの反射を使用して実現します</li>。
	<li>をクリックして保存した構成を適用 &#34; 単線 &#34; または &#34; マルチ トラック &#34; スキャン (例えば 97) の数 (例えば、15 分)、時間の間隔を設定、構成データベースで必要な構成するスクロールとクリックすると &#34; 負荷設定します &#34; 注: これらの設定を使用して、97 × 15 分 = 24 h の時間シリーズが行われる。</li>。
	<li>名前でコマ撮り、&#34; ベース ファイル名 &#34; (ステップ 3.11 製) データベースをクリックして選択、&#34; イメージ データ ベース &#34; コマ撮りを保存します。クリックして一時フォルダーを設定 &#34; フォルダー Tmp イメージ &#34; 注: 画像がこのフォルダーにある場合は、システムが停止または何らかの理由でクラッシュ、。</li>。
	<li>インキュベーターのユニット、イメージングのリングを持ち上げて、客観的にイマージョン オイルのドロップを追加開閉ユニットに、できるだけ早く。集中し、イメージングの商工会議所で位置を選択します 。
	注: この位置には 70% の confluency、個々 の細胞のイメージングを可能にする最小の単分子膜の細胞が含まれています</li>。
	<li>背景の設定を確認し、必要に応じて修正します 。
	注: バック グラウンドは、利得やレーザーの力を減らすことによって修正できます。構成の変更 (手順 3.17 参照) を保存する必要があり、(手順 3.18 参照) 読み込まれたマクロで再度です</li>。
	<li>キャビネット流で無料医薬品または濃度 5 μ G/ml 薬物を細胞培養液中の脂質 0.05 µmol ナノ粒子を希釈します。薬/ナノ粒子が滅菌されない場合 0.22 μ m シリンジ フィルターをフィルター処理します</li>。
	<li>インキュベーターのチャンバーを開き、シール蓋を持ち上げて、セルからメディアを取り出して、希釈薬/ナノ粒子の 1 つの mL を追加し、できるだけ早くユニットを閉じる</li>。
	<li>をクリックしてセルとスタート、時間経過に焦点を当てる &#34; 開始時刻 &#34; マルチ時間 X マクロで</li>。
	<li>セルをフォーカスはまだ、またはオート フォーカス (3.16 の手順を参照してください) を使用してかどうかを定期的に確認します。プログラムが自動的にデータベースにコマ撮り保存します。プログラムの実行中は、データベースを閉じないで</li>。
</ol> 4。データ分析 <ol><li>元の研究の質問に応じてデータ分析の ImageJ などのソフトウェア プログラムを使用して、(例の 結果 を参照してください).</li></ol>

<ol>
	<li>Duggan, S. T., Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+liposomal+doxorubicin:+a+review+of+its+use+in+metastatic+breast+cancer,+ovarian+cancer,+multiple+myeloma+and+AIDS-related+Kaposi's+sarcoma.">Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma.</a> Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes.">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).</li><li>Ten Hagen, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+augments+antitumor+activity+of+stealth+liposomal+doxorubicin+(DOXIL)+in+soft+tissue+sarcoma-bearing+rats.">Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats.</a> Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).</li><li>Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+to+systemic+treatment+with+STEALTH+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+improved+anti-tumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+rats.">Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats.</a> Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).</li><li>Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+safety+of+pegylated+liposomal+doxorubicin+(Doxil/Caelyx)+demonstrated+by+endomyocardial+biopsy+in+patients+with+advanced+malignancies.">Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies.</a> Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).</li><li>Muggia, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+encapsulated+anthracyclines:+new+therapeutic+horizons.">Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons.</a> Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+content+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+using+mild+hyperthermia.">Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia.</a> J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).</li><li>Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+optimization+of+idarubicin+thermosensitive+liposomes+provides+ultrafast+triggered+release+at+mild+hyperthermia+and+improves+tumor+response.">Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response.</a> J Control Release. 220, 425-437 (2015).</li><li>Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Doxil+is+taken+up+intracellularly+and+released+doxorubicin+sequesters+in+the+lysosome:+Evaluated+by+in+vitro/in+vivo+live+cell+imaging.">Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging.</a> J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).</li><li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+Thermosensitive+Liposomes:+A+Novel+Dual+Targeted+Heat-Triggered+Drug+Delivery+Approach+for+Endothelial+and+Tumor+Cells.">Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells.</a> Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).</li><li>Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+anti-tumour+activity+of+recombinant+human+and+murine+TNF,+alone+and+in+combination+with+murine+IFN-gamma,+on+a+syngeneic+murine+melanoma.">In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma.</a> Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).</li><li>Van Muijen, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+of+metastasizing+and+non-metastasizing+human+melanoma+cells+xenografted+into+nude+mice.">Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice.</a> Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).</li><li>Das, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+TIMP3+expression+affects+tumor+progression+and+angiogenesis+in+melanomas+through+regulation+of+directionally+persistent+endothelial+cell+migration.">Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).</li><li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics.">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).</li><li>Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+doxorubicin+efflux+from+the+nucleus+of+drug-resistant+cancer+cells+following+extracellular+drug+clearance.">Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance.</a> Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).</li><li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging.">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+hyperthermia+triggered+doxorubicin+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+improves+intratumoral+drug+delivery+and+efficacy.">Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).</li><li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+intracellular+Doxorubicin+delivery+through+nanoliposomes+equipped+with+selective+tumor+cell+membrane+permeabilizing+short-chain+sphingolipids.">Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids.</a> Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).</li><li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+glycoceramides+promote+intracellular+mitoxantrone+delivery+from+novel+nanoliposomes+into+breast+cancer+cells.">Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells.</a> Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

