This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant n&#186; 32003B_127619).

1.細胞培養<ol><li>培養ヒト肝癌のHepG2セル6から25cmでインキュベーター（5％CO 2中37℃で10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で2細胞培養フラスコ2、95％空気）（播種密度：1×10 6細胞あたり25 cm 2の細胞培養フラスコ、37℃インキュベーター中でのインキュベーション時間：48時間、密集度でセル密度：25センチメートルあたり4-5×10 6細胞2細胞培養フラスコ）。 </li><li>細胞は、90％〜95％コンフルエントである場合に実験を行います。 </li></ol>ポーラログラフ酸素センサーの2.高解像度の呼吸計測キャリブレーション<ol><li>ピペット2.1 oxygraph室に呼吸バッファーmlの安定酸素フラックス信号まで1時間37℃でチャンバー内に存在する磁気撹拌棒（700 rpm）を用いて連続的にバッファをかき混ぜますポーラログラフ酸素センサが得られます。 注：各oxygraph室対策の酸素濃度内のポーラログラフ酸素電極と各チャンバ内の酸素消費量（フラックス）を計算します。酸素濃度と酸素消費速度（フラックス）は、データ収集および分析のためのソフトウェアを使用してコンピュータにオンラインでリアルタイムに表示されます。 </li><li>製造業者のプロトコル14に従ってポーラログラフ酸素センサのエアキャリブレーションを実行します。 注意：空気飽和実験温度で培地中の呼吸媒体と酸素濃度のポーラログラフの酸素センサーの較正は一度だけ、毎日午前中に行われます。その後、培地を新鮮な呼吸培地に再懸濁チャンバ、細胞から除去することができるoxygraphチャンバーに添加し、呼吸数を測定します。最初の実験の後、チャンバを洗浄することができ、実験の付加的な一連のTで行うことができますさらに校正せずに彼と同じチャンバー。 </li></ol>細胞を計数する接着細胞の3トリプシン処理、 <ol><li>実験の日に、25cm 2の細胞培養フラスコからDMEMを吸引します。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mlで培養フラスコにおける細胞培養単層をすすぎます。 </li><li>ピペット0.5培養フラスコ中の細胞単層に（37℃の水浴中で37℃に予熱）トリプシン溶液を25mg / mlのmlのインキュベーター（5％CO 2中で37℃で5分間インキュベート、95％空気）。 </li><li> DMEMは、細胞培養フラスコ中で剥離した細胞に10％FBSを含有し、ピペッティングにより細胞を懸濁するピペット5 mlです。 </li><li>室温で350×gで5分間、15mlの遠心チューブと遠心分離機に再懸濁した細胞を移し、上清をデカント。 </li><li>呼吸バッファ13（T できる1）1mlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><l<html> I&gt;細胞カウンターを用いて細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの最終濃度に呼吸バッファに再懸濁。細胞呼吸率は細胞数に正規化されますので、正確かつ精密な細胞カウンターで細胞を数えます。 </li></ol> 4.高解像度呼吸計測<ol><li>空気校正（2.1~2.2ステップ、一度だけ、毎日行われる）後、oxygraphのチャンバーから呼吸培地を吸引し、チャンバーにステップ3.7から細胞懸濁液（1×10 6細胞/ ml）の2.1ミリリットルを追加します。 </li><li>ストッパーの挿入によってoxygraph室を閉じます。 </li><li>連続的に37℃のチャンバー内に存在する磁気撹拌棒（700 rpm）を用いて細胞を攪拌し、安定した酸素流量信号が達成されるまで、5〜10分間、細胞呼吸を記録します。 注：酸素濃度と酸素流量信号は、データ収集および分析のためのソフトウェアを用いてコンピュータでオンラインリアルタイムで表示されていますS = &quot;外部参照&quot;&gt; 14。 </li><li>その後、次のプロトコルを使用して、ストッパのチタン注入ポートを介してミトコンドリアの呼吸のための基質と阻害剤を注入します。 </li></ol>呼吸計測によって無傷の細胞における5ジギトニン滴定<ol><li>手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を準備します。 </li><li>注射器を用いてチャンバストッパーのチタン注入ポートを介して細胞懸濁液を含むoxygraph室に0.2 mMのロテノン（0.2μM）「注意」の2μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。 注：以下の手順のすべての注射は注射器を使用してストッパーのチタン注入ポートを介して実行されます。ロテノンの添加は任意である（これは、逆電子流を阻止する）およびジギトニン滴定実験のために省略することができ、参照ステップ6.3。 </li><li> oxygraph室に1 Mコハク酸（10 mM）の20μlのを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。 </li><li> oxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μlのを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。 </li><li> oxygraph室に2mMのジギトニン（2μM）の2μLを注入し、安定した酸素信号が達成されるまで2-5分間細胞呼吸を記録。 </li><li>再びジギトニンoxygraph室に2 mMと2μLを注入し、安定した酸素信号が達成されるまで2-5分間細胞呼吸を記録。 注：細胞へのジギトニンの段階的添加は、細胞の酸素消費量の増加を誘発し、酸素流量信号が増大します。 </li><li>室内への2mMのジギトニン段階的に（2-4μM各ステップ）の2-4μLを注入し続けます。各ステップの後2〜5メートル細胞呼吸を記録安定した酸素流量信号が達成されるまでです。 