JCMは、ユニリーバPLC（BB / L023040 / 1）でBBSRC-IPA賞によって資金を供給されています。 HAGはサウジアラビア省高等教育の博士課程の学生の身分によって運営されています。

以下の方法は阻害剤産生株で競合他社の株をテストするために7,8を適合されています。 注：このプロトコルは、細菌培養でエアロゾル生成を含みます。これは、ローカルでのみ、承認された安全性を考慮の実装に含まれる空間で実行することができます。レベル2の安全キャビネット内で寒天プレート上に文化の噴霧は寒天プレートと周辺環境の汚染を最小限に抑えることができます。研究者は封じ込めレベル2の生物を使用している場合、これはまた、噴霧菌のエアロゾル吸入から研究者を保護する、これが主要な関心事です。適切な個人保護具を着用する必要があります。ペトリ皿の周囲に最良使い捨て吸収性組織で覆われています。 UV光を用いて、ポストスプレー除染をお勧めします。 1.寒天プレートの準備<ol><li>マヌーに応じて、ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天を準備facturerの指示。 </li><li> 、121℃でBHI寒天培地をオートクレーブ20分間、15 psiの、またはオートクレーブ製造業者の推奨に従って、滅菌します。 </li><li>滅菌ペトリ皿に滅菌BHI寒天15mlのアリコートを注ぎ、それを設定することができます。 注：このアッセイ内で使用するすべての寒天プレートは、寒天の同じ株に由来し、寒天の同じ量を各プレートに存在することを確認してください。これは、利用可能な栄養素と比較を可能にするプレート間の阻害剤拡散の変動を制限します。 </li></ol> 2.無菌ブロスの準備します<ol><li>製造元の指示に従ったBHIブロスを準備します。 </li><li> 28ミリリットルのガラスユニバーサルボトルにBHIの10ミリリットルのアリコートを追加します。 </li><li> 、121℃でBHIブロスをオートクレーブ20分間、15 psiの、またはオートクレーブ製造業者の推奨に従って、滅菌します。 注：ブロスAUTの同じバッチに由来するアッセイで使用されているすべてのスープを確認してください結果の変動を引き起こす可能性の栄養素の変動を制限するために、同時にoclaved。 </li></ol> 3.準備滅菌気化ボトル（複数可） <ol><li> vapourizerボトルを解体。 </li><li>一晩5％の界面活性洗浄剤でvapourizerボトル、蓋とvapourizerを浸し、内部汚染物質を除去するためにvapourizerを通して5％の界面活性洗浄剤をスプレーします。 注：界面活性洗浄剤を取り扱う際には手袋と適切な個人保護具を使用する必要があります。 </li><li>無菌空気流フードの下で気化器、蓋と瓶を乾燥させます。 </li><li> 70％エタノールでボトルを記入し、vapourizerを再接続し、vapourizerを通してエタノールの一部をスプレー。 </li><li>気化器の蓋を入れて、使用するまで内部のエタノールで保管してください。 </li><li>使用直前に、無菌的に滅菌BHIブロスでボトルを洗浄し、vapourizerを通して培養液をスプレー。 注：これは、エタノールAFFを防止します6.3節でボトルに加え接種材料をecting。 </li></ol>細菌の一晩培養物（複数可）を準備4 <ol><li>無菌BHI寒天プレート上にストリーク競合他社と阻害剤の株を、約18時間（一晩）好気的に37℃でインキュベートします。 注：このプレートを4℃で保存した場合、同じ週間内の複数の複製のために使用することができる細菌のストックを生成します。 </li><li> 28ミリリットル万能ボトル内の必要な競争相手の細菌株の単一コロニーを滅菌BHIブロスの10ミリリットルを接種します。 </li><li>オービタルシェーカーで250 rpmで振とうして好気的に37℃で一晩ユニバーサルボトルをインキュベートします。 </li></ol>インヒビター産分離株の5スポット文化<ol><li>セクション4で説明したように一晩培養物（複数可）を準備します。 </li><li>寒天プレートは蓋の上結露しないと、完全に乾燥していることを確認し、接種前に（PLAをインキュベートすることにより、 例えば37℃で60分間）のためのTE;これは、接種部位から板全体に広がるの接種材料を防ぐことができます。 </li><li>寒天プレートの中央に一晩培養のピペットを25μl。完全に寒天を横切っ文化をスプレー気泡を防止するために、ピペットプランジャーを押し下げることは避けてください。 </li><li>文化は文化の広がりを制限するために、室温で乾燥することができます。好気的に37℃で一晩寒天プレートをインキュベートします。 </li></ol> 6.準備テスト他社株のスプレー接種物（複数可） <ol><li>約4×10 6 CFU ml -1の得るためにBHIブロス中で部4希釈で一晩培養10倍に説明したように一晩培養液を用意し、OD 600 0.3±0.05のサスペンション。 注：10倍希釈は、4×10 6 CFUミリリットルを与えることはありません-1すべての細菌種のために、1×10の間の連続希釈液をメッキ普及により、必要な希釈係数を計算します<s&gt; -1 -1×10 -6アップ。 </li><li>無菌のプラスチック製の香水の気化器ボトルに希釈した培養を注ぎます。 注：総容積は寒天プレートの数がスプレーされるために必要とされる以上でなければなりません。プレート当たり約250μlを直径9cmのシャーレに適しています。 </li></ol> 7.繰延成長阻害アッセイ<ol><li>文化は前寒天上に噴霧するスプレー機構にロードされていることを保証するために、気化器ボトルの各を通じて文化をスプレーしてください。 </li><li>寒天上記の15cm程度の距離から、全体の寒天表面上に希釈した培養の約250μlの（典型的な50ミリリットル気化器の3スプレー）をスプレー。好気的に37℃で一晩寒天プレートをインキュベートします。スプレーの同じ番号を持つ他のプレートについて、この手順を繰り返します。 </li></ol> 8.繰延成長阻害アッセイの結果の解釈<ol><li>噴霧competiの増殖阻害ゾーンを測定しますタ株（ 図1A - C、「X」「X」へ）（ - C、 &quot;Y&quot;に&quot;Y&quot; 図1A）阻害剤プロデューサーの中心スポットの直径を差し引いミリメートルで、。 メモ： 図1Eは、このデータを提示する方法を示してい</li><li>阻害ゾーンのための透明度スコアを記録します。 注：これは、観察された阻害の程度を示します。例は、 図1Aに示されている- D、標準化のために使用することができる株は、代表的な結果のセクションで提案されています。以下の規模は、明確化のスコアリングに使用することができます：0の透明度スコアは、競合他社株の成長の完全な阻害のゾーンを記述すること。 1のスコアがクリアのゾーンに存在する唯一の個々のコロニーで、成長のほぼ完全な阻害のゾーンを説明します。 2のスコアが減少し、成長の可視ゾーンを記述するために、このゾーン内の成長は詐欺です流暢またはコンフルエントに近いが、&gt; 50％の密度が縮小されています。 