Name: "phagosome closure assay" to visualize phagosome formation in three dimensions using total internal reflection fluorescent microscopy (tirfm)
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
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We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nad&#232;ge Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche M&#233;dicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les h&#233;patites virales" (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.

注：Lifeact-mCherryを使用したプラスミドは、17の後に生成された博士ギョームMontagnac、キュリー研究所、パリ、一種の贈り物です。 1.細胞およびトランスフェクション注：RAW264.7マクロファージをサブコンフルエント完全培地中（RPMI（ロズウェルパーク記念研究所）1640培地に増殖させ、10mMのHEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、50μMのβメルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン及び10％FCS（ 100ミリメートルプレートにおけるウシ胎児血清））。これらは、エレクトロポレーションによって、蛍光標識されたタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされます。日常的に約5から6×10 6個の細胞をそれぞれトランスフェクションまたは同時トランスフェクション用プラスミド20μgのまたは10μgのトランスフェクトされます。エレクトロポレーションまたはリポフェクションに基づいて、トランスフェクションの他の手段は、代替的なアプローチとして使用できることに注意してください。 <ol><li>セルリフターで細胞をこすり落とし、数回ピペッティングにより培養液10mlに再懸濁します。 </li><li>遠心分離機細胞懸濁液を300×gで、スイング角度ローターで、室温で5分。 </li><li>完全培地の予熱10mlを37℃にてゲンタマイシン10μg/ mlのを補充しました。 </li><li>遠心分離後、上清を破棄し、エレクトロポレーションキットから「洗浄バッファーA」の3ミリリットル中にペレットを再懸濁。 </li><li>細胞懸濁液を300×gで、スイング角度ローターで室温で5分間遠心します。 </li><li>その間に、室温でDNAミックスを準備します。QSP 240μlのH 2 O 120μlの2×緩衝液B、目的のタンパク質のためのプラスミドDNAコーディングの20μgの、 </li><li>遠心分離後、全体上清を捨てます。 </li><li> DNA混合物中の細胞ペレットを再懸濁し、4ミリメートルのエレクトロポレーションキュベットに移します。 </li><li> 3分間室温でインキュベートします。 </li><li> 250 V、900μFで電気穿孔。 </li><li>すぐにゲンタマイシンを補充した予熱した（37℃）完全培地中で細胞を再懸濁し、プレート100ミリメートル皿でメートル。 </li><li> 37℃、5％CO 2で一晩トランスフェクトされた細胞を培養します。 </li><li>翌朝は、無血清顕微鏡培地10ml（フェノールレッドなしのRPMI 1640、10 mMのHEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、50μMののβメルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン）で完全培地を交換してください。 </li></ol>赤血球の2オプソニン注：マクロファージ粒子対象のモデルとして、ヒツジ赤血球（SRBC）を使用します。通常、35ミリメートルガラスボトムディッシュあたり約7×10 6 SRBCをが使用されます。 <ol><li> 1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水）/0.1% BSA（ウシ血清アルブミン）及び遠心（600×gで、4分）の100μlでSRBCを洗浄します。 </li><li>遠心分離後、上清を廃棄し、1×PBS / 0.1％BSAおよび遠心分離（600×gで、4分）の100μlのSRBCを再懸濁します。 </li><li>遠心分離後、上清を破棄し、ウサギのIgG抗SRBCを用いて1×PBSで/ 0.1％BSAをSRBCを再懸濁サブ凝集濃度で。 SRBCをの抗体/ 5μLを含む溶液500μlを使用してください。 注：抗体のサブ凝集濃度は、ネットワークの形成として検出凝集を誘発しなかった最低の濃度に相当します。一般に、サブ凝集濃度は、8.2μgの/ mlです。 <ol><li>赤血球凝集試験によってSRBCををオプソニン化するために必要なのIgG抗SRBCをの濃度を決定します。マイクロプレート内の1 / 25,600 - シリアル1/50の間（13.1 mg / mlでの在庫）のIgG抗SRBCを希釈します。各ウェルに2×10 6 SRBCをを追加します。いくつかの時間室温で暗所でプレートをインキュベートします。 </li></ol></li><li>低速回転で30分間、室温でインキュベートします。 </li><li> 1×PBSで2回洗浄/上記のように0.1％BSA後、予め温めた無血清顕微鏡培地中のIgGオプソニン化SRBCを抗体（IgG-SRBC）で（2ミリリットル/皿）に再懸濁します。 </li></ol>カバーガラスの3ポリリシンコーティング<ol><li>その間室温で30分間、0.01％ポリ-L-リジンの2mlで35mmのガラスボトムディッシュを治療します。 </li><li> 1×PBSの2ミリリットルで皿を2回洗浄します。 </li></ol> 4.グラスボトムディッシュにSRBCをの非共有結合固定<ol><li> 35ミリメートルのガラスボトムディッシュあたりSRBCを懸濁液の2ミリリットルを注ぎます。 </li><li> 35ミリメートルのガラスボトムディッシュ上に2分間で500×gでスイングローターで遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、1×PBS / 10％のBSAの2mlで1回洗浄。 </li><li>ディッシュあたり1×PBS / 10％BSAの2mlで30分間粒子をインキュベートします。 </li><li> 1×PBSの2ミリリットルで皿を3回洗浄します。 </li><li>予め温めた（37℃）で、無血清顕微鏡培地2mlの1×PBS置き換えます。 </li></ol> 5.貪食TIRFMによって可視化<ol><li> 顕微鏡 注：TIRFMは、油浸対物レンズ（N 100X、NA1.49）、CO 2と加熱室を備えた顕微鏡を用いて行い、両者が歌います1.5Xレンズと相まってル光子検出カメラEMCCD（電子増倍電荷結合素子）。 <ol><li> TIRF顕微鏡セッションの前日には、顕微鏡ステージの均一な加熱を可能にするために、37ºCで加熱室をオンにします。 </li></ol></li><li> 臨界角の決意 注：ImageJのカラープロファイラーソフトウェアがTIRF画像ストリームを処理するために使用されます。 <ol><li>顕微鏡下で無血清顕微鏡培地でオプソニン化SRBCを含む35ミリメートルのガラスボトムディッシュを置きます。 </li><li>細胞をこすり落とし、それらを追加する前に、培地中に再懸濁 - 皿に（100〜500μl）を。 </li><li>顕微鏡を制御し、491 nmおよび/または蛍光タグ化タンパク質を発現する細胞を同定するために561 nmレーザーで励起を行うために、「ライブ取得」ソフトウェアを使用してください。 </li><li>蛍光標識されたタンパク質を発現する細胞を識別します。 </li><li>フィールドの真ん中にそれを置き、500イムを取得異なる角度を持つ1つの励起波長での年齢は、0.01º（ 図2A）の増加と、5°までの0°から始まります。角度が自動的に顕微鏡システムによって変更されます。 </li><li>入射光が完全にガラス/媒体界面で反射されることを可能にする臨界角を決定し、エバネッセント波を発生させます。 ImageJのカラープロファイラーソフトウェアを使用して、「ファイル」をクリックして「開く」画像シーケンスを開き、ファイルを選択します。 </li><li>均一な蛍光（ 図2B黄色1）と細胞内で、長方形ツールを使用して、関心領域（ROI）を選択します。 </li><li>ドロップダウンメニューと「プロットZ軸プロファイル」の「スタック」、「画像」タブをクリックすることにより、x軸の角度の関数とROIで測定された平均蛍光強度」、Z軸のプロファイルを「プロット（ 図2B赤2）。 注：臨界角はミリアンペアにつながる角度であります蛍光の急激な減少の前にximum蛍光。 </li><li>例2.00（ 図2C）としてTIRF信号を得るために、顕微鏡のセッション中に臨界角よりも優れた、x軸上の角度のいずれかの値を使用してください。 </li></ol></li><li> 買収 <ol><li>ライブ取得ソフトウェアを使用して、「プロトコル・エディター」（ 図3A）モジュールと買収のパラメータを設定します。 <ol><li> TIRF地域への関心のタンパク質からの蛍光信号を取得する「マルチチャンネル」の取得を含む「ループ」でプロトコルを作成します。 （例えば、2.00用）TIRF角、露光時間（例えば50ミリ秒）とレーザー強度（例えば50％）（図3B 1）を入力します。 </li><li> 「マルチチャンネル」ツールを使用して落射蛍光における信号取得を取得するためにTIRF地域上記の目的3μmの「Z移動」を導入。トン以下の角度を入力してください彼臨界角（例えば1.00など）、博覧会の時間（50ミリ秒）及びレーザー強度（50％）（ 図3B、図2及び図3）。 </li><li>次TIRF地域（ 図 3B 4）に戻るには、3ミクロン以下の目的の「Z移動」を追加します。 （発光ダイオード）（ 図3B 5）LED明るい光の中で、細胞の「スナップショット」を追加します。 </li></ol></li><li>粒子の周囲に、原形質膜を拡張することによってSRBCの食作用を開始する蛍光タグ付きタンパク質発現の適度なレベルで目的の細胞を見つけます。 </li><li>フィールドの中央に配置します。 </li><li>千フレーム - 500の取得をストリーミングを開始。 「ル ​​ープ回数」タブで、「750フレーム」（ 図 3B 1）を入力します。 注：ImageJのカラープロファイラーソフトウェアがTIRF画像ストリームを処理するために使用されます。 </li><li>クリックして画像Jソフトウェアのシーケンスの画像を開きます。、「開く」「ファイル」とファイルを選択します。 </li><li> 「Hyperstacksは「機能」をhyperstackするスタック」ドロップダウンメニュー上に、タブの「イメージ」をクリックすることで、チャネルを分離。注文：登場ウィンドウ完了xyctzを。チャネル（C）：チャンネル数（例： &quot;2&quot;次の2つの蛍光色素を持っている場合）。スライス（z）は、Z軸方向におけるスライスの数（例：「1」z軸での動きがない場合）。フレーム（トン）：チャンネル数毎に分割された画像の数;表示モード：グレースケール。 注：2つの別個の画像シーケンスが生成され、二つの異なるチャネルに対応します。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 &#176;C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice...