注：酸素流量信号が最大レベルに到達し、ジギトニンのさらなる注射が呼吸速度を増加させないときジギトニン注入を停止します。読者は自分の試薬および使用を使用して、自分の研究室で最適なジギトニン濃度を決定する必要がありますステップ6.2と彼らの実験のために、以下のプロトコルの7.2で最適なジギトニン濃度を得ました。 </li></ol>シトクロムC：ミトコンドリア外膜インテグリティの6評価<ol><li>手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を準備します。 </li><li>細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を含むoxygraph室に8 mMのジギトニン（8μM）の2μLを注入し、5分間、細胞を透過性。 </li><li> oxygraph室に1 Mコハク酸（10 mM）の20μlのを注入し、携帯respiratを記録安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、5〜10分間イオン。 </li><li> oxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μlのを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。 注：細胞へのADPの添加は、複合体Iを刺激し、酸素消費量の増加を誘発し、酸素流量信号が増加し、安定化するであろう。 </li><li> oxygraph室に4mMのシトクロムc（10μM）の5μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。 </li><li>最後に、4 mg / mlでオリゴマイシン（2 / mlの）の1μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、細胞呼吸を記録。 </li></ol>透過処理したHepG2細胞の7最大ADP-刺激呼吸（状態3） <ol><li>手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を準備します。</li><li>細胞懸濁液を含むoxygraph室に8 mMのジギトニン（8μM）の2μLを注入し、5分間、細胞を透過性。 </li><li>リンゴ酸の0.8 M（5ミリモル）の12.5μlのとoxygraph室へのグルタミン酸の2 M（10 mM）の10μlのを注入します。レコードの細胞呼吸安定した酸素流量信号が達成されるまで。 </li><li> oxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μlのを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。 注：細胞へのADPの添加は、酸素消費量の増加と増加する酸素フラックスシグナルを誘発します。 </li><li> oxygraph室に0.2 mMのロテノン（0.2μM）「注意」の2μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。 </li><li>その後、oxygraph室に1 Mコハク酸（10 mM）の20μlのを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録そして、安定します。 </li><li>そして、oxygraph室に5 mMのアンチマイシンA（5μM）「注意」の2μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。 </li><li>その後、0.8 mMのアスコルビン酸（1ミリモル）の2.5μLを注入し、直後oxygraph室に0.2 mMのTMPD（0.25ミリモル）の2.5μLを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。 </li><li>最後にoxygraph室に1 Mアジ化ナトリウム（5 mM）の「警告」の10μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。 </li></ol>無傷の細胞の8酸素消費量<ol><li>手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を準備します。 </li><li>細胞懸濁液のANを含むoxygraph室に4 mg / mlでオリゴマイシン（2 / mlの）の1μLを注入します安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、細胞呼吸を記録dは。 </li><li>その後oxygraph室にFCCPの0.2 mMの（0.1μM）「注意」の1μLを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。 </li><li> oxygraph室にFCCPの0.2 mMの（0.4μM）の3μLを注入し、さらに酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。 </li><li>その後、酸素流量信号がその最大レベルであり、更なる増加に達するまでoxygraph室に0.2〜1 mMのFCCP（チャンバー内の0.1μM2への最終濃度）の1-3μLを注入することにより、0.1〜0.3μmでステップでFCCPを滴定し、減少を開始します。 注：酸素信号が最大レベルに達すると減少開始時にFCCPを注入停止します。 </li><li>その後、チャンバー内に0.2 mMのロテノンの2μL（0.2μM）および5 mMのアンチマイシンA（5μM）の2μLを注入します。レコード呼吸トンまで彼酸素フラックス信号が減少し、安定化します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

本プロトコルの目的は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力およびミトコンドリア外膜の完全性を測定するための高解像度呼吸計測を使用することでした。 現在のプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。まず、細胞の酸素消費速度は、通常、細胞の数に正規化される（ピコモル/ [セルの秒x個]）。し?...

