This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

プラスミドの調製<ol><li>双直交リンケージドメインに融合アンカータンパク質（のOmpA）（アンカー-STとしてこのプロトコルで呼ばれる）、（そのような精製および同定のための6xHis、MYCまたはFLAGタグなど）エピトープタグを含むプラスミド（ 例えば、pET22）を準備し、選択された細菌株7に基づいて複製のペリプラズム局在タグ、抗生物質耐性、および適切な起源。 <ol><li>製造業者のプロトコルに従って市販のDNA単離キットを使用して、一晩の培養物からプラスミドDNAを抽出します。 </li></ol></li><li>プラスミド（ 例えば、pACYC184に）（酵素SCとして、このプロトコルに記載）（PTE）がアンカータンパク質のそれに相補的なバイオ直交結合ドメインに融合したOMV内にパッケージされる酵素/タンパク質を含有する調製、エピトープタグ、ペリプラズム局在タグ、アンカータンパク質のプラスミドとは異なる抗生物質耐性、および適切なORIGレプリケーションの中で選択された細菌株7に基づきます。 <ol><li>製造業者のプロトコル7次市販のDNA単離キットを使用して、一晩の培養物からプラスミドDNAを抽出します。 </li></ol></li></ol> OMV包装大腸菌培養の2世代<ol><li>プラスミド分離<ol><li>酵素SC構築物をコードするプラスミドを精製し、アンカー-STは、製造業者のプロトコール7に従って商用プラスミド単離キットを使用して、別個のメンテナンス細胞株から構築します。 260 nmおよび280 nmの吸光度を測定することにより、DNA濃度及び純度を決定します。 </li></ol></li><li>同時形質転換<ol><li>タンパク質の発現を促進するために市販されている大腸菌株を選択します。 注：BL21（DE3）細胞を、ここに使用しました。 T7溶原菌はPROTためのT7プロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼに依存しているアンカー-STの構築物の発現のために必要とされますEIN表現。他の細菌株の使用は、T7溶原菌遺伝子の存在またはpET22 7以外のプラスミドの使用のいずれかが必要です。 </li><li>その後、選択したコンピテント細胞のための製造者のプロトコルに従って、熱ショック形質転換またはエレクトロポレーションのいずれかを経由してコンピ細菌細胞にそれらを変換する同等のモル濃度に精製されたプラスミドDNAを希釈します。 </li><li>アンピシリン（pET22）及びクロラムフェニコール（のpACYC184）の両方で寒天プレート抗生物質を含むルリア - ベルターニ（LB）上でプレートを形質転換細胞。両方を25μg/ mlの最終濃度で存在します。 </li><li>両方のプラスミドを含む唯一のクローンを単離するために、37℃で一晩培養皿を置きます。 注：抗生物質選択を生き残るコロニーは将来のすべてのOMV調製物に使用されます。抗生物質（アンピシリン及びクロラムフェニコール）は、選択圧を維持し、両方のプラスミドの存在を確実にするために、すべての液体培養物に添加されます。 </li></ol></li></ol> 3. OMV生産<ol><li>コロニー拡張<ol><li> 2.2.4で説明した選択プレートから単一コロニーを上記の濃度で抗生物質を含む培養培地（通常、テリフィックブロス（TB）またはLB）（ステップ2.2.3）の5ミリリットルを接種します。 </li><li>バッフル付き培養フラスコに一晩スターター培養物の100倍希釈：1を実行します。 注：250〜500ミリリットルの間でメディアのボリュームを使用してください。 </li><li>文化の十分な通気が達成されることを保証するために、250 rpmで振盪しながら37℃で培養物を維持します。 </li></ol></li><li>各プラスミドの誘導<ol><li>細菌培養物は、一次成長フラスコの接種後OD 0.6〜0.8の600、成長の約3時間に成長することを可能にします。 </li><li> PTE-SCロードされた小胞の最終収量を向上させるために、15分間、7000×gで培養物全体を遠心分離します。予熱した、新鮮な培地中に細胞ペレットを再懸濁します。 注：このオプトionalステップは、PTE-SC誘導する前に培養培地中に存在する任意の空のOMVを除去するのに役立ちます。 </li><li> 0.22μmのフィルターを用いて水と滅菌フィルターでのL-アラビノースの20％ストック溶液を作ります。 2-4週間4℃で保存L-アラビノースソリューション。 </li><li> PTE-SCの産生を開始するために最後の0.2％濃度になるように培養フラスコにL-アラビノース溶液を加えます。 注：これは、従来の変異体のOmpA-STの誘導を介して増加した小胞形成を促進することにPTE-SCとのペリプラズム空間をプリロードするのに役立ちます。 </li><li> 0.22μmのフィルターを用いて、1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）水溶液および滅菌フィルターを作成します。 注：IPTGは、水和直後に一度使用されなければなりません。 IPTGのアリコートを3~6ヶ月間凍結保存することができ、使用直前に解凍することができます。 </li><li> OmpA-STの産生を開始するために、0.5mMの最終濃度まで追加の3時間のインキュベーション期間後にIPTGを加えます。 </li><li> CULを許可します振盪しながら37℃でさらに8-14時間、成長するチャー。 </li></ol></li></ol> 4. OMV精製<ol><li>無傷細菌の除去<ol><li>無傷の細菌をペレット化し、4℃で7000×gで15分間、細菌培養培地を遠心します。 </li><li>デカントし、細胞ペレットポスト遠心分離は、細胞ペレットを乱さないように注意してくださいの上から、メディアを保存します。 </li><li>繰り返して、すべての無傷の細菌を培養培地は、メディアをデカントし、保存してくださいされてから削除されていることを確認するために、1つの追加の遠心分離サイクルのために4.1.1と4.1.2を繰り返します。 </li></ol></li><li>タンパク質凝集体の除去<ol><li>さらに、残留細菌および望ましくない大きな細胞物質を除去するために0.45μmのメンブレンフィルターを用いて細菌培養液を精製します。 注：高い回収のために生物学的に適合性の膜材料を使用し、例えば、セルロースアセテート（CA）またはポリフッ化ビニリデン（のような低タンパク質吸着PVDF）。および100mLより大きい真空フィルター体積未満シリンジフィルターボリューム。 <ol><li>シリンジフィルターに、滅菌した10〜50ミリリットル注射器に培地を描きます。注射器のルアー端に0.45μmのフィルターを取り付けます。