過去に観測された固定ほとんどすぐにリポソーム ナノキャリアを破壊することが、DXR リリース フォームこれらの破壊されたリポソームはまだ核を入力する時間を持っていた非常に難しいとも誤解を招くデータの解釈を行います。日常的にいくつかの顕微鏡の調整と生きた細胞や組織に化学療法の運命を確認または組織学的観察を打倒する調べることができます。最近の論文は、細胞生細胞タイムラプス イメージング9を使用して無料でカプセル化された dox で取り込み、リリース、および DXR の局在を示した。この作品より詳細に実験のセットアップについて説明します。このモデルを使用して、それは核に dox の即時の輸送を可視化することが可能、それは継続的にセルが最終的に死ぬまで蓄積します。対照的に、Dox NP を使用すると、リリースされた dox の少量は核にあります。DXR が次々 に連続暴露、蛍光シグナルは Dox ではるかに低い-NP-dox 扱われる細胞対細胞濃度とそれに続く細胞毒性の違いを示します。さらに、生きている細胞のマーカーを使用することにより、Dox NP に細胞を公開することには、DXR、ナノキャリアにあるとリソソームが示されました。これは、完全なリポソーム細胞によってとられる、これらのナノ粒子の取り込み中にエンドサイトーシス経路の関与を示しますを示します。核の DXR は明らかにリリースされた dox からです。ただし、DXR とキャリアの両方共をローカライズし、リソソームにはめられるよう、このメソッドを使用して、じゃまだ決定的かどうかこれはカプセル化または dox をリリースします。ナノ粒子の本質的な安定性が dox リリース リソソームでローカライズされている場合を防止することが可能です。
このプロトコルでは、住セルイメージ投射は (要求の仕様を与えることができる) カスタムメイド ステージ ホルダーと特定の顕微鏡のセットアップを使用して示されています。ただし、共焦点顕微鏡製造最も住セルイメージ投射を行うインキュベーターの範囲を提供しています。培養条件 (すなわち温度、CO2pH、湿度、および不妊症) を維持するこれらのインキュベーターの主な基準、適切な条件を決定するいくつかの予備テストが必要でさらに説明しています。自動データ取得プログラムは、同じメーカーでも配信できます。「マルチ ロケーション」オプションは、同じ室で複数ポジションを画像統計解析を精製すること可能になります。ただし、このオプションは本稿に記載されているマクロで Z ドリフトを修正する可能性が失われる、固定の XYZ の位置が必要です。Z 寸法をスキャンは、このマクロの分析の焦点平面を使用して含めることができます。ただし、これは余分なスキャン、光毒性の可能性を増加させる、漂白する必要があります。
細胞吸収性の異なる 2 つの化合物を比較するときに特に、すべての蛍光測定と同様は、露出オーバーは、問題です。蛍光の強度は、化合物の内因性信号にも取り込み、濃度、および薬剤の露出時間の速度に依存。図 3 に示すように、Dox NP 処理細胞の信号は見られないに対し dox 処理細胞の核の DXR コンテンツが表示されて既に。ゲインを増やすことによってのみ Dox NP 処理細胞で DXR 視覚化できます、dox 処理細胞では露出オーバーに 。さらに、細胞内でも、Dox NP は不均一分散、下でやむを得ないが発生- または露出オーバー。細胞の DXR エントラップメントを調査したときに特に、ゲインは個々 の細胞器官 (図 5 bと5 C) を区別するために激減しました。したがって、ピクセル密度で表される測定は結果の適切な解釈のための代表的なイメージで同伴します。
光毒性、漂白、低信号対雑音比も重要な問題で蛍光顕微鏡、画像の品質と画像の取得間の妥協を確立する必要があります。ただし、顕微鏡のセットアップが最適のときでも画質はセルと付加化合物の品質によって決まりますも大きく。DXR 強いシグナルを与えるし、適切な予防措置と漂白を確認できなかった (最大 72 時間) より長い期間後でさえも。ただし、蛍光信号の低減には流出の結果することができます。流出薬物抵抗15で重要な現象であり細胞細胞内作用部位から薬剤をポンプでくむときに発生します。時間をかけて蛍光シグナルの低下はできるためまた dox 流出9の結果になります。コマ撮りシリーズの最後の画像で実験の終わりに非スキャン位置の蛍光信号を比較するデモンストレーションを漂白 (すなわち、信号より高い場所にある、非スキャン) または (すなわち、両方の流出信号同じになります)。いくつかの矯正オプション (例えば背景、ドリフト、漂白など) が ImageJ16のようなプログラムで使用できます。また、蛍光強度が時間の経過につれて、構成設定は時間経過 (ステップ 3.21) の終わりに露出オーバーを最小限に抑えるためのパイロット実験における事前評価することができます。また、すでに希望期間の薬剤にさらされる細胞イメージング商工会議所は、設定を初期化する使用できます。最後に、このタイプの分析では、有毒な薬物濃度 (ステップ 3.22) は避けるべきであるし、確立済みの従来のバイオ試金を使用しています。
細胞は継続的に培養、フェノールレッドなし中維持されます。フェノールレッドはスペクトルの赤い部分に蛍光を発するし、細胞細胞器官、最も可能性の高いリソソーム、誤情報 (ステップ 1.2) を提示で観察することができます。個々 のセルの監視できるように、セルの合流は 70% (手順 3.1) を超えない。CO2流-速度 (ステップ 3.5) はメンテナンス以降検証実験機器を購入したときに規制する必要があります。速度が高すぎると、中に蒸発します。速度が低すぎる、培地の pH が増加細胞の成長に影響することができます。媒体が無い ph フェノールレッド pH インジケーターの変化は観察できない、そのため見落とされがちです。CO2の流れを検証すると、これらの設定は、すべて将来の実験で使用できます。
ここで説明した方法を使用して、ナノ粒子の運命簡単に調査できる住セルイメージ投射と微速度顕微鏡観察を使用しています。この手順では、市販のナノ粒子が使用されました。ただし、感温17、カチオン性リポソーム10の運命リポソーム濃縮短鎖 shingolipids18;ナノ粒子は、8、19腫瘍と正常細胞にこの方法で調べた他の薬をカプセル化します。