食作用は、その後、摂取された物質の内在化および分解につながる、認識で始まり、受容体表面への材料の結合の主要な細胞機能です。このような金型細胞性粘菌とアメーバのような単細胞真核生物は、細菌に供給するための食作用を使用していますが、高等生物はプロの細胞と進化してきました。マクロファージや樹状細胞は様々な組織や臓器中の病原体に対する防御の最前線であり、抗原提示およびサイトカイン産生1-4を通じて適応免疫系を活性化することが重要です。特定の状況下では食作用は、非専門の食細胞、 例えば、内皮細胞および上皮細胞によって行うことができます。このプロセスは、開発中と正常組織のターンオーバーおよびリモデリングのための成人期に恒常性を維持することが重要です。精巣または網膜におけるこのようなセルトリ細胞として最後に、専門的な食細胞色素上皮細胞は、非常に強力な食5です。 微生物や細胞破片の劣化が食細胞の表面上の貪食受容体のクラスタリングで開始を発生ファゴソームの形成。このようなFc受容体（FcRで）又は補体受容体（CRS）などのオプソニン受容体のクラスタリングを次の下流のシグナル伝達事象は十分に特徴づけられています。しかし、Toll様受容体（TLR）を含む非オプソニン受容体、レクチン、マンノース受容体およびスカベンジャー受容体多数のもあります。これらの受容体は、マンノースまたはフコース残基、ホスファチジルセリン、およびリポ多糖1,6-9などの粒子表面上の決定基を認識する。 病原体や細胞破片認識はに結合し、その後激しいと過渡アクチンの再構築につながる食細胞受容体のいくつかのタイプのクラスタリングを伴います。細胞内compartmenのパラレル、焦点エキソサイトーシスでtsが膜張力の解放に貢献し、大きな粒子の効率的な食作用のために重要です。アクチン重合および膜変形につながるシグナル伝達事象は、単一の貪食受容体をトリガーした実験モデルで解剖しました。 FcR媒介性の食作用の間に、低分子量GTPアーゼ（RAC、Cdc42の）によって調節される強いアクチン重合があります。その下流のエフェクターの中でも、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（WASP）は、アクチンフィラメント1,2,4,10を核とアクチン関連タンパク質複合体2/3（ARP2 / 3）の活性化をもたらします。ホスファチジルイノシトール4、5-ビスリ ​​ン酸（PI（4,5）P 2）の現地生産は、仮足の形成を駆動する初期のアクチンの重合のために重要です。 PI（3,4,5）P 3への変換は、仮足の拡張とファゴソームの閉鎖11のために必要とされます。いくつかの経路は、PI（4,5）P 2の消失に寄与する。ホスファチジルイノシトールリン酸キナの最初に脱落ファゴソームの逮捕のPI（4,5）P 2合成からSES（PIPKIs）。第二に、それがリン酸化することができると私はキナーゼ（PI3K）をPI3Kクラスによって消費され、PI（3,4,5）P 3 12で変換されました。ホスファターゼ及びホスホリパーゼの役割はまた、哺乳動物細胞および細胞性粘菌 13,14における食作用の間にPI（4,5）P 2の加水分解およびF-アクチンの除去に暗示されています。ホスホリパーゼC（PLC）δは、ジアシルグリセロールおよびイノシトール1,4,5- トリスホスフェートにPI（4,5）P 2を加水分解する。 PI（4,5）P 2およびPI（3,4,5）P 3ホスファターゼOCRL（ロウの眼脳腎症候群）もファゴソーム形成に関与しています。 F-アクチンとその解重合の正確な局所的形成は、しっかりと空間と時間に規制され、我々は細胞内区画の募集がローカルOCRLホスファターゼを提供することが重要であることが示されている、したがって、貪食カップの底部に局所のアクチン脱重合に寄与します<sup&gt; 13,15。このために、我々はここに記載された実験セットアップを使用していました。 機構とファゴソームの閉鎖および膜の切断のために必要とされる分子の選手が不十分なため、ファゴソーム閉鎖のサイトを可視化と監視の難しさの定義されたままです。最近まで、食作用は難しいファゴソーム閉鎖のサイトのタイムリーな可視化を行う、彼らの背面にまたはその両側に粒子を内部固定または生きている細胞で観察されました。また、固定方法は、膜とバイアス仮足の拡張と閉鎖に結果の後退を引き起こす可能性があります。これとは対照的に、我々が設定し、ここで説明しているアッセイは、私たちは偽足拡張子と内部全反射顕微鏡（TIRFM）16に基づいて、生細胞13内食作用の閉鎖ステップを、可視化することができます。この光学技術は、透明との間の界面に薄い領域でのフルオロフォアを励起するエバネッセント波を使用していますので、蓋（カバーガラス）と液体（細胞培養培地）。励起深さの厚さは、原形質膜に近い分子事象の可視化を可能にする、固体表面から約100 nmです。 TIRFMは、高い信号対バックグラウンド比を可能にし、細胞の照明に起因収集ピンボケ蛍光および細胞毒性を制限します。 TIRFMを利用して、我々は、カバースリップは、ポリ - リジンで活性化した後、IgGのオプソニン化赤血球抗体（IgG-SRBC）でで被覆された「ファゴソーム閉鎖アッセイ」を開発しました。関心の一過性の蛍光標識されたタンパク質を発現しているマクロファージは、その後のIgG-SRBCを巻き込むために許可されています。細胞は、非共有結合ガラス表面に結合している標的粒子を切り離しながら、偽足の先端部を観察し、TIRFモードで記録することができます。 TIRFの買収は、VISを可能にする、3ミクロン以上のステージをシフトした後に、落射蛍光モードでの買収と組み合わされます貪食カップのベースのualization。そのようなプロセスの間にアクチンまたはダイナミンを阻害するもののような薬理学的薬剤の添加は、分子レベルでのプロセスを分析することも可能です。 ここでは詳細に説明されたプロトコルは、RAW264.7マウスマクロファージ細胞株およびオプソニン化粒子についてであるが、実質的に、それは、他の食細胞およびビーズなどの他の標的と適合させることができます。この方法は、時間と様々な貪食過程で仮足の拡張とファゴソームの閉鎖に関与する分子の選手の空間に規制のより良い特徴付けを可能にします。