プランジャーを押し下げて、新しい容器にフロースルーを収集します。 </li><li>真空フィルターに、滅菌ろ過装置に培地を転送します。吸引力を生成するために、真空ポンプまたはシンクアスピレーターにユニットを取り付けます。転送は、新しい容器に培地を濾過しました。 </li></ol></li></ol></li><li>超遠心分離を介したOMVの単離<ol><li>遠心機で、対向する管のバランスをとるように注意しながら遠心分離チューブに濾過した培養培地を追加します。 </li><li>楽器とチューブの両方に一致する対応するローターを使用して、超遠心分離機で4℃で3時間〜15万×gでペレットが利用されています。 </li><li>すぐに完了Oにおける、OMVペレットを乱さないように注意しながら、OMVペレットからOMV枯渇培地をデカントOMVペレットがメディアに残るすることを可能にするようFの遠心分離は、OMV回復を減らすペレットを柔らかくします。 注：このペレットはわずかに茶色になり、細菌培養の開始量に応じて、または目で見ることができない場合があります。遠心管の上部から直接メディアを吸引することもOMVから削除複数のメディアが最終OMVのサンプルがされるより純粋をペレット化することを念頭においてオプションです。 </li><li> OMV粒子は完全にメディアから枯渇されたことを確認するために、後で動的光散乱（DLS）テストのための遠心上清を保存します。 </li><li>それはRTで30分間インキュベートすることを可能にするOMVペレットにpH8.0のバッファー濾過滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4または100 mMのN -シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸（CHES）0.5〜1 mlを加え。ペレットが乾燥しないことを確認してください。 注：ソリューションのイオン強度、pH、および温度の極端な減少OMVの溶解性をもたらし、aggre促進することができますゲーション。 </li><li>慎重に可溶化されたペレット全体を確実にするために、静かに混合、遠心管から精製されたOMVソリューションをピペット。 </li></ol></li></ol> 5. OMVキャラクタリゼーション<ol><li> OMVのサイズ分布と粒子濃度を決定するために、各機器に固有の提供製造者のプロトコルに従って、任意の市販のDLSまたはナノ粒子追跡ソフトウェアを使用してください。 注：ここでは、OMVサイズ分布と濃度がNanoSight LM10ナノ粒子トラッキングおよびNTA 2.3解析ソフトウェアを利用して決定しました。 <ol><li>ソフトウェアを開きます。 </li><li>顕微鏡の電源をオンにして、顕微鏡とナノ粒子追跡ユニット上のすべての表面を洗浄。 </li><li> 〜任意の空気を注入することなく、全体表示ウィンドウをカバーすることを確認されて1ミリリットルの無菌注射器を用いてフィッティングルアーを通して粒子追跡装置の表示画面に直接OMVサンプルの0.5ミリリットルをシステムに泡を追加します。 </li><li>プレイストン彼は顕微鏡ステージ上のユニットを追跡し、レーザーをオンナノ粒子。 </li><li>ソフトウェアで「キャプチャ」をクリックしてください。 </li><li>ソフトウェアのウィンドウでプレビュー画面の存在上の粒子を可視化するために、顕微鏡の焦点とステージを調整します。 </li><li>明るい粒子が明らかに暗い背景上で可視化されるまで、「カメラシャッター」と「カメラゲイン」を調整してください。 </li><li> 60秒にキャプチャ持続時間を調整します。 </li><li> 「レコード」をクリックしてください。 </li><li>プロンプトが表示されたら、入力サンプル/デバイスの温度は、サンプルを標識し、フォルダを指定されたユーザに実行する各の完了時に映像データを保存します。 </li><li>モードを検出し、クリックして自動ですべての解析パラメータ（検出しきい値、ぼかし、最小トラック長、最小期待される粒子サイズを）キープ」処理シーケンスを。」 注：各パラメータを微調整解析結果に独立して調整することができる方法のマニュアルを参照してください。 </li><li>レコード粒度分布及び粒子/ mソフトウェアによって決定されるL濃度。 注：典型的なOMV流体力学的サイズの範囲は約10×10 8粒子/ mlの濃度で30〜200 nmの間です。 </li></ol></li><li> OMVタンパク質含量を決定します<ol><li> OMV純度、酵素生産、およびSC-STの架橋効率7を評価するために、標準的なSDS-PAGEおよびウエスタンブロットプロトコルを使用してください。 注：架橋効率は100％7になりません。 </li></ol></li></ol>酵素包装の6.検証<ol><li> PTE活性アッセイ<ol><li>いずれかのキュベット中、25℃で適切な緩衝液などの、100mMのCHES緩衝液（pH 8）中のすべての酵素アッセイを行うまたは96/384ウェルプレート中に多重化されます。 </li><li> 1の5μlの追加：CHES90μlの精製OMVの5μlにCHES緩衝液中のパラオキソン1,000希釈（〜36倍培養培地中に存在するOMVの濃度に比べて濃縮さ）。 注意：パラオキソンは有毒農薬でありますそして、メーカーや制度ガイドラインごとに処理する必要があります。 </li><li> 405 nmで一定の間隔で吸光度測定（〜2時間の総反応時間ごとに20秒）を取る（ε= 18.1 mMの-1 cm -1 で ）と348 nmの（等吸収点のε= 5.4 mMの-1 cm -1 で ）までに発色性パラオキソン分解産物、p個のニトロフェノールの反応の進行を監視します。 注：8上記のpH値でのpニトロフェノールの支配的な脱プロトン化形態は、405 nmで正確なモニタリングを可能にする存在です。他のすべての複雑なまたはより低いpH溶液では、p個のニトロフェノールの複数の形態が存在することになるとして348 nmでの等吸収点を利用する必要があります。 </li><li>各サンプル、パッケージング効率、および総PTE生産にPTEの相対量を比較するために、ステップ6.1.3からの進行曲線の直線部分の傾きを決定することによって、初期反応速度を計算します。 </li><li>標準的な酵素を実行しますOMVのためにK M、V maxとの k catを決定するためのアッセイプロトコルは、PTEをカプセル化。 注：ラインウィーバー-バーク分析は、y切片= 1 / V maxおよび傾き= K M / V maxの20これらの動力学的パラメーターの決意に利用することができます。 </li></ol></li><li>貫通基板/製品の普及。 <ol><li>ボリュームによって0から3パーセントからCHES緩衝液中のトリトンX-100の濃度の増加を利用するステップ6.1で説明したのと同じ動的アッセイ分析を実行します。 