私たちは、シャペロンアッセイの彼女の有益な助言のために博士クラウディアCremersに感謝します。ケン・ワンはHdeB精製における彼の技術支援のために認められています。この作品は、ドイツ研究財団（DFG）が提供するポスドク研究フェローシップでサポートされている（航空局へ）ハワード・ヒューズ医学研究所と航空局とUJJ-UDへの健康助成金RO1 GM102829の国立研究所によってサポートされていました。

ペリプラズムHdeBの1発現および精製注：HdeBはEに発現していました大腸菌細胞はプラスミドpTrc- hdeB 10、およびポリミキシン溶解時のペリプラズムから精製を保有。 <ol><li> E.の一晩培養物を準備します200 / mlのアンピシリン（LB アンプ）を含有する 30ミリリットルのLB中でプラスミドpTrc- hdeB 10を保有する 大腸菌細胞。 LB アンプ 4つの1リットル培養物を接種し、0.7のOD 600nmまでに達するまで37℃、200rpmでそれらを成長させます。そして、HdeBの発現を誘導し、30℃の成長温度を低下させるために300μMのIPTGを加えます。 </li><li> 30℃でのタンパク質の発現の5時間後、4℃で5分間、8,000×gでの遠心分離によって細胞を回収。 </li><li> 100で細胞ペレットを4℃で5分間、8,000×gで再び細胞を（50 mMトリス/塩酸、50mMのNaCl、pH7.5）で遠心バッファmlの洗浄。 </li><li>その後、再懸濁80で細胞ペレットは、ML 1mg / mlのポリミキシン硫酸塩を含む、緩衝液。外膜の効率的な破壊のために、穏やかに4°Cで1時間サスペンションをかき混ぜます。 </li><li>細胞質画分と細胞破片を除去し、4℃で15,000×gで20分間、懸濁液を遠心します。これは、可溶性HdeBを含む〜60ミリリットルの上清になります。 </li><li> 6 kDaのMWを持つ透析膜を用いて緩衝液B（20mMトリス/塩酸、0.5mMのEDTA、pH8.0）を150倍体積に対して一晩ペリプラズム抽出物を含む上清を透析カットオフ。 3キロダルトンの分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを使用して、15 mlのタンパク質を濃縮します。 0.2μmの細孔フィルターを使用して、タンパク質溶液をフィルタリングします。 </li><li> 2.5ml /分の流速で5カラム容量の緩衝液Bで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（カラム体積5ml）中にタンパク質を適用します。タンパク質をカラムにロードされると、10分のための緩衝液Bでカラムを洗浄します2.5ml /分の流速。 2.5ml /分6の流量で50分の期間にわたって緩衝液B中の0.5 M NaClの0からの直線勾配で溶出HdeB。 </li><li> 15％SDS-PAGEを使用してHdeBを含む画分を特定します。 5μlの5倍還元SDSローディング緩衝液と20μlのサンプルを混ぜます。負荷10μlのゲル上及びトリス - グリシン緩衝液（14.4グラム/ Lグリシン2.9グラム/ LのTris、を1g / Lのドデシル硫酸ナトリウム、pHが8.3）で実行します。ブロモフェノールバンドがゲル（〜45分）の底に近い移動するまで、150Vでゲルを実行します。 </li><li>プールのすべてのHdeB含有画分、4 L HdeB貯蔵緩衝液に対して4℃で一晩透析（50mMトリス/塩酸、200mMのNaCl、pH8.0）に、および分子量遠心分離フィルターユニットを用いて、約300μMにタンパク質を集中3キロダルトンのカットオフ。吸光係数εの280nmの = 15595 Mを使用して280nmでHdeBの濃度を決定-1 cm -1 で 。 100μlのアリコートとフラッシュフリーの準備液体窒素でアリコートをZE。 注：HdeBは、少なくとも6ヶ月間-70℃で保存することができます。 </li></ol> 2.シャペロン活性アッセイリンゴ酸脱水素をアンフォールディング熱の使用（MDH） 注：下記のように熱的に異なるpH値でのブタのミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素（MDH）のアンフォールディングの凝集で精製HdeBの影響をモニターしました。リストされたすべてのタンパク質濃度は、モノマー濃度を参照してください。 <ol><li> 、MDHを準備4 LバッファーC（50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5）に対して4℃で一晩MDHを透析し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約100μMにタンパク質を濃縮しますkDaの。 注：MDHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されるようMDHの慎重な透析が必要となります。 </li><li>凝集物を除去するために、4℃、20,000×gで20分間、タンパク質を遠心します。 ε（280nmでの吸光度によってMDH濃度を決定します&lt;サブ&gt; 280ナノメートル= 7,950 M -1 cm -1で）。 50μlのMDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。 </li><li>温度制御サンプルホルダー、撹拌機を備えた蛍光分光光度計に1ミリリットルの石英キュベットを置きます。 350 nmのλEX /全角を設定します 。 </li><li>キュベットとセットに：（pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ）は、所望のpH値で予め温めた（43℃）緩衝液D（150 mMリン酸カリウム、150mMのNaCl）の適切なボリュームを追加します。 43℃にキュベットホルダーの温度。総容量1000μlです。 </li><li> 0.5μMMDHを添加し、バッファ12.5μMHdeB（またはバッファ制御用HdeB記憶バッファの代わりに同量）を加えます。光散乱の監視を開始。 MDHの展開十分可能にするために360秒間の反応をインキュベートします。 </li><li> 2 MバッファなしのK 2 HPO 4の0.16から0.34容量を追加することによって、pHを7に上げ、再続けます別の440秒間光散乱をコーディング。 </li><li>中和後に定義された時点におけるシャペロンの非存在下で記録されたMDH凝集の程度を設定し、100％の（ここではMDHの最大光散乱が観察された500秒後）。各示されたpH値でHdeBの非存在下におけるMDHの光散乱信号にHdeBの活動を正常化します。 </li></ol>分析超遠心（AUC）によるHdeB-LDH複合体形成の3検出注：HdeB単独で又は熱的に乳酸脱水素酵素（LDH）の展開との複合体の沈降速度実験は、分析用超遠心を用いて行きました。 <ol><li> 4 LバッファーC（50mMリン酸カリウム、50mMのNaCl、pH7.5）に対して4℃で一晩LDHを透析、LDHを調製し、30の分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて、約200μmでタンパク質を濃縮しますkDaの。 注：LDHの慎重な透析をLDとして必要とされていますHは、硫酸アンモニウム溶液として提供されます。 </li><li>骨材、4℃20,000×gで20分間遠心分離LDHを削除します。 280nmでの吸光度によってLDH濃度を測定（ε280nmで = 43680 M -1 cm -1 で ）。 50μlのLDHのアリコートとストレージ用フラッシュ凍結アリコートを準備します。 </li><li> 41℃で15分間（それぞれpHは4と7、）バッファーDで30μMHdeBの存在下および非存在下で3μMのLDHをインキュベートします。 注：その完全な凝集のより高い温度の結果でLDHのインキュベーション、およびHdeBの無シャペロン効果を観察することができます。 </li><li>サンプルは室温まで冷却してみましょう。次に、標準的なセクターを含む細胞への負荷サンプルを1.2センチ路長と2チャンネルのセンターピースを形。超遠心分離機に細胞をロードし、前の沈降に少なくとも1時間、22℃に平衡化。 </li><li> 22°Cと12時間それぞれのローター中で167,000×gでスピンサンプル、SEDを監視連続して280 nmでのタンパク質のimentation。以前に実証されているように、各チャネルの透過光強度はなく吸光度より測定した場合、信号対雑音比が改善されます。これはまた、後続のデータフィッティングの品質を向上させます。 </li><li>連続C（s）は分布モデル17を使用して、SEDFIT（バージョン15.01b、2015年12月）でのデータ分析を行います。 SEDFITを使用する方法を記述したチュートリアルでは、参照18で見つけることができます。 <ol><li> 0.7 ME（最大エントロピー）正則の信頼レベルを設定します。 </li></ol></li><li> SEDNTERP 19を使用して、バッファ密度だけでなく、粘度を計算します。凝集したクライアントタンパク質の量を推定するために、参照としてpH7にpHを4に沈降LDHの積分を比較します。 注：沈降分布プロットの統合はSEDFITで直接行うことができます。沈降速度データを分析するための代替ソフトウェアは、最近のレビュー20に記載されています。&lt;/李&gt; </ol> HdeBの存在下での4モニタリングMDH不活性化と再活性化注記：pHを展開MDHのリフォールディングで精製HdeBの影響を中和時MDH活性をモニターすることによって決定しました。 <ol><li> 25μMHdeBの存在下または非存在下で37℃で1時間：（pHは2.0、pHは3.0、pHは4.0、およびpH 5.0ここ）は、所望のpH値でバッファDで1μMMDHをインキュベートします。その後、10分間、20℃まで温度をシフトします。 注：MDHは37℃より高い温度でインキュベートしたときにMDHのリフォールディングをもHdeBの存在下では観察されませんでした。 </li><li>酸変性MDHのリフォールディングを開始するために、0.5 Mリン酸ナトリウム、pH8.0の0.13から0.42の体積の添加によってpH7に試料を中和します。 </li><li> 20℃で2時間インキュベートした後、340nmの9におけるNADHの減少をモニターすることによってMDH活性を決定します。 注：MDHはL-リンゴにオキサロ酢酸のNADH依存性還元を触媒します。 <oL&gt; <li>アッセイ緩​​衝液950μL（50 mMリン酸ナトリウム、pH 8.0、1mMのオキサロ酢酸、および150μMNADH）とのインキュベーション反応液50μlを混合します。 注：アッセイ緩​​衝液中MDHの最終濃度は44 nMであるべきです。 </li><li> 20℃に設定し、ペルチェ温度制御ブロックを備えた分光光度計を用いて吸光度の変化を監視します。 </li><li> pHを7.0に維持してきた44 nMのネイティブMDHにMDH活性の相対を報告します。 </li></ol></li></ol> E.上HdeB過剰発現の5効果酸ストレス下での大腸菌の生存注：E.大腸菌 MG1655のゲノムDNAは、公表されたプロトコル21を用いて単離しました。 <ol><li> E.からhdeBを増幅プライマーhdeBを用いたPCRによるコリ MG1655 - のBamH I-REV GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATTとhdeB - のEcoR I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. </li><li>次のように50μl中のPCR反応を設定します：10μlの5×ポリメラーゼバッファー、ゲノムDNA MG1655、0.5μlのDNAポリメラーゼngを、200μMのdNTP、0.5μMのプライマーJUD2、0.5μMプライマーJUD5、150は、50μlにのddH 2 Oを追加します。 </li><li>ステップ1：以下のようhdeBの増幅を行い、95℃、1サイクルで5分。ステップ2：95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃、40サイクルで30秒間。ステップ3：72℃で10分間。 </li><li>制限部位のクローニングのための標準的な方法を用いてプラスミドpBAD18のをEcoR IとのBamH I部位にPCR断片を得られたクローン。製造業者の説明書に従って、プラスミド精製キットを用いてプラスミドを精製します。シークエンス10によって得られたプラスミドを確認します。 </li><li> 、λ - - 、E14 - 、[araD139] B / R [F：株BB7224（ΔrpoH）（遺伝子型にHdeBまたは空ベクター対照pBAD18を発現するプラスミドをトランスフォーム6;（ARGF-LAC）169 flhD5301Δ（fruK-yeiR）725（fruA25）relA1 rpsL150（SM R）rbsR22Δ（fimB-FIME）632（:: IS1）ptsF25 zhf :: Tnの10（TC S）suhX401 deoC1 araDを + rpoH ::館 +; 16）化学的コンピテント細胞を用いました。 注：この株は温度感受性です。 </li><li> 45秒42℃で熱ショック前めっきした後、30℃、200 rpmで細胞を培養します。陽性クローンの単一コロニーストリークアウトを実行し、30℃で一晩インキュベートします。 50ミリリットルのLB アンプで一晩培養を準備し、200rpmで、30℃で細胞を培養。 </li><li>一晩培養物を25 mlのLB アンプに40倍に希釈し、HdeBタンパク質発現を誘導するために30℃、ODを600nmで 200 RPM = 1.0で0.5％アラビノース（ARA）の存在下で細菌を増殖します。 </li><li> pHシフトの実験のために、LBを使用アンプ+アラ0.5のOD 600nmまでに細胞を希釈し、（ここではpHは2.0、pHが3.0、およびpH 4.0）それぞれのpH値に調整して5 M HClを適切なボリュームを追加することによって。 </li><li>示された時点（; pHは3、2.5分; pHは2、1分pHは4、30分）した後、5 M NaOHを適切な容量の添加により培養液を中和します。 </li><li> OD測定値を用いて30℃で12時間培養液中の中和培養物の増殖を監視します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

