Name: induction of an inflammatory response in primary hepatocyte cultures from mice
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
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この作品は、NIH（R01HL128714 CF）と（KSへF31DK10236101）とアメリカ心臓協会（CFとAG）によってサポートされていました。

全ての動物プロトコルおよび実験手順は、医学のマイアミミラー科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.準備<ol><li>予熱肝臓灌流媒体および肝臓を37℃の水浴中で媒体を消化します。 </li><li>灌流ポンプ（30ミリリットル/分）を設定します。慎重に肝灌流メディアとポンプの配管システムを事前入力。システム内の任意の気泡を避け、定位顕微鏡を準備します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、コラーゲンタイプIを使用してコート細胞培養皿。 </li></ol> 2.肝回復<ol><li> 酸素/イソフルラン吸入（イソフルラン4％/ 2 L /分の酸素）を使用して、ドナーマウスを麻酔。 <ol><li> 2-2.5％のイソフルランを下げることによって、またはケタミンを注射することによって麻酔を維持した（100mg / kg体重の腹腔内量）およびキシラジン（体重の10mg / kgのintraperitoneally）。ケタミンは、血圧を低下させ、肝毒性を引き起こす可能性があるため、連続的なイソフルラン麻酔が好ましいです。 </li></ol></li><li>吸収パッドに麻酔マウスを置きます。粘着テープでマウスの四肢を修正しました。 </li><li>剃るとマウスの腹部を消毒し、シャープ/鈍ヒントを手術用ハサミを使用して、肝臓の頭蓋国境に恥骨から腹開腹術を行います。 、両面に振動板の尾を腹壁を切開。 </li><li>慎重に右側に腸を動かすことによって、下大静脈（IVC）を公開します。慎重に滅菌綿棒綿棒や角度のついた先端鉗子を使用して、IVCの周りの脂肪組織を解剖。 </li><li>肝上横隔膜を切開し、シャープ/鋭い先端の微細手術用ハサミを使用して、2つの横方向の切開によって胸腔を開きます。外科的な絹（5/0）を使用して胸部IVCを連結。 </li><li> 、慎重に針を取り外し、シールド静脈カテーテルを使用して、腎臓下のIVCにカニューレを挿入灌流ポンプを接続し、肝臓を灌流開始。適切に実行した場合、肝臓はすぐに白くやうねりに開始する必要があります。 </li><li>微細手術用はさみを用いて血液と灌流メディアの適切な排水を可能にする静脈ポータルを横断。 </li><li>肝灌流メディアの約30mLで肝臓を灌流し、その後メディア（30ミリリットル）をダイジェスト肝臓に切り替えます。灌流ポンプの電源をオフにして、潅流が完了したら、カニューレを削除します。 </li><li>静かに肝臓の中央領域を露出させ、肝葉を結ぶ接続する組織を検索します。中央の連結糸をつかみ、慎重に所定の位置に肝臓を保持している全ての組織を解剖し、静かに肝臓を削除します。 </li><li>直ちにメディアダイジェスト肝臓の15 mLを含む50 mLのポリプロピレン製コニカルチューブに肝臓を移します。 注：このステップの具体的なタイムラインがありません。灌流後、肝臓は、滅菌細胞培養フードへの輸送のためのダイジェスト培地に残っています。すべてですubsequent手順は無菌環境で行うべきです。 </li></ol>細胞の3単離と治療<ol><li>細胞培養フード内で無菌の組織培養皿に消化培地を含む50mLのポリプロピレン製円錐管から肝臓を移します。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、静かに肝臓の4ローブを引き裂きます。