注：OMVの内容は反応溶液に自由にアクセスできるようにするためにできるように脂質二重層を破壊する可溶化OMV機能へのトリトンX-100の追加。 </li><li>計算し、アクティビティiを酵素に比較して酵素活性の変化が最小限である（初期速度）で示される基材/製品の貫通通路を確認するために、それぞれのトリトンX-100レベルでの初期速度を比較nはトリトンX-100の存在しません。酵素活性の実質的な増加は、トリトンX-100の存在下で観察された場合には、基板が自由OMV中に拡散しないようです。 </li><li>その酵素活性を検証するためのトリトンX-100の存在下でアッセイ遊離酵素活性（セクション6.1で上述したように）界面活性剤単独では阻害されません。 注：活性が大幅トリトンX-100の影響を受けている場合、例えば、サポニンまたは様々なポリソルベート/トゥイーン界面活性剤などの代替添加剤は、OMV膜を破壊することがより適切であり得ます。 </li></ol></li></ol> 7. OMVストレージ<ol><li>凍結<ol><li>直接液体窒素中に精製されたOMVの場所〜100μlアリコートは、スナップ必ず完全にバイアルを水没またはサンプル自体に任意の液体窒素に接触しないというアリコートを凍結します。 注：精製したOMVは、スナップpurificat中にOMVペレットを可溶化するために選択したバッファに直接凍結させることができます7必要に応じていない追加の凍結保護剤とのイオンプロセス。 </li><li> -80℃でスナップ凍結アリコートを保管してください。 </li><li>サンプルを加熱しないでくださいというRTでそれらを配置することによって、ステップ7.1.1から凍結した一定分量を解凍します。 </li><li>このように、ストレージのすべてのサンプルを準備する前には、前と酵素活性のポスト凍結融解の有意な損失がないことを確認するために、凍結後に初期速度を比較するステップ6.1で説明した酵素アッセイを行います。 注：酵素活性の低下が原因で凍結することが観察されている場合Storeは4℃でOMVを精製しました。 </li></ol></li><li>凍結乾燥<ol><li>市販の凍結乾燥機21を利用し 、スナップ凍結し、精製OMVアリコートを凍結乾燥。 </li><li>ストアは、数週間または何ヶ月のために-80℃でRTでアリコートを凍結乾燥させました。 </li><li>凍結乾燥する前のような凍結乾燥OMVに精製された同体積の水を追加し、トンを再水和するために室温で30分間放置彼はサンプリングします。 OMVをボルテックスまたは超音波処理しないように注意してくださいされて、必要なときに穏やかに混合します。 </li><li>ポイント・オブ・ケア希釈前/可溶化を必要としないアプリケーションのために直接凍結乾燥OMV粉末を追加します。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Avila-Calderon, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacterial+membrane+vesicles.">Roles of bacterial membrane vesicles.</a> Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).</li><li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).</li><li>Beveridge, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+Gram+negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).</li><li>Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+multifaceted+roles+of+outer+membrane+vesicles+from+Gram-negative+bacteria.">Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria.</a> Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).</li><li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).</li><li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanobioreactors-directing+enzyme+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).</li><li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles.">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).</li><li>Kesty, N. C., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+heterologous+outer+membrane+and+periplasmic+proteins+into+Escherichia+coli+outer+membrane+vesicles.">Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).</li><li>Zakeri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+tag+forming+a+rapid+covalent+bond+to+a+protein,+through+engineering+a+bacterial+adhesion.">Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).</li><li>Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+and+optimization+of+the+covalent+association+between+SpyCatcher+and+a+peptide+tag.">Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag.</a> J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).