ミトコンドリアは、特に、アデノシン三リン酸（ATP）を生成するために酸素を使用することにより、細胞エネルギー代謝において重要な役割を果たす。それらは、細胞死を、いくつかのヒト疾患に関与しています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化（OXPHOS）の酸素消費量とATP合成に電子伝達鎖に沿った電子の移動を組み合わせます。ミトコンドリアのトリカルボン酸（TCA）サイクルは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）およびフラビンアデニンジヌクレオチドなどのエネルギーの豊富な化合物（FADH 2）へのタンパク質、炭水化物と脂肪の変換に関与しています。ミトコンドリア内膜に位置NADH及びFADH 2の電子その後（私はIVに）呼吸電子伝達鎖のタンパク質複合体に転写されます。また、他の二つの酸化還元経路は、トランスポート・チェーンを電子するために電子を転送することができた：i）ミトコンドリアの電子伝達フラビンタンパク質（ETF）の内側水戸のマトリックス面に配置されています脂肪酸β酸化からchondrial膜、および消耗品の電子;及びii）ジヒドロキシアセトンリン酸とグリセロホスフェートを酸化及びミトコンドリアの電子伝達鎖に電子を供給するミトコンドリアグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ。複合体IV（​​最終的な電子受容体）は、水2分子に酸素を変換し、一つの酸素分子に電子を転送します。私はIVに呼吸電子伝達鎖複合体からの電子の移動は、ミトコンドリア内膜を横切る電気化学的勾配を確立する間腔へのミトコンドリアマトリックスからのプロトンの流れに結合されています。その後、ミトコンドリア複合体V（ATP合成酵素）が戻ってミトコンドリアマトリックスへの水素イオンを往復し、ATP分子を合成します。 OXPHOS機能を得ることができる種々の技術および種々のミトコンドリアの呼吸状態を用いて、in vivoおよびin vitroで評価することができます。単離ミトコンドリアにおける次respiratoRYの状態を測定することができた：i）基底ミトコンドリア呼吸（状態1）ミトコンドリア呼吸鎖複合体の特異的基質を添加した後、ii）の酸素消費量（状態2）、iii）の最大のミトコンドリアの酸素消費の飽和濃度の添加後アデノシン二リン酸（ADP）（状態3）と、ATPに変換ADP消費（後iv）の安静時の呼吸）（状態4）。無傷の細胞では、次の呼吸の状態を測定することができた：i）基底細胞性酸素消費内在性基質及びADPの存在下で、ⅱ）オリゴマイシンの存在下での基底の細胞の酸素消費量（オリゴマイシン非感受性呼吸）とオリゴマイシン感受性の呼吸（ATPターンオーバー）アンチマイシンAおよびロテノンを添加した後、III）FCCP脱共役呼吸、およびiv）非ミトコンドリア呼吸。透過性細胞、電子伝達系複合体およびADPを添加することができ、最大の複雑な依存性呼吸数秒の特異的基質でUCHのような複雑なI-は、II-およびIV-依存呼吸数を測定することができます。 細胞呼吸の測定は、複合体I-IV、ミトコンドリアの完全性およびエネルギー代謝1、2、3に固有のミトコンドリア呼吸容量重要な洞察を提供しています。高精度、分解能と感度のミトコンドリアの酸素消費量の測定を可能にする装置の一つは、高解像度oxygraph 4です。高解像度oxygraph装置は、注入ポートを有する2つのチャンバを含み、各チャンバはポーラログラフ酸素センサを備えています。携帯電話または単離されたミトコンドリア懸濁液は、呼吸計で連続的に攪拌されています。ミトコンドリア機能を評価するために、ミトコンドリア複合体活性の基質および阻害剤は、標準的なプロトコールに従って添加することができます。基質および阻害剤は、注射INTにより滴定することができますoxygraphのチャンバーO、および酸素消費速度は、ソフトウェアを用いて計算し、細胞数当たり毎秒ピコモルとして表されます。高解像度の呼吸計測は、感受性の増加や、無傷または透過性細胞のような生物学的サンプル数が少ないと連携する機能など、伝統的な従来のポーラログラフ酸素電極装置に比べていくつかの利点を提供しています。さらに、各デバイスは、2つのチャンバを含み、呼吸数、酸素濃度の比較のために同時に記録することができます。高解像度oxygraphは、従来のポーラログラフィー酸素電極装置に比べ機器室からの酸素の減少漏れの利点を有します。最近、細胞の酸素消費量を測定するために開発された他の装置は、96ウェルの細胞外フラックス分析器5です。細胞外フラックスアナライザーは、蛍光の代わりにポーラログラフセンサーが装備されています。細胞外の利点高解像度oxygraph Iである）は、II）は、24とハイスループットスクリーニングのために96ウェルプレート中に酸素消費量を測定することが可能であり、大部分が自動化されたデバイスであると比べてフラックス分析器は、従って、生物学的サンプルの低い量を必要とします及びiii）細胞の解糖フラックスの追加の測定が可能です。高解像度oxygraphと比較して細胞外フラックスアナライザーの欠点は、i）は、非再利用可能であり、装置のと、蛍光プレートなどの消耗品のコスト高、であり、およびii）アッセイ/ウェル当たりのみ4つの化合物は、注射可能です、したがって、システムは、基板脱共役剤 - 阻害剤滴定プロトコルのための現実的ではありません。 本研究では、我々は、ミトコンドリア呼吸を決定するために、高解像度の呼吸計測を使用します。細胞の酸素消費量の実験のために、細胞をCOMPLEXEに電子を供給するための外因性ADPおよび被酸化性ミトコンドリア基質の進入を可能にするために透過処理されています呼吸器系のS。このアプローチは、無傷の細胞（多くの基質が細胞非透過性である）に比べて明確な利点である個々のミトコンドリア複合体の呼吸能力の解剖を可能にします。しかし、細胞膜の透過性は、細胞外培地で平衡化され、サイトゾルおよび細胞外空間とメディア（サイトゾル溶質から洗い出さ）と細胞内空間の組成物との間の障壁を破壊します。無傷の細胞上の透過性細胞の欠点の一つは、洗浄剤の過剰量は、細胞透過の際に使用される場合、ミトコンドリア外膜が損傷することができることです。無傷細胞において、基礎、結合および無傷の細胞の脱共役呼吸を測定することができます。この方法は、統合された細胞中の呼吸機能を再現し、また、最大のミトコンドリア電子transpoに関する情報を提供する、外因性の基質およびADPを添加せずに無傷の細胞の酸素消費量を評価しますRT容量6、7。透過性細胞上無傷の細胞の利点の一つは、細胞環境が破壊されておらず、ミトコンドリアは、細胞の全構成要素に接触していることです。細胞の原形質膜を透過するために、例えば、ジギトニンなどの界面活性剤は、8使用されています。ジギトニンの過剰な量が使用される場合は、ミトコンドリア外膜の完全性が損なわれる可能性があります。