細胞間相互作用などの生物学的プロセスに従う能力間-細胞内輸送、細胞毒性化合物の吸収と細胞や組織、単一の分子の蛋白質蛋白質の相互作用過去大きな関心を得ています10 年間、「リアルタイム」の余分な次元を提供するので本稿では、無料 dox とナノ粒子 (Dox NP) に組み込まれている dox の細胞の運命に従う方法は、説明します。
ナノ粒子はある特定の癌を治療するために何十年も使用されています。エイズ関連カポジ肉腫の治療高度な卵巣と乳がん、多発性骨髄腫1と Dox NP が承認されました。最初リポソーム型ナノ粒子を開発し、臨床導入の一つだった。フリー フォーム、dox が大幅に十分な量で腫瘍部位に到達する能力を制限する血液の循環からクリアされます。さらに、治療は重度と用量制限副作用、口内炎、心臓障害などを伴います。ペグ化リポソーム ナノ粒子循環時間は日2分から増加します。このタイプのコレステロール含有リポソームは非常に安定して、この安定性は、カプセル化された薬剤の薬物動態を決定します。
しかし、この剛性を下げてをいます。腫瘍細胞に対する化合物の細胞毒性の能力は最初評価の in vitro、それは、dox は Dox-NP の細胞毒性の試金の3,4よりも強力示されています。キャリアの安定リリースと薬物の細胞内取り込みを防止し、この現象を精査する価値がある仮説。血流に積極的な要素を最後に、そのまま、腫瘍部位に到達するために建てられた、リポソームの組み込みプロパティは、ターゲット ・ サイト (すなわち腫瘍の細胞毒性成分 (すなわちdox) の障害のバイオアベイラビリティ細胞核)。Dox NP は、フリー フォームと比較して応答を改善するかはたくましくまだの臨床的価値としてカプセル化大幅減少心毒性効果5だったします。次の年では、他の化合物をナノ キャリア6のカプセル化。また、キャリアを変更するトリガーされた薬物の放出 (すなわち、腫瘍部位で) の結果しますが、血液循環7,8で安定性を維持します。長年の調査と臨床使用、Dox NP のようなナノキャリアの腫瘍内運命を完全クリアはまだはありません。最近の出版物のナノ粒子とられること、全体として、dox のリソソーム9に閉じ込められたままことが示されました。
薬剤の放出をナノ粒子の細胞内取り込みは、住セルイメージ投射を使用して最高監視できます動的プロセスです。また、セルの古典的な組織に孵化、固定化リポソームのキャリアを破壊するアーティファクトを導入、偽の結果を与えることができるその後固定します。住セルイメージ投射のための主な要件、蛍光によって好ましく、目的のプロセスの視覚化であります。Dox のような特定の化合物がある本質的な赤い蛍光性。また、キャリアに蛍光マーカーが生じるし、細胞小器官は、生きている細胞のマーカーを使用して視覚化できます。この方法では、キャリア、薬物放出とキャリアや薬物などの細胞局在の取り込みなどのパラメーターの配列をイメージを作成および分析できます。ここでは、メソッドを説明し、dox といくつかの腫瘍細胞の Dox NP の細胞の運命はリアルタイムでその後します。また、このメソッドは、ターゲット (例えば、ナノ粒子10) とトリガーのための理想的な条件を作成する簡単に合わせることができる (例えば、温熱療法7) 薬物放出。