</li><li>Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+organophosphorus+nerve+agents+by+the+phophotriesterase+from+Pseudomonas-Diminuta.">Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta.</a> Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).</li><li>Bigley, A. N., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+mechanisms+for+phosphotriesterases.">Catalytic mechanisms for phosphotriesterases.</a> Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).</li><li>Minton, N. A., Murray, V. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+organo-phosphate+poisoning.">A review of organo-phosphate poisoning.</a> Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).</li><li>Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+neutralization+of+the+chemical+warfare+agent+VX:+Evolution+of+phosphotriesterase+for+phosphorothiolate+hydrolysis.">Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).</li><li>Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-negative+bacteria:+the+cell+membranes.">Gram-negative bacteria: the cell membranes.</a> Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+OmpA+in+Escherichia+coli.">The function of OmpA in Escherichia coli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).</li><li>Danoff, E. J., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soluble,+periplasmic+domain+of+OmpA+folds+as+an+independent+unit+and+displays+chaperone+activity+by+reducing+the+self-association+propensity+of+the+unfolded+OmpA+transmembrane+beta-barrel.">The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel.</a> Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).</li><li>Alves, N. J., Kline, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+inhibition+of+plasmin+and+delta-plasmin+via+benzamidine+derivatives.">Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals.">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).</li><li>Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-based+separation+of+liposomes+by+glycerol+gradient+centrifugation.">Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation.</a> Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).</li><li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+liposome+purification+via+Liposome+Extruder+Purification+(LEP).">Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP).</a> Analyst. 138, 4746-4751 (2013).</li><li>Mayer, L. D., StOnge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+and+liposome-associated+doxorubicin+and+vincristine+levels+in+plasma+under+equilibrium+conditions+employing+ultrafiltration+techniques.">Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques.</a> Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).</li><li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast,+efficient,+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo.">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li><li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils:+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding.">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li><li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