透過性細胞で損なわれないミトコンドリア外膜の完全性を確認するために、ジギトニン滴定は、細胞透過性のための最適濃度を決定するために行われます。これらの実験のために、細胞を、呼吸培地中に再懸濁し、ジギトニン濃度は、ミトコンドリアの基質及びADPの存在下での呼吸計測により滴定され、呼吸速度を測定します。無傷の、非透過性細胞の呼吸はmitochoの存在下で刺激されていませんndrial基板とADP。しかし、その後の段階的なジギトニン滴定は、原形質膜の漸進的な透過性をもたらすであろうし、最適なジギトニン濃度が得られます。これは、完全な透過への呼吸までの増加により示されています。ミトコンドリアの品質と外膜の完全性は、外因性のシトクロムc 2,9を追加することによって確認することができます。シトクロムcは、ミトコンドリア電子伝達系10、11、12の12 kDaの電子運搬タンパク質です。これは、複合体IVへの複合体IIIから電子を運ぶ、ミトコンドリアの膜間空間に局在し、酸素消費に関与しています。ミトコンドリアの外膜が損傷されると、シトクロムcが放出され、ミトコンドリアの酸素消費量が低減されます。外因性のシトクロムcの添加時に、ミトコンドリアの呼吸の任意の増強は、指標となりますミトコンドリア外膜を破壊しました。 透過処理した細胞では、ミトコンドリア複合体活性の基質および阻害剤は、さまざまなプロトコル3、9以下の追加されます。例えば、ミトコンドリア複合駆動型呼吸率を調べるために、以下のプロトコルを使用することができます。細胞の透過処理した後、最初の複合体Iは呼吸鎖の基質としてNADHを生成し、その後、ADPがATP（状態3、アクティブに変換するために追加された複雑なIの活性化を引き起こす基板リンゴ酸およびグルタミン酸によって刺激され、複合体I-依存呼吸）。安定した信号が到達した後、ロテノンは、（ミトコンドリア複合体I阻害剤）ロテノンはFADH 2にコハク酸が続いている複雑なIを阻害するために、複雑なII（状態3、活性複合体II依存呼吸）を活性化するために投与されます。複雑なIV-依存呼吸を測定するために、最初の複合体III依存性呼吸は、アンチマイシンA（ミトコンドリア複合体III阻害剤）を添加することにより阻害されます。その後、複雑なIV-依存呼吸はアスコルビン酸とtetramethylphenylendiamine（TMPD）を投与することにより刺激されます。 TMPDは、呼吸バッファーで自動酸化することができ、したがって、最大錯体IV依存性の呼吸速度（状態3）のアジ化ナトリウム、ミトコンドリア複合体IVの阻害剤の添加前および後の呼吸速度を減算することにより計算されます。呼吸実験は、コントロール（非刺激細胞）としてパラレル一oxygraphの二つのチャンバ、刺激された細胞を含む、他の中で行うことができます。明らかに、細胞は、それらの酸素消費はoxygraph室で測定される前に薬剤が、ミトコンドリアの機能に影響を与えて、 例えば 、様々な方法で前処理することができます。このプロトコルは、個々のミトコンドリア呼吸鎖複合体の機能的な検査を可能にします。また、一方が最大のADP刺激性を測定することができます透過性細胞の呼吸（状態3）、パルミチン酸の形で外因性の脂肪酸を用いて。 （1：1のモル比のパルミテート：BSA 6）このプロトコルでは、パルミチン酸ナトリウムの濃縮ストックを超脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン（BSA）と結合しています。その後、最初のジギトニンとミトコンドリアの呼吸で浸透している細胞はカルニチンを添加することによって評価され、ADP（状態3、最大呼吸）を添加したパルミチン酸。そして、オリゴマイシン、状態4（状態40）を模倣するために追加され、呼吸調節比（RCR値）状態3 /状態40のように計算されます。 β酸化が（TCAサイクルに入る）アセチル-CoAの産生およびFADH 2及びNADHの生成を促進するの電子は、電子伝達フラビンタンパク質及びβヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼによって電子伝達鎖に渡されます。ミトコンドリア脂肪酸代謝の中心であり、パルミチン酸-BSAプロトコルを記載する脂肪を調べる研究者によって使用することができTY酸酸化。無傷細胞において、活性化剤およびミトコンドリア複合体活性の阻害剤は、異なるプロトコル6、9以下を添加します。これらの実験のために、外因性基質の非存在下での非透過性細胞の第1の酸素消費量は、（呼吸速度をリン酸化）を測定します。そして、非リン酸化呼吸数は、ミトコンドリアATP合成酵素の阻害剤であるオリゴマイシンの添加後に測定します。その後、プロトノフォアカルボニルシアニドp型trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）を種々の濃度で投与され、最大のミトコンドリアの脱共役呼吸数を測定します。例えば、FCCPとしてProtonophoresは化学浸透勾配を放散するプロトンの受動的な動きを可能にする、内膜のプロトン透過性の増大を誘導することができます。プロトン透過性の増加は、酸化呼吸（無ATP産生）を脱共役し、Oの増加を誘導しxygen消費。その後、ロテノン及びアンチマイシンAは、ミトコンドリア呼吸を阻害するために添加され、そして非ミトコンドリア呼吸は、他のすべての呼吸数から減算されます。 酸素消費速度は、IO 2 [ピコモルX秒-1×10 -6細胞（閉酸素室で）体積固有の酸素フラックスを割ることによって計算される（細胞百万個当たりの酸素の流れ）、JV、Oのように表すことができます。細胞チャンバ内の細胞濃度（体積当たりの細胞数[10 6細胞∙ミリリットル1]）15によって2 [ピコモルのx秒-1のxミリリットル-1]。細胞質量固有の酸素フラックス、JO 2 [X秒ピコモル-1 Xミリグラム-1]は、セル当たりの流れ、IO 2 [ピコモルのx秒-1×10 -6細胞】細胞当たりの質量で割った、[MG∙10 6セル];または体積固有フラックス、JV、O 2 [ピコモルのx秒-1のxミリリットル-1]、体積当たりの質量で割った値梅【MG∙ミリリットル1]。 JO 2は、細胞タンパク質、乾燥重量または細胞体積あたりの酸素流量です。 