適切に実行した場合、消化培地が原因で肝臓から肝細胞を単離することに濁っておく必要があります。 </li><li> 25mLの滅菌ピペットチップを用いて、未消化組織粒子及び細胞破片を除去し、新しい50mLのポリプロピレン製コニカルチューブに70μmのナイロン細胞ストレーナーを介して混濁消化培地をフィルタ。 </li><li>繰り返しは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3.2と3.3を繰り返します。これは、肝臓から残留肝細胞を除去することを支援します。 </li><li> 4°Cで2分間50×gで遠心分離します。 25 mLの冷たい1×で細胞を再懸濁静かに過剰細胞破片を含む上清を吸引し、ウィリアムズの中E. </li><li> 25mLの滅菌ピペットチップを使用して、クリーンな懸濁液を達成するために、50mLのポリプロピレン製コニカルチューブに新しい70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して再懸濁をフィルタリングします。 </li><li>繰り返しは、より明確な細胞懸濁液を得るために、冷たいウィリアムズE培地1Xを使用して、3つの追加の洗浄のための3.5と3.6を繰り返します。 </li><li>最後の洗浄工程の後、吸引上清を過剰細胞残屑を除去しました。再懸濁し、50mLポリプロピレン製コニカルチューブに新しい70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して初代肝細胞融解やメッキサプリメントが含まれている25 mLの暖かいウィリアムズ「メディアE 1倍でフィルタセル。 </li><li>血球計を用いて25 mLの細胞懸濁液内の細胞を数えます。成人肝あたり20万個の細胞 - 平均して15を期待しています。トリパンブルー染色を用いて細胞生存率を決定します。 </li><li>プレート初代肝細胞の融解が含まれているウィリアムズのメディアE 1×2mL中の細胞やコラーゲンコートした6ウェルCE上のサプリメントをメッキLL培養クラスター（ウェル当たり9×10 5個の細胞）。 </li><li> 4時間後、初代肝細胞の維持サプリメントが含まれているウィリアムズのメディアE 1Xにメディアを変更します。 </li><li> 24時間後、血清ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）培地で1×6時間、細胞を飢えさせます。 </li><li>ビヒクル、FGF23（25ngの/ mL）を、LPSのようにPBSで細胞を処理（100μg/ mLの）または無血清培地中のIL-6（50ng / ml）及び24時間インキュベートします。 </li></ol> RNAの4.絶縁<ol><li>製造業者の指示に従って商用スピンカラムキットを用いてRNAを調製します。 </li></ol>逆転写により単離されたRNAから5.生成するcDNA <ol><li> PCRチューブに単離されたRNAサンプルの200 ngのを追加します。 </li><li>ステップ5.1からPCRチューブにヌクレアーゼフリーH 2 Oの14μLを追加します。 </li><li>ステップ5.1からPCRチューブに逆転写酵素の4μLを追加します。 </li><li>混合物が均質にするために静かに内容を再サスペンド。遠心優しく。 </李&gt; <li>サーモサイクラーに混合物を含むPCRチューブを置きます。実行逆転写のためのサーモサイクラー：次に、25℃（5分）、42℃（30分）を1サイクル、85℃（5分）、4℃で保持します。最終生成物は、所望のcDNAになります。 </li></ol>前記定量的リアルタイムPCRによる細胞の分析（定量PCR） <ol><li> 96ウェルプレートを準備します。 <ol><li> 1μLのcDNA、0.25μMフォワードプライマー、0.25μMリバースプライマー、5μLSYBRグリーン、10μLの総容量に3.5μLのPCRグレードの水：氷の上で定量PCR反応のすべてのコンポーネントを配置します。 