<table><tbody><tr><td>DMEM (no phenol-red)</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS</td></tr><tr><td>Trypsin-versene (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Heat inactivate for 30 min at 55 &amp;ordm;C</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Make a 0,1% solution in PBS, sterile</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0,22 &amp;micro;m filter - 500 ml&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Cells: Lewis lung carcimoma</td><td>ATCC</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>Cells: B16BL6</td><td>Dr. P. Brouckaert, Ghent University</td><td>donated</td><td>Ref.10</td></tr><tr><td>Cells: BLM and 1F6</td><td>Dr. van Muijen, University of Nijmegen</td><td>donated</td><td>Ref.11</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Actavis&amp;nbsp;</td><td></td><td>mentioned as dox in the manuscript</td></tr><tr><td>Doxil/Caelyx</td><td>Janssen-Cilag</td><td></td><td>mentioned as Dox-NP in the manuscript</td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR international</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>Lysotracker-green DND-26</td><td>Invitrogen</td><td>L7526</td><td>mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript</td></tr><tr><td>Lysotracker-red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript</td></tr><tr><td>Attofluor cell ring</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 25 mm #1</td><td>Thermo scientific</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>Stage holder + sealing lid</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 510 microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software LSM 510 version 3.2 SP2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr></tbody></table>

using in vitro live-cell imaging to explore chemotherapeutics delivered by lipid-based nanoparticles

従来の画像処理技術は、細胞プロセスに関する詳細情報を提供できます。しかし、この情報は、そうでなければ動的システムで静的なイメージに基づいています、連続したフェーズが簡単に見落とされるか誤解。住セルイメージ投射と微速度顕微鏡観察で生きているセルに対して実行できます数時間あるいは数日もっとまたはより少なく連続的なファッションではありませんそのため非常に有益。ここで説明したプロトコルでは、ドキソルビシン (dox) 生きている細胞の出産後化学療法ナノ粒子の運命の調査ができます。Dox は、生物学的にアクティブになる、ナノキャリアから解放する必要がありますデュアルインターカレーションのエージェントです。二十年以上臨床登録、にもかかわらずその吸収、破壊し、薬物放出まだ完全に理解しました。この資料では、脂質を基盤とした腫瘍細胞によってとられ、徐々 に分解があるという仮説を探ります。リリースされた dox は、核に転流します。固定アーティファクトを防ぐために、住セルイメージ投射と微速度顕微鏡観察、この実験の手順の説明を適用できます。