高解像度の呼吸計測を用いた本研究では、我々は私を決定するためのプロトコルを記述）は、完全な携帯形質膜透過性（ジギトニン滴定アッセイ）のための最適なジギトニン濃度、外因性のシトクロムcを用いて、ⅱ）ミトコンドリア外膜の完全性、iii）はミトコンドリア呼吸鎖複合体I外因性基質を添加することなく、外因性ADPとミトコンドリア呼吸鎖基質、および無傷の細胞のiv）の基礎、結合され、最大の脱共役呼吸（最大電子輸送容量）の存在下でのジギトニン透過処理HepG2細胞における、IIおよびIV最大呼吸数そしてADPは、統合された細胞内の呼吸機能を再現します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="415">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">ADP</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 4386</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 8674</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:156px;">Ascorbate</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.00127</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">BSA</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 6003</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">FCCP</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">C 2920</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:75px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;">Automated cell counting instrument</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Cytochrome c</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">C 7752</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Digitonin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">D 5628</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">31966021</td>
			<td style="width:92px;">Medium</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">EGTA</td>
			<td style="width:92px;">fluka</td>
			<td style="width:75px;">3779</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">FBS</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">26010-074</td>
			<td style="width:92px;">Medium component</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Glutamate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma,</td>
			<td style="width:75px;">G 1626</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Hepes</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">H 7523</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">KCl</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.04936</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.04873</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">K-lactobionate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">L 2398</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">MgCl2</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">M 9272</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:75px;">10000-02</td>
			<td style="width:92px;">High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">O 4876</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">15140122</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">S2002</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Rotenone</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">R 8875</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Succinate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">S 2378</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Taurine</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">T 8691</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">TMPD</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">T 3134</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td>T 4674</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