SYBRグリーンを使用して、三連ですべてのサンプルを実行するには、マスターミックスを準備します。 </li><li>マスターミックスが完了すると、渦は、均質作ります。 96-WLLプレートの各ウェルにアリコート9μL定量PCRのマスターミックス。後、慎重に各ウェルにcDNAの1μLを追加します。総反応容量10μLになるであろう。 </li><li>ローディングが完了した後、光を用いて、96ウェルプレートをシール接着フィルム、短時間遠心分離、96ウェルプレート（1分間50×gで）。 </li></ol></li><li> リアルタイム-PCR機器で実行したサンプル。リアルタイム-PCR機器に封入し、96ウェルプレートを置き、機器ごとにメーカーの推奨事項として、サンプルを実行します。標準および高速サイクルの例は、以下に含まれています。 <ol><li> 60秒間、15秒間、その後、120秒間94℃、60℃を94℃の40サイクルを最初の変性、その後、必要に応じて、4℃で保持する：標準的なサイクリングパラメータは、以下を使用します。 </li><li>高速サイクリングパラメータの場合：5秒、15秒58℃、10秒間、その後72℃、その後、30秒、95℃の40サイクルを94℃での初期変性：以下を使用します。 </li></ol></li><li>データを分析する方法に関するガイダンスについては、機器のマニュアルを参照してください。 </li></ol> ELISAによる細胞上清の7.分析注：すべての手順は、メーカーのプロトコルに従って行われます。 </P&gt; <ol><li> 試料調製 <ol><li>別々のチューブに希釈剤の398μLを分注します。 398μLの希釈剤チューブに細胞上清サンプルのピペット2μL。これは、200の希釈倍数を提供します。 </li><li>テストされる各サンプルの手順を繰り返し7.1.1。 </li></ol></li><li> 手順 <ol><li> 200倍希釈したサンプルと、96ウェルプレートのウェルに標準100μLを加えます。 </li><li> 150rpmでマイクロプレートシェーカー上で45分間、25℃で96ウェルプレートをインキュベートします。 </li><li>ウェルを1×洗浄緩衝液で5回洗浄します。最後の洗浄が完了すると、吸収紙を持つすべての残留洗浄液を除去します。 </li><li>各ウェルにHRPコンジュゲート試薬500μLを追加します。 </li><li> 7.2.3 - を繰り返して、7.2.2を繰り返します。 </li><li>テトラメチル100μLを加える（TMB）を、96ウェルプレートの各ウェルに試薬。 </li><li>穏やかにマイクロプレート上に20分間、25℃で96ウェルプレートを混ぜます150rpmでシェーカー。直接各ウェルに停止液100μLを加えて反応を停止し、穏やかに混合します。停止液が追加されると色が黄色に変わります。これは、停止液を正しく混合されたことを通知します。 </li><li>マイクロタイタープレートリーダーを用いて、最初の5分以内に450 nmでの光学密度を決定します。 </li></ol></li><li> 結果の計算 <ol><li>各サンプルおよび各標準の平均吸光度値（450）の表を計算します。 </li><li>線形グラフにNG / mLの中でその標準濃度に対する各標準のA 450平均値をプロットすることにより標準曲線を組み立てます。 450の値を表すために濃度、y軸を表すx軸を許可します。 </li><li>各希釈サンプルから450の平均利用して、標準曲線からNG / mLの所望のタンパク質の濃度を決定します。 </li><li>事実上の希釈によって試料濃度を掛けrを。これは、細胞上清試料中の所望のタンパク質の実際の濃度を決定することを可能にします。 </li><li>折れ線グラフにサンプルから構成されたテーブルをプロットします。 OD 450の値は、標準曲線の外になった場合、サンプルが適切に希釈されるべきであり、再試験しました。 </li><li> 500,000個の細胞に結果を正規化します。 </li></ol></li></ol>