<html>活性化およびHdeBのシャペロン機能のメカニズムを研究するために、HdeB大量に発現させ、精製しなければなりません。発現ベクター系の数は、この研究で使用した両方ともたpTrcかのpBADベクターを含む、標的タンパク質の高レベルの産生のために利用可能です。プロモーターはE.のために容易にアクセス可能ですコリ RNAポリメラーゼ、したがって、任意のEにHdeBの強い?...

微生物病原体は、酸誘発タンパク質アンフォールディング状態を経験する一般的な自然環境は、その酸性pH食品媒介病原体1に対する有効な障壁として機能する哺乳動物の胃（pH範囲1-4）、です。アミノ酸側鎖のプロトン化に起因するタンパク質のアンフォールディング及び凝集は、生物学的プロセス、損傷細胞構造に影響を与え、最終的に細胞死1,2を引き起こします。細菌のペリプラズムのpHは多孔性の外膜を通過するプロトンの自由拡散にほぼ瞬時に環境pHと平衡するので、グラム陰性細菌のペリプラズムと内側の膜タンパク質は、酸ストレス条件3の下で最も脆弱な細胞成分です。急速な酸の仲介による損傷に対する彼らのペリプラズムプロテオームを保護するために、グラム陰性菌は、酸活性化ペリプラズムシャペロンHdeAとHdeBを利用します。 HdeAは条件付きで無秩序シャペロンであります<sup&gt; 4,5：中性pHでは、HdeAは折り畳まれ、シャペロン不活性な二量体として存在します。 pHが3以下のpHシフトの際に、HdeAのシャペロン機能は、6,7を速やかに活性化されます。 HdeAの活性化は、その単量体への解離、およびモノマー6-8の展開部分を含む深刻な構造変化を、必要とします。一旦活性化されると、HdeAは酸性条件下で展開するタンパク質に特異的に結合します。これは、効果的に低pHでのインキュベーションの間だけでなく、pHを中和時に両方の彼らの凝集を防ぐことができます。 pHを7.0に復帰する、HdeAはATP非依存的にそのクライアントタンパク質のリフォールディングを促進し、その二量体、シャペロン不活性なコンフォメーション9に戻って変換されます。同様に、相同的シャペロンHdeBもシャペロン不活性をpH7.0です。 HdeAとは異なり、HdeBのシャペロン活性は、pH4.0のHdeBが依然として大きく折り畳ま10ダイマーされる条件を、その見かけの最大値に達します。また、さらにpHがコーを下げますHdeBの不活化エス。これらの結果は、それらの広範な相同性にもかかわらず、HdeAとHdeBが彼らの保護シャペロン機能を有する広いpH範囲をカバーすることを可能にする機能的活性化のそれらのモードで異なることを示唆しています。 E.の耐酸性に関与している一つの他のシャペロン大腸菌は中立状態が復元されるまで、折り畳まれていないクライアントタンパク質を安定化させるために表示される、細胞質Hsp31です。 Hsp31の正確な作用モードは、しかし、12謎のままです。このようなサルモネラなどの他の腸内細菌がhdeABオペロンを欠いていることを考えると、他のまだ正体不明のペリプラズムのシャペロンはこれらの細菌11の耐酸性に関与していることが存在するかもしれない可能性が非常に高いです。 ここに提示プロトコルは、 インビトロおよびインビボ10 HdeBのpH依存シャペロン活性を監視することを可能にし、他のシャペロンを調査するために適用することができますHsp31など。あるいは、hdeABの発現を制御する転写因子の複雑なネットワークは、潜在的に、インビボでの応力アッセイにより調べることができます。 インビボでのタンパク質のシャペロン機能を特徴づけるために、異なる実験のセットアップを適用することができます。一つの経路は、タンパク質アンフォールディングストレス条件を適用して表現型のいずれかは、対象の遺伝子を過剰発現または遺伝子の欠失を担持する変異株を特徴付けることです。プロテオミクス研究はシャペロンが存在する場合、ストレス条件下で凝集体はもはやそのタンパク質を同定しないように実施することができる、または特定の酵素に対するシャペロンの影響は、酵素アッセイ14〜16を用いてストレス状態の間に決定することができます。本研究では、すべての主要なEの発現を制御するRpoH熱ショックシグマ因子32を欠いているrpoH欠失株でHdeBを過剰発現することを選びました大腸菌のシャペロンとその削除はSENSを増加することが知られています15のタンパク質のアンフォールディングを引き起こす環境ストレス条件にitivity。 HdeBのインビボシャペロン活性をΔrpoH株のpH感受性を抑制する能力をモニターすることによって決定しました。要するに、ここで紹介するプロトコルは、in vitroならびに in vivoでのコンテキストで酸活性化シャペロンの活性を特徴づけるための迅速かつ簡単な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>NEB10-beta &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth mix, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Polymyxin B sulfate&amp;nbsp;</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td>100565</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m pore sterile Syringe Filter</td><td>Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td><td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>Malate dehydrogenase (MDH)</td><td>Roche</td><td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (Monobasic)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (Dibasic)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 fluorescence spectrophotometer</td><td>Hitachi</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>Oxaloacetate</td><td>Sigma</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>Lactate dehydrogenase (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>&lt;a href=&#039;https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&amp;amp;_windowLabel=UCM_RENDERER&amp;amp;_urlType=render&amp;amp;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/&#039;&gt;392764&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td><td>Beckman Coulter</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep Kit</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Cell cuvette</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 50 spectrophotometer</td><td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