ジギトニン滴定実験：携帯透過処理のための最適なジギトニン濃度の決意ジギトニン滴定は、HepG2細胞の透過化のための最適濃度を決定するために行われます。これらの実験のために、ジギトニンがロテノン、コハク酸（ミトコンドリア複合体II基板）とADPの飽和量の存在下で無傷の細胞中で滴定され、呼吸数、ベースライ?...

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透過処理された細胞および無傷細胞のミトコンドリア機能を評価するための高解像度呼吸測定 |生物学 |ビデオ

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

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41.2K ビュー.  University of Bern. 高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。 

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A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.
Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function18. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust14. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis9. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.
Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay7, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process 4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.
A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal6. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.
The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity8,15,16,17.
In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE8 in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO2, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Mitochondrial fusion was measured by tracking the equilibration of photoconverted matrix-targeted GFP across the mitochondrial network over time. Thus far, only one cell could be subjected to an hour long kinetic analysis at a time. We present a method that simultaneously measures multiple cells, thereby speeding up the data collection process.

並列共焦点顕微鏡を使用して複数のセルの動力学的データの取得の高速化、高解像度、MTPA-GFPベースのミトコンドリア融合アッセイ

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

生物学

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

ゼブラフィッシュ幼生における筋機能を評価するために、収縮時の力測定

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

ミトコンドリアの構造と機能の研究に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵巣

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or enzymes are involved in the pathogenesis of several diseases. Mitochondrial substrate flux can be studied using intact cells, permeabilized cells, or isolated mitochondria. Investigating intact cells encounters several problems due to simultaneous oxidation of different substrates. Besides, several cell types contain internal stores of different substrates that complicate results interpretation. Methods such as mitochondrial isolation or using permeabilizing agents are not easily reproducible. Isolating pure mitochondria with intact membranes in sufficient amounts from small samples is problematic. Using non-selective permeabilizers causes various degrees of unavoidable mitochondrial membrane damage. Recombinant perfringolysin O (rPFO) was offered as a more appropriate permeabilizer, thanks to its ability to selectively permeabilize plasma membrane without affecting mitochondrial integrity. When used in combination with microplate respirometry, it allows testing the flux of several mitochondrial substrates with enough replicates within one experiment while using a minimal number of cells. In this work, the protocol describes a method to compare mitochondrial substrate flux of two different cellular phenotypes or genotypes and can be customized to test various mitochondrial substrates or inhibitors.

In this work, we describe a modified protocol to test mitochondrial respiratory substrate flux using recombinant perfringolysin O in combination with microplate-based respirometry. With this protocol, we show how metformin affects mitochondrial respiration of two different tumor cell lines.

組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

要約

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