代表性を実証するために、このプロトコル機能は、目的の酵素が生産され、 大腸菌によりOMVにパッケージ化されたパッケージング技術を指示しました。多くの複雑な技術と同様のプロトコルは以下に詳述されているいくつかの異なるユニークな用途での使用に適応するように変更することができる複数の領域が存在します。 OMVのパッケージングと酵素カプセル化のメカニズムは、特?...

ここで紹介するには、設計、生産、および酵素ロード細菌の外膜小胞（OMV）の精製方法です。 OMVは、30から200 nmの1,2からサイズの範囲でプロテオ主に単層、小さいです。現在までに研究されているすべてのグラム陰性及びグラム陽性菌は、その表面3,4からOMVまたは細胞外小胞（EV）のいずれかの放出を示しました。 OMVが生成されることにより、正確なメカニズムは完全に起因する彼らだけでなく、彼らが仕える様々な機能を分泌し、多様な細菌集団に解明されていません。 OMVは、複雑なシグナル伝達、遺伝子転座の様々なサービスを提供する遺伝物質を小分子、ペプチド、及びタンパク質から貨物の広い範囲を輸送することが示されており、毒性は5,6機能します。 OMVの生合成の正確なメカニズムは十分に特徴付けられ、そして細菌種間で異なるように思われていません。 THIにもかかわらず、事実は、我々は、目的のタンパク質と細菌の外膜に非常に豊富なタンパク質の内因性およびその後のOMVの間の合成結合を作成することによりOMVへの組換えタンパク質のパッケージング効率を高めるための方法を開発しました。合成結合、または人工的に組み込まれた親和性の非存在下で、組換えにより発現されたタンパク質およびOMVの間に観測されたパッケージング効率は7非常に低いです。この結果は、どちらかがよく理解されていないメカニズムによって細菌表面にまたは指向包装を通してOMV形成の正確な瞬間に偶然カプセル化を介して起こるOMV内のタンパク質の取り込みとして期待されます。第他人と比較して高い効率でパッケージング、いくつかのタンパク質との依存性タンパク質は非常にいくつかの成功は偶然のカプセル化が、効果的なパッケージに依存してペリプラズム空間内で過剰発現は、単にを通じてパッケージングタンパク質で観察されているですまったく8-10でパッケージ化しないでください。我々は同時に、パッケージを生成し、OMVが形成されている方法と貨物がために細菌によって選択される方法に関する現在の知識の限界を回避するOMVに関心の活性酵素を分泌する大腸菌 （E. coli）を操作するために求められる一般的な合成生物学の技術を利用することによって包装。 本出願の目的のためにスプリットタンパク質バイオコンジュゲーションシステムは、OMVに指向性パッケージングを容易にするために選択した合成結合として選択しました。名前が示すように、分割のタンパク質バイオコンジュゲーションシステムは、互いに相互作用する二つの相補的なサブドメインで構成されています。このプロトコルの目的のために選択された分割されたタンパク質ドメインはSpyCatcher（SC）とSpyTag（ST）ドメインと呼ばれ、 化膿連鎖球菌のフィブロネクチン結合タンパク質（FbaB）11から誘導されます。