細菌は、しばしば、このようなpHの変化、温度、酸化還元状態、露光又は機械力などの環境の変化にさらされています。これらの条件の多くは、細胞内のタンパク質のアンフォールディングを引き起こし、生物の生存に有害な影響を与えます。無関係な、ストレス特異的分子シャペロンのグループは、これらのストレス条件の生存に不可欠な役割を果たすことが示されています。完全に折り畳まれてシャペロン非アクティブなストレスの前にしながら、これらのタンパク質は急速に展開し、特定のストレス条件下でシャペロン活性になります。一度これらの条件付きで無秩序シャペロンは異なる凝集しやすい多数のタンパク質に結合し、活性化し、その凝集を防止し、直接または間接的に非ストレス状態への復帰時にリフォールディングタンパク質を容易にします。それらの活性化とクライアントの認識のメカニズムについてのより詳細な理解を得るための第一のアプローチは、精製およびsubsequenを伴いますインビトロシャペロンアッセイを使用して、これらのタンパク質のTの特徴付け。 生体内ストレスアッセイにおけるフォローアップ独立インビトロの結果で得られたことを確認することが不可欠です。 このプロトコルは、Eのシャペロン活性を特徴づけるために、in vitroおよびin vivoの方法で説明し大腸菌 HdeB、酸活性化シャペロン。光散乱測定は、インビトロで 、確立されたモデルのクライアントタンパク質、MDHの酸誘発性の凝集を防止するHdeBの能力のための便利な読み出しとして使用しました。分析超遠心分離実験は、非ストレス状態への復帰時のクライアントタンパク質の運命に光を当てるために、HdeBとそのクライアントタンパク質のLDHとの間の複合体形成を明らかにするために適用しました。クライアントタンパク質の酵素活性アッセイは、pHによって誘発されるクライアントの不活性化および再活性化にHdeBの効果をモニターするために行きました。最後に、生存研究はmonitoするために使用されましたin vivoでの HdeBのシャペロン機能の影響をrを。