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著者は宣言するために利害の競合を持っていません。

マウスからの初代肝細胞を分離することにより、ex vivoでの炎症反応を研究するために、高速、安価で信頼性の高いツールです。正しく実行した場合、結果は容易に生成され、タイムリーかつ費用効率的な方法で再生することができます。以下の点を慎重に成功した絶縁を確保するために評価されるべきです。 外科的切開とIVCのカニュレーションは、全身麻?...

慢性腎臓病（CKD）は、急性および慢性炎症1の状態として定義することができます。 CKDを有する患者において、phosphaturicホルモン線維芽細胞増殖因子23（FGF23）の血清レベルは、徐々に、血清リン酸塩のホメオスタシス2を維持するために上昇します。増加した血清FGF23レベルは独立して、血液透析治療3、4を始めている患者の間で心血管疾患の罹患率と死亡率に関連付けられています。さらに、いくつかの臨床研究が上昇FGF23レベルおよびC反応性タンパク質（CRP）、インターロイキン6（IL-6）および腫瘍壊死因子α（TNFα）5、6の血清レベルの間に強い相関関係を示しています。また、実験的研究では、我々は、FGF23直接肝細胞を標的とし、CRPおよびIL-6 Pを増加させることにより炎症反応を引き起こすことができることが最近実証されています肝臓7でroduction。したがって、FGF23は、CKDにおける全身性炎症に貢献する循環因子として作用することがあります。 70年代初めには、初代肝細胞を単離し、初めて8のために勉強しました。それ以来、初代培養肝細胞が広範囲に代謝処理、ホルモン機能、薬物代謝および毒性を調べるだけでなく、免疫および炎症反応9、10に使用されてきました。以前のプロトコルは、主に、ヒト肝組織11、12からの一次肝細胞の酵素の単離を記載しています。優れたモデルが、これは複雑な肝臓のシグナル伝達機構と同様に刺激の異なる種類に応じて機能的結果にどのように影響するかを遺伝子操作研究する能力を残します。以下では、我々は、マウス初代肝細胞の単離を記載しています。注目すべきことに、このようなリポ多糖（LPS）、IL-6及びFGF23などの肝臓の急性期反応のいくつかのメディエーターの効果は、簡単、迅速かつ再現可能な方法13で解析することができます。 ここで、我々は、成体マウスからの肝細胞の酵素を単離するためのプロトコルを提示し、我々はそのようなLPSおよびIL-6などの炎症の確立された誘導物質、ならびにFGF23としての新規炎症性メディエーターは、直接の発現および分泌を刺激することができることを実証していますこのような培養肝細胞におけるCRPおよびIL-6などの炎症性サイトカイン、。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &amp;mu;m Nylon cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 6-inch Cotton Tipped Applicators&amp;nbsp;</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 well Cell Culture Cluster</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)</td><td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 Perfusion Pump</td><td>Gilson</td><td>F155007</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer Kits, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer Cover Glasses, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissers - Sharp/Blunt</td><td>F.S.T.</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors-ToughCut Straight</td><td>F.S.T.</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS-45 Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Student Tissue Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid solution, 2.0 N</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP 250 mL</td><td>Piramal Healthcare</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)</td><td>VEDCO</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/mL</td><td>AnaSed Injection</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Willams&#039; Medium E (1x)</td><td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Liver Perfusion Medium (1x)</td><td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements</td><td>Life Technologies</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Maintenance Supplements</td><td>Life Technologies</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr></tbody></table>

induction of an inflammatory response in primary hepatocyte cultures from mice

肝臓は、全身性炎症の調節において決定的な役割を果たしています。特に慢性腎臓病では、肝臓は尿毒症環境、酸化ストレス、内毒素血症および急性期反応物質を大量に製造することにより炎症性サイトカインを循環させる減少クリアランスに応じて反応します。炎症や肝細胞の根本的な役割を研究するための実験的なツールは、特に、慢性腎臓病などの複雑な設定で、全身の急性期応答および長期の炎症誘発性シナリオに肝臓のサイトカインの調節および貢献を理解することが重要です。 生体内で炎症の複雑なメカニズムを研究することは困難なままであるため、通常はリソースを大量に消費するとは、トランスジェニック動物の使用を必要とし、第一の単離肝細胞は、肝臓の急性期反応に機構的洞察を得るための強力なツールを提供しています。このインビトロ技術は、中程度のコストを提供していますので、高い再生産性および技術常識には、一次単離された肝細胞はまた、容易にスクリーニング手法として使用することができます。ここでは、初代マウス肝細胞を単離するために、酵素ベースの方法を記載し、そして我々は、ELISAおよび定量的リアルタイムPCRを用いて、これらの細胞における炎症反応の評価を記述する。

組織学一次単離および培養された細胞の代表的な光学顕微鏡像を、 図1Aに示されています。免疫細胞化学分析は、単離された肝細胞は非常アルブミン（赤）、ならびに線維芽細胞増殖因子受容体4（FGFR4）（緑色）を発現することを示しています。核は4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（青）で染...