この分割されたタンパク質系は、ワットに珍しいです鶏は、2つのサブユニットが近接範囲内であるイソペプチド結合は、自然に共有結合を作成酸およびリジンのアミノ酸残基アスパラギン近位の間に形成されます。イソペプチド結合の形成は、シャペロンタンパク質、触媒酵素、または補因子の添加を必要とせず、容易に室温（RT）で、かつ生理学的に関連する条件12の広い範囲にわたって起こり得ます。 コンセプトの証明としては、Brevundimonasのディミニュータからホスホトリエステラーゼ（PTE）（EC 3.1.8.1）は、OMV 13由来の大腸菌にパッケージ化されるように選択されました。 PTEは、二核のZn / Znの活性部位を含み、ジアルキルホスフェートおよびアリールアルコール14にaryldialkylphosphatesを変換する加水分解反応を通じて有機リン酸塩を打破する能力を有しています。有機リンへの曝露は、神経筋接合部のmakinでアセチルコリンエステラーゼによってアセチルコリンの加水分解を阻害することにより、適切な神経伝達物質の機能を損ないます15非常に危険グラムの有機リン由来の化合物。有機リン酸エステルへの長期的または重大なエクスポージャーは、一般的に制御不能な痙攣をもたらし、一般的に窒息を介して死を引き起こします。 PTEは、パラオキソンに向かって最も高い触媒活性を示すが、非常に強力な殺虫剤は、また、他の殺虫剤とV / G型化学神経剤16の広い範囲を加水分解することが可能です。 OMVのパッケージングを容易にするために、細菌プラスミド、誘導性プロモーターを含む遺伝子構築物、ペリプラズム局在化配列、およびSC遺伝子配列の上流の短い多重クローニング部位をコードするように設計しました。 OMV包装用ペリプラズム空間にPTE-SC融合タンパク質を標的に遺伝スイッチの作成を許可されたリーダーとSC配列との間のPTE遺伝子の挿入。ここで説明する努力がPTEに焦点を当てながら、酵素遺伝子が交換可能であると容易にFACに別の遺伝子配列で置換することができ代替酵素またはタンパク質のilitate包装。 合成結合の第二の部分として、豊富な外膜タンパク質（のOmpA）は、STペプチド配列を提示するように選択されます。アンカータンパク質の選択を変えることができるが、タンパク質がペリプラズム空間に提示許容ドメインを有し、細胞毒性を誘発することなく融合構築を許容することが不可欠である、OMV中に存在することが知られており、それは、組換えとき凝集していません生産。 OmpAは非常に細菌の外膜およびその後のOMV 17内で発現することが知られている37.2 kDaの膜貫通ポリンタンパク質です。これは、大きさが2nmで細菌膜18を横切って、&lt;、小分子の輸送に関与しています。ネイティブのOmpAは、2つの構造のユニークなドメイン、膜貫通βバレルモチーフとペプチドグリカン19と相互作用することが知られペリプラズム可溶性C末端部分を有しています。変異型のOmpA-ST融合デザイン性でDここでのOmpAのC末端部分は削除されたとSTは、ペリプラズムに面しN末端またはC末端に融合させました。 OmpAのペリプラズム部分を削除すると、外膜と超小胞7につながる膜不安定化をもたらしペプチドグリカンとの間の相互作用の数を減少させます。ゲノムのOmpAは、総膜不安定化を緩和するために、組換え的に発現のOmpA-ST構築に加えて維持しました。