HdeAとHdeBは、E相同であります酸ストレス条件10に対してペリプラズムタンパク質を保護することが知られている大腸菌タンパク質。私たちの仕事は、HdeAと同様に、HdeBはまた、分子シャペロンを活性化酸として機能することを明らかにしました。しかし、まだ潜在的に殺菌が、HdeA 6,9,10,22の最適pHよりも有意に高いpHでHdeA、HdeB機能とは対?...

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Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

detection-ph-dependent-activity-escherichia-coli-chaperone-hdeb-vitro

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

10.3K ビュー.  University of Michigan. この研究は、酸性pH条件下で大腸菌 HdeBのシャペロン活性を特徴づけるために、生物物理学的生化学的および分子技術を説明しています。これらのメソッドは、成功し、このようなHdeAなどの他の酸保護シャペロンに適用されており、他のシャペロンとストレス条件のために働くように修正することができます。 

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

生化学

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting of two copies of the core histones H2A, H2B, H3, and H4, wrapped around by the DNA. The octamer is composed of two copies of an H2A/H2B dimer and a single copy of an H3/H4 tetramer. The highly charged core histones are prone to non-specific interactions with several proteins in the cellular cytoplasm and the nucleus. Histone chaperones form a diverse class of proteins that shuttle histones from the cytoplasm into the nucleus and aid their deposition onto the DNA, thus assisting the nucleosome assembly process. Some histone chaperones are specific for either H2A/H2B or H3/H4, and some function as chaperones for both. This protocol describes how in vitro laboratory techniques such as pull-down assays, analytical size-exclusion chromatography, analytical ultra-centrifugation, and histone chaperoning assay could be used in tandem to confirm whether a given protein is functional as a histone chaperone.

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

This protocol describes a battery of methods that includes analytical size-exclusion chromatography to study histone chaperone oligomerization and stability, pull-down assay to unravel histone chaperone-histone interactions, AUC to analyze the stoichiometry of the protein complexes, and histone chaperoning assay to functionally characterize a putative histone chaperone in vitro.

インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. Biomolecules such as proteins, carbohydrates, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and enzymes are fundamental building blocks of living beings; they assemble into complex networks in biosystems to synchronize a myriad of life events. Proteins typically utilize complex interactome networks to carry out their functions; hence it is mandatory to evaluate such interactions to unravel their importance in cells at both cellular and organism levels. Toward this goal, we introduce a rapidly emerging technology, field-effect biosensing (FEB), to determine specific biomolecular interactions. FEB is a benchtop, label-free, and reliable biomolecular detection technique to determine specific interactions and uses high-quality electronic-based biosensors. The FEB technology can monitor interactions in the nanomolar range due to the biocompatible nanomaterials used on its biosensor surface. As a proof of concept, the protein-protein interaction (PPI) between heat shock protein 90 (Hsp90) and cell division cycle 37 (Cdc37) was elucidated. Hsp90 is an ATP-dependent molecular chaperone that plays an essential role in the folding, stability, maturation, and quality control of many proteins, thereby regulating multiple vital cellular functions. Cdc37 is regarded as a protein kinase-specific molecular chaperone, as it specifically recognizes and recruits protein kinases to Hsp90 to regulate their downstream signal transduction pathways. As such, Cdc37 is considered a co-chaperone of Hsp90. The chaperone-kinase pathway (Hsp90/Cdc37 complex) is hyper-activated in multiple malignancies promoting cellular growth; therefore, it is a potential target for cancer therapy. The present study demonstrates the efficiency of FEB technology using the Hsp90/Cdc37 model system. FEB detected a strong PPI between the two proteins (KD values of 0.014 &#181;M, 0.053 &#181;M, and 0.072 &#181;M in three independent experiments). In summary, FEB is a label-free and cost-effective PPI detection platform, which offers fast and accurate measurements.

Field-effect biosensing (FEB) is a label-free technique for detecting biomolecular interactions. It measures the electric current through the graphene biosensor to which the binding targets are immobilized. The FEB technology was used to evaluate biomolecular interactions between Hsp90 and Cdc37 and a strong interaction between the two proteins was detected.

電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンHsp90とそのクライアントプロテインキナーゼCdc37との生体分子相互作用の探索

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

大腸菌 dnaK756細胞を用いたHsp70シャペロン活性の評価

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

著者スポットライト:マラリアおよび結核感染症における熱ショックタンパク質の探索

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Intracellular Refolding Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds with inhibitory/stimulating activity. Molecular chaperones are proteins involved in regulation of protein folding1 and have a crucial role in promoting cell survival upon stress insults like heat shock2, nutrient starvation and exposure to chemicals/poisons3. For this reason chaperones are found to be involved in events like tumor development, chemioresistance of cancer cells4 as well as neurodegeneration5. Design of small molecules able to inhibit or stimulate the activity of these enzymes is therefore one of the most studied strategies for cancer therapy7 and neurodegenerative disorders9. The assay here described offers the possibility to measure the refolding activity of a particular molecular chaperone and to study the effect of compounds on its activity. In this method the gene of the molecular chaperone investigated is transfected together with an expression vector encoding for the firefly luciferase gene. It has been already described that denaturated firefly luciferase can be refolded by molecular chaperones10,11. As normalizing transfection control, a vector encoding for the renilla luciferase gene is transfected. All transfections described in this protocol are performed with X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cells. In the first step, protein synthesis is inhibited by treating the cells with cycloheximide. Thereafter protein unfolding is induced by heat shock at 45&deg;C for 30 minutes. Upon recovery at 37&deg;C, proteins are re-folded into their active conformation and the activity of the firefly luciferase is used as read-out: the more light will be produced, the more protein will have re-gained the original conformation. Non-heat shocked cells are set as reference (100% of refolded luciferase).

In this protocol a method to measure intracellular protein refolding after heat shock is described. This method can be used to study foldases like molecular chaperones and their co-factors or compounds able to influence their activity. Firefly luciferase activity is used as reporter to measure chaperone refolding activity.

細胞内のリフォールディングアッセイ

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

のpH依存性活性の検出

要約

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この動画の章

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

インビトロ分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンHsp90とそのクライアントプロテインキナーゼCdc37との生体分子相互作用の探索

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

細胞内のリフォールディングアッセイ

のpH依存性活性の検出

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からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンHsp90とそのクライアントプロテインキナーゼCdc37との生体分子相互作用の探索

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

熱ショックタンパク質70のシャペロン機能を研究するための大腸菌ベースの相補アッセイ

細胞内のリフォールディングアッセイ

インビトロ分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価