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Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

ここでは、成体マウスからの初代肝細胞を単離するための酵素的アプローチを示し、我々は、ELISAおよびリアルタイムPCRを使用して炎症反応の定量化を記載します。

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

induction-an-inflammatory-response-primary-hepatocyte-cultures-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K ビュー.  University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine. ここでは、成体マウスからの初代肝細胞を単離するための酵素的アプローチを示し、我々は、ELISAおよびリアルタイムPCRを使用して炎症反応の定量化を記載します。 

ビデオ: Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to generate an animal model that reflects the characteristics of the human disease 3-5. However, in various models the induction of disease was rather complex and often hepatitis was only transient3-5. Therefore, we have developed a straightforward mouse model that uses the major human autoantigen in type 2 autoimmune hepatitis (AIH-2), namely hCYP2D6, as a trigger6. Type 1 liver-kidney microsomal antibodies (LKM-1) antibodies recognizing hCYP2D6 are the hallmark of AIH-27,8. Delivery of hCYP2D6 into wildtype FVB or C57BL/6 mice was by an Adenovirus construct (Ad-2D6) that ensures a direct delivery of the triggering antigen to the liver. Thus, the ensuing local inflammation generates a fertile field9 for the subsequent development of autoimmunity. A combination of intravenous and intraperitoneal injection of Ad-2D6 is the most effective route to induce a long-lasting autoimmune damage to the liver (section 1). Here we provide a detailed protocol on how autoimmune liver disease is induced in the CYP2D6 model and how the different aspects of liver damage can be assessed. First, the serum levels of markers indicating hepatocyte destruction, such as aminotransferases, as well as the titers of hCYP2D6 antibodies are determined by sampling blood retroorbitaly (section 2). Second, the hCYP2D6-specific T cell response is characterized by collecting lymphocytes from the spleen and the liver. In order to obtain pure liver lymphocytes, the livers are perfused by PBS via the portal vein (section 3), digested in collagen and purified over a Percoll gradient (section 4). The frequency of hCYP2D6-specific T cells is analyzed by stimulation with hCYP2D6 peptides and identification of IFN&gamma;-producing cells by flow cytometry (section 5). Third, cellular infiltration and fibrosis is determined by immunohistochemistry of liver sections (section 6). Such analysis regimen has to be conducted at several times after initiation of the disease in order to prove the chronic nature of the model. The magnitude of the immune response characterized by the frequency and activity of hCYP2D6-specific T and/or B cells and the degree of the liver damage and fibrosis have to be assessed for a subsequent evaluation of possible treatments to prevent, delay or abrogate the autodestructive process of the liver.

Infection of mice with an Adenovirus expressing the major human autoantigen cytochrome P450 2D6 (hCYP2D6) recognized by sera of patients suffering from type 2 autoimmune hepatitis results in a persistent form of autoimmune-mediated liver disease characterized by extensive hepatitis, fibrosis and generation of a CYP2D6-specific immune response.

CYP2D6の動物モデル：マウスにおける自己免疫性肝炎を誘導する方法

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to ...

医学

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded elucidation of the underlying mechanisms and development of innovative immunotherapeutic strategies. To develop an ideal animal model recapitulating human HCC, immunocompetent male C57BL/6J mice first receive a carbon tetrachloride (CCl4) injection to induce liver fibrosis, then receive histologically-normal oncogenic hepatocytes from young male SV40 T antigen (TAg)-transgenic mice (MTD2) by intra-splenic (ISPL) inoculation. Androgen generated in recipient male mice at puberty initiates TAg expression under control of a liver-specific promoter. As a result, the transferred hepatocytes become cancer cells and form tumor masses in the setting of liver fibrosis/cirrhosis. This novel model mimics human HCC initiation and progression in the context of liver fibrosis/cirrhosis and reflects the most typical features of human HCC including immune dysfunction.