別のマーカーとリポソーム キャリアの分類は上記9をされています。キャリア付けられて遠 dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine 過塩素酸塩 (でした。Ex = 644 nm;Em = 665 nm) または緑 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF PE;Ex = 490 nm;Em = 515 nm) この原稿で示されます。細胞間の類似点とリポソーム取り込み、リリース、および細胞内局在の違いを表示するには、複数の腫瘍のタイプを調べた。マウスの 2 つの行、B16BL6 悪性黒色腫11とルイス肺癌 (LLC) と 2 つのひと黒色腫、転移性の高い (BLM)、非転移性 (1F6) 悪性黒色腫12,13が含まれます。生きた細胞を用いるすべての実験を行った。すべての実験で 3 24 の h. 測定や分析 dox (無料、リリースされた、カプセル化、隔離、または介在の形態) で呼ばれた DXR の 5 μ g/mL dox、5 μ G/ml、Dox NP または 0.05 µmol ナノ粒子の濃度が投与されました。40 X (開口数: 1.3) 油対物レンズが使用され、CF PE とライソゾーム マーカー (LM) のイメージングを行った 488 nm アルゴン レーザー (10%/0.2 mw) と 505 に 550 nm バンドパス フィルター-緑。543 nm ヘリウム ネオン レーザー (100%/0.2 mw) 560 に 615 nm のバンドパス フィルターを用いて dox、Dox NP とライソゾーム マーカー赤と。633 nm ヘリウム ネオン レーザー (100%/0.5 mw)、640 nm ロングパス ・ フィルターを用いていた。
そのカプセル化のため生体外の細胞毒性、バイオアベイラビリティ、dox の薬物動態は、大幅に変更された3,9,14をだった。無料でカプセル化された形で投与したときの薬物のバイオアベイラビリティの差は、図 3に示されています。Dox はデュアルインターカレーション エージェントを細胞に細胞核を入力する必要があります。図 3と関連映画の 1 と 2 は、3 h を同一条件下で dox と Dox NP BLM 細胞の時間経過の表示に。Dox 露出の数分以内核 DXR (図 3 a映画 1) を観察することができ、下を使用して (挿入) を得るため、核の間をインターカ レートを見ることができます。一方、Dox NP にさらされると、細胞内 DXR は、(図 3 b映画 2) この時間枠の内でほとんど見えないです。光電子増倍管の利得を増やすだけで細胞質に DXR を観察できる (挿入)。ImageJ を用いた、細胞質と核の DXR のピクセル密度を行った。細胞は、運動、時間経過の評価中に、蛍光を明視野画像を組み合わせることが重要です。これは、個々 のセルを追跡し、ImageJ で特定のプラグインを使用して XY ドリフトを安定化の可能性を示します。図3 における、明視野イメージは利益 (率 ROI) (実線) の細胞質と核 (点線) の周りの領域を描画に使用されました。ImageJ で ROI マネージャーは、メニュー項目分析で見つけることができます &#62; ツール &#62; ROI マネージャー。これらの Roi はメニュー項目分析を使用してピクセル密度を分析する蛍光画像で使用される &#62; メジャー。核 (図 3) のピクセル密度と dox または Dox-NP-処理細胞の細胞質 (図 3 D) の違いは、画像で見ているものを確認します。また、セル dox または後化合物は媒体に置き換え、光電子増倍管の利得 (図 4) の高められた感度ですぐに結像される Dox NP で 24 時間培養。レーザー出力、オフセット、ピンホール、画像表示などの他の設定は同一であった。Dox NP 処理 dox 治療に比べて細胞で DXR 信号が印象的です。700 のゲインを使用、Dox NP 処理細胞で DXR が dox のイメージは既に露出オーバーに対し、表示されます。この単純な生体外実験では、カプセル化された薬剤と無料のバイオアベイラビリティの差を可視化します。
細胞が 24 h の Dox NP に継続的にさらされる、DXR 造り上げる、図 5 aと映画 3 と 4 で示すように。信号が細胞質の増加し、DXR 発見が遅くまた核に挟在します。これらの観察は、ピクセル密度グラフ (図 5 b) で確認しています。測定された細胞質ピクセル密度は BLM 1F6 細胞に比べて細胞内分布の違いのために低いです。DXR 1F6 セルでは、セル全体に分散され、一方 BLM セルの DXR はより核 (図 5) に近い細胞小器官に集中してください。
そのため、薬と異なる細胞 (図 6) のキャリアの局在を調べた。Dox NP/したとイメージで 24 時間培養し, 細胞。明視野イメージを使用して細胞膜 (実線) と核 (点線) のオーバーレイは、3 つの異なる細胞の蛍光像で描かれました。ここで付いた、キャリア、DXR と同じ細胞質パターンに従うこと示されて: LLC は、全体の核の周り, BLM の原子核に近い細胞小器官に集中し、ランダムに B16BL6 細胞の細胞質に散在します。核でのみ DXR として見ることができる、dox を解放を示します。光電子増倍管の利得を減らして、DXR と付けられてキャリアを含む個々 の細胞小胞でしたと同様、CF-PE (図 6 b ・ 6 C) と見ることができます。