<table><tbody><tr><td>Anti-sheep red blood cells IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, &amp;ge;98%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes 4 mm</td><td>Cell project</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>Room temperature</td></tr><tr><td>Electrobuffer kit</td><td>Cell project</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Gene X-cell pulser</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Case</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td>Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Solution 0.1%</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ml</td><td>Dilution at 0.01% in water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium GLUTAMAX&amp;nbsp; Supplement</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Sheep red blood cells (SRBCs)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conserved in Alsever buffer at 4 &amp;deg;C before use</td></tr></tbody></table>

"phagosome closure assay" to visualize phagosome formation in three dimensions using total internal reflection fluorescent microscopy (tirfm)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

本稿に記載された実験システムを図1に概略的に示されている。蛍光タグに融合した目的のタンパク質を発現するトランスフェクトRAW264.7マクロファージは、非共有結合的に固定したIgGオプソニン化ヒツジ赤血球（SRBC）と接触するように配置されていますカバースリップ上。マクロファージはそれを巻き込むためにカバースリップからSRBCを切り離すことが...

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"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

6.4K ビュー.  Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité. We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

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Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

免疫・感染学

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのpHを測定します

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

生物学

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

食作用の初期段階の可視化

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>生蛍光、細胞波立方位の逆イメージング、およびマクロピノサイトーシス

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

生蛍光、細胞波立方位の逆イメージング、およびマクロピノサイトーシス

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します

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真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのpHを測定します

レシオメトリックpH指示薬を使用して好中球ファゴソームと細胞質のイメージング

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

食作用の初期段階の可視化

生蛍光、細胞波立方位の逆イメージング、およびマクロピノサイトーシス

生蛍光、細胞波立方位の逆イメージング、およびマクロピノサイトーシス