Here, we describe the development of a clinically relevant murine model of liver cancer recapitulating the typical immune features of hepatocellular cancer (HCC).

肝炎症と線維症の設定に起因する肝細胞癌の腫瘍性肝細胞誘発性オルコトピックマウスモデル

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

がん研究

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

マウスにおける胆管結紮：閉塞性胆汁うっ滞による炎症性肝障害と線維症の誘発

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

免疫・感染学

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

2型糖尿病と関連した非アルコール性脂肪性肝炎のための高度なマウスモデル

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

分化HepaRG細胞における大胞性脂肪症の誘導と特徴付け

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

マウス コリン欠乏エチオニン (CDE) ダイエット慢性肝障害モデル

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

生物学

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or more hepatocytes contribute apical membranes to form a bile canalicular network through which bile is secreted. Hepatocyte polarization is essential for correct canalicular formation and depends on interactions between the hepatocyte cytoskeleton, cell-cell contacts, and the extracellular matrix. In vitro studies of hepatocyte cytoskeleton involvement in canaliculi formation and its response to pathological situations are handicapped by the lack of cell culture, which would closely resemble the canaliculi network structure in vivo. Described here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from the adult mouse liver using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the production of culture in a 3D collagen sandwich setting, which is used for immunolabeling of cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatments in vitro. It is shown that hepatocyte 3D collagen sandwich cultures respond to treatments with toxins (ethanol) or actin cytoskeleton altering drugs (e.g., blebbistatin) and serve as a valuable tool for in vitro studies of bile canaliculi formation and function.

Presented here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from adult mouse livers using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the long-term culture of hepatocytes in a 3D collagen sandwich setting as well as immunolabeling of the cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatment.

インビトロにおける胆道カネラ形成における細胞骨格の役割を研究する原発マウス肝細胞の単離と3Dコラーゲンサンドイッチ培養

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

要約

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CYP2D6の動物モデル：マウスにおける自己免疫性肝炎を誘導する方法

肝炎症と線維症の設定に起因する肝細胞癌の腫瘍性肝細胞誘発性オルコトピックマウスモデル

マウスにおける胆管結紮：閉塞性胆汁うっ滞による炎症性肝障害と線維症の誘発

BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

2型糖尿病と関連した非アルコール性脂肪性肝炎のための高度なマウスモデル

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリマウス肝細胞の分離

分化HepaRG細胞における大胞性脂肪症の誘導と特徴付け

肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス

マウスコリン欠乏エチオニン (CDE) ダイエット慢性肝障害モデル

インビトロにおける胆道カネラ形成における細胞骨格の役割を研究する原発マウス肝細胞の単離と3Dコラーゲンサンドイッチ培養

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

要約

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CYP2D6の動物モデル：マウスにおける自己免疫性肝炎を誘導する方法

肝炎症と線維症の設定に起因する肝細胞癌の腫瘍性肝細胞誘発性オルコトピックマウスモデル

マウスにおける胆管結紮：閉塞性胆汁うっ滞による炎症性肝障害と線維症の誘発

BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

2型糖尿病と関連した非アルコール性脂肪性肝炎のための高度なマウスモデル

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

分化HepaRG細胞における大胞性脂肪症の誘導と特徴付け

肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス

マウス コリン欠乏エチオニン (CDE) ダイエット慢性肝障害モデル

インビトロにおける胆道カネラ形成における細胞骨格の役割を研究する原発マウス肝細胞の単離と3Dコラーゲンサンドイッチ培養

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリマウス肝細胞の分離

マウスコリン欠乏エチオニン (CDE) ダイエット慢性肝障害モデル