小さい小胞の細胞質 DXR sequesters し、セルは緑または赤で生きている細胞のライソゾーム マーカーで付けられました。これらのリソソームの動きは、セル (映画 5) で続くことができます。細胞質 DXR と、ナノキャリアはこれらの構造の内で colocalize し、DXR パターンで細胞間差図 6に見られるように、ここで説明します。リソソームは、B16BL6 細胞質全体にランダムに分散し、BLM 細胞 (図 7 a) の核に位置しています。ImageJ を用いた、DXR とリソソーム内のキャリアの間の共存を求めた (図 7 b)。カラー画像はバイナリで行われた (プロセス &#62; バイナリ &#62; バイナリを作る)、プラグインの共存を使用して (分析 &#62; の共存)、共存イメージと DXR の作られたでした。これは両方の画像のコードして, ピクセルを表す白いピクセル グリーン赤白カラーの画像を作成します。メニュー項目のプロセス &#62; バイナリ &#62; バイナリを作る、白いピクセルを分離し、ピクセル密度の測定元となる黒のピクセルに変換する (分析 &#62; 測定)。この DXR 間共存イメージがしましたその後、-イメージしたし、ライソゾーム マーカー (LM) とピクセル密度のバイナリ イメージを測定します。共存に関する研究データは DXR の肯定的なピクセルの割合-でしたと DXR でした/ライソゾーム マーカー (図 7)。CF PE で標識されたキャリアと同様は、リソソームの位置も、図 7に表示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig1.jpg"> 
図 1: 楽器と機器のセットアップ。A) イメージング室 + 必需品。25 mm #1 カバーガラス (1) 商工会議所 (2) の下の部分 (場所の部屋の上部します。下逆さま d)、o リング (3)、ステージ ホルダー (4)、シール蓋 (5)。スケール バー: 2 cm。 B) インキュベーション ユニット。加熱顕微鏡ステージ (1) フローとで- とアウト-flow CO2 (2)、(3) CO2プローブおよび終了パッチ (4)。スケール バー: 2 cm。 C) 顕微鏡の下で見られるようにインキュベーター ユニットでチャンバーをイメージングします。D) マルチ時間シリーズ マクロ。E) イメージング装置です。逆顕微鏡 (1)、蛍光灯 (2)、コンピューター (3)、リング ヒーター (4、挿入) とコント ローラー (4、主要な図)、CO2流管 (5)、CO2バルブ (6)、CO2コント ローラー (7), CO2加湿器 (8) O2バルブとコント ローラー (9) とステージ温度コント ローラー (10)。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig2.jpg"> 
図 2:プロトコル セクション 3 で細かいパラメーターを顕微鏡の概略図。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig3.jpg"> 
図 3: dox と Dox NP の短期的な摂取量を調査します。 BLM 細胞が 3 h、dox または Dox NP にさらさ継続的に、経過時間をとった。(A) dox と培養細胞のコマの静止画像。(B) 細胞のコマの静止画像は、Dox NP と孵化させます。スケールバー = 50 μ m (C) ピクセル密度増加額 dox と Dox-NP-処理細胞で核の DXR の。(D) dox と Dox-NP-処理細胞の細胞質の DXR のピクセル密度増加。データは、フィールドごとの 3 セルの平均 ± SD を表します。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig4.jpg"> 
図 4: 細胞 dox と Dox NP の長期的な摂取量を調査しています。細胞は dox または Dox NP にさらされ、後で 24 h をイメージします。3 異なる利益と、薬を除去した後すぐに撮影を行った。スケールバー = 50 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig5.jpg"> 
図 5: 細胞内取り込みとリポソームのエージェントのリリースを調べるします。細胞は、24 時間、Dox NP に継続的にさらされ、コマ撮りしました。(A) コマ撮りの静止画。スケール バー 50 μ m (B) ピクセル密度の増加額 DXR の核と細胞質を =。データは、フィールドごとの 3 セルの平均 ± SD を表します。(C) 画像をセル内で DXR の局在を示します。実線: 細胞膜、点線: 核。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig6.jpg"> 
図 6: 薬と異なる細胞株におけるキャリアのローカライズを調査します。(A) 細胞が Dox NP/ー 24 時間にさらされているし、イメージします。スケールバー = 50 μ m。 (B) 細胞 24 h の Dox-NP/か/CF-PE にさらされる, 個々 の小胞を区別するために低強度の利得を持つイメージを作成します。(C) ブライト フィールド、DXR の細胞質小胞 (矢印) で DXR を示すオーバーレイします。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig7.jpg"> 
図 7: 薬物とキャリアの細胞内局在化の調査。セルは、Dox NP/でしたか CF-PE/24 時間にさらされ、リソソームが緑または赤の生きている細胞のライソゾーム マーカー (LM) を用いて可視化します。DXR と (した) キャリアの細胞内分布 (A)。矢印は、DXR の 3 例を表し、リソソームでローカライズされたでした。スケールバー = 50 μ m (B) の共局在解析において, dxr と ImageJ を用いたリソソーム (LM) にキャリア (でした)。DXR の共局在およびリソソームにキャリアの (C) の割合。データは、3 の個々 の実験の平均 ± SEM を表します。2 つのマーカーを用いて可視化するキャリアの (D) ライソゾーム隔離。スケールバー = 50 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov1.jpg"> 