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Any</td><td></td><td>Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Any</td><td></td><td>Can be prepared ahead of time and stored at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB Culture Media</td><td>Any</td><td></td><td>Other growth medias will likely work similarly.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Any</td><td></td><td>One of many potential suitable surfactants.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Baffled culture flasks</td><td>Any</td><td></td><td>The baffles promote higher levels of aeration.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &gt; 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.45 &amp;micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.</td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Culture Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capable of centrifugal forces &amp;ge;150,000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Necessary for enzyme kinetic assays.</td></tr><tr><td>DLS/particle tracking</td><td>NanoSight&amp;nbsp;</td><td>LM10</td><td>Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Suitable bacterial expression strain.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Example kit.</td></tr></tbody></table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

外膜小胞（OMV）をプログラムするために、合成生物学の技術を適用する際の関心の高まりは、従来のナノ粒子が合成することが非常に困難証明しているOMVのためのいくつかの非常に興味深く、ユニークなアプリケーションにつながっています。現在までに、すべてのグラム陰性菌には、小分子、ペプチド、タンパク質および遺伝物質を含む貨物の種々のOMV実証パッケージを生成することが示されています。それらの多様な貨物に基づいて、OMVは、細胞間コミュニケーションの遺伝子導入及び細菌がOMVを生成しているに応じて病原性因子の送達に至るまで多くの生物学的プロセスに関与しています。ごく最近になって、細菌のOMVは制御し、OMVへの組換えタンパク質の直接包装するための技術の開発を通じてアプリケーションの広い範囲にわたって使用するためにアクセス可能となっています。このプロトコルは、生産、精製する方法を記載し、そして酵素の使用を向上Overaのために提供するOMVをパッケージ化組換え酵素、小胞形成の増加、及び強化酵素安定性のLL製造。このプロトコルの成功利用は同時に、組換えタンパク質を産生する組換えタンパク質および外膜アンカータンパク質との間に合成リンケージを作成を通じてOMVのカプセル化のためにそれを指示する細菌株の作成になります。医薬品送達、医療診断、および環境修復：このプロトコルはまた、などの他のユニークなアプリケーションのための使用のためにこのプロトコルを適応する際に考慮すべき細菌培養と同様に適切な取り扱い技術や物事からOMVを単離するための方法を詳しく説明します。

このプロトコールで詳述OMVパッケージング戦略のために必要とされるように、2つの組換えタンパク質の同時発現は、異なる道の数を介して達成することができます。ここでは、2つのベクター系は、複製と独立した誘導性遺伝子カセットの互換性の起源で利用されました。 PTE-SCの発現のために商業的なプラスミド骨格（pACY184）を構築アラビノース誘導性遺伝子カセッ...

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K ビュー.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

ビデオ: Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; C。ディフィシル</em&gt; PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

生化学

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

化学

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;皮膚組織工学のための

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

生物工学

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

生物学

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装

要約

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この動画の章

の生産、結晶化と構造決意

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

のタンパク質複合体の同定

生産と細菌のスフェロプラストとプロトプラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装

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の生産、結晶化と構造決意

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

のタンパク質複合体の同定

生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

生産と細菌のスフェロプラストとプロトプラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化