映画 1: 関連図 3:3 h の dox と BLM 細胞培養コマ撮り: フレーム レートを 10 分の間隔で、19 画像: 3 fps。スケールバー = 50 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_1_BLM_Doxorubicin_for_3h.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov2.jpg"> 
映画 2: 関連図 3:3 h の Dox NP の BLM 細胞培養コマ撮り: フレーム レートを 10 分の間隔で、19 画像: 3 fps。スケールバー = 50 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_2_BLM_Doxil_for_3h.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov3v3.jpg"> 
映画 3: 関連する図 5:24 時間の Dox NP の BLM 細胞培養時間経過は: フレーム レートを 15 分間隔で 96 画像: 8 fps。スケールバー = 50 μ m。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a href=""></a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a>vi"ターゲット ="_blank"> このビデオを表示するのにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)。
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov4.jpg"> 
映画 4: 関連図 5: 1F6 細胞 Dox NP で培養し, 24 時間時間経過は: フレーム レートを 15 分間隔で 96 画像: 8 fps。スケールバー = 50 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_4_1F6_Doxil_for_24h.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Movie 5" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov5.jpg"> 
の映画 5: 関連図 7:リソソーム B16BL6 細胞の生細胞マーカーが染まった。時間経過は: 10 の間隔で 10 の画像 s のフレーム レート: 3 fps。スケールバー = 50 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_5_B16BL6_lysotracker.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>

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Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

住セルイメージ投射はダイナミックなプロセスを可視化する強力なツールです。固定セルの検討プロセスについての混乱と誤解につながることができます、静的画像のみを提供します。この作業は、吸収、薬物放出と細胞内リポソーム型ナノ粒子の細胞内局在性を調査する手法を示します。

体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

8.4K ビュー.  Erasmus MC. 住セルイメージ投射はダイナミックなプロセスを可視化する強力なツールです。固定セルの検討プロセスについての混乱と誤解につながることができます、静的画像のみを提供します。この作業は、吸収、薬物放出と細胞内リポソーム型ナノ粒子の細胞内局在性を調査する手法を示します。

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

評価するための総合的な手順<em&gt;インビボ</em&gt;がんNanomedicinesのパフォーマンス

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

がん研究

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

医学

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

生物工学

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

免疫・感染学

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

要約

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この動画の章

評価するための総合的な手順

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタキセルに応答を評価するために

のためのウイルス粒子

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

のためのツールとしてのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

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生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために

のためのウイルス粒子

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタキセルに応答を評価するために

のためのツールとしてのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光