3のスコアは最小限の成長の減少を説明するために、増殖がコンフルエントと50％未満減少し、ゾーンが依然として可視で測定されます。成長の目に見える阻害を記載していないための4つのスコア。 5のスコアは、競合他社の株の増殖が試験阻害剤産生株の近くに増加したことを記述します。例については、 図1を参照してください。これらのスコアは、実験者に主観的です。 </li></ol> 9.レプリケート<ol><li>得られた結果の再現性を決定するために、生物学的三重に少なくともアッセイを繰り返します。 注：複製を別の日に行っている場合は、測定を行い、4℃で、その後、インキュベーションから取り出した直後のいずれかのストアプレートをプレートスコアまたはそれらを廃棄する前に、プレートの高品質の写真を撮ります。ストレージまたはプレートの写真は別の日の間の結果の比較が容易に可能になり、トン彼は日/実験全体で再現性の得点を確認するために特に重要です。プレートのストレージが結果を変える可能性を持っていることに注意してください。 注：明確な写真の場所プレートのために直立拡散光の領域でつや消し黒の背景にその蓋なしでは、レンズ（マクロモード）に近いオブジェクトに焦点を合わせることのできる高解像度カメラ（≥8MP）を使用します。また、白色光に設定し、トランスイルミネーターといくつかのゲルイメージャは、高品質、再現性の高い画像を生成することができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bolnick, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+intraspecific+trait+variation+matters+in+community+ecology.">Why intraspecific trait variation matters in community ecology.</a> Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).</li><li>Christensen, G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Staphylococcus+epidermidis+and+Propionibacterium+acnes+and+its+genomic+basis.">Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis.</a> BMC Genomics. 17 (152), (2016).</li><li>Faust, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+co-occurrence+relationships+in+the+human+microbiome.">Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome.</a> PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).</li><li>Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+nasal+microbiota+and+Staphylococcus+aureus+carriage.">The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage.</a> PLoS One. 5 (5), e10598 (2010).</li><li>Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonisation+and+interaction+between+S.+epidermidis+and+S.+aureus+in+the+nose+and+throat+of+healthy+adolescents.">Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).</li><li>Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+intraspecific+trait+variation+among+nasal+bacteria+shapes+the+distribution+of+Staphylococcus+aureus.">Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus.</a> Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).</li><li>Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+spatial+structure,+frequency+dependence+and+resistance+evolution+on+the+dynamics+of+toxin-mediated+microbial+invasions.">The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions.</a> Evol appl. 8, 738-750 (2015).</li><li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+and+the+ecology+of+the+nasal+microbiome.">Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome.</a> Sci Adv. 1, e1400216 (2015).</li><li>Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+are+alternative+agents+for+control+of+multiresistant+staphylococcal+strains.">Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains.</a> Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).</li><li>Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+application+of+S.+epidermidis+prevents+colonization+by+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+in+mice.">Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice.</a> PLoS One. 6 (10), e25880 (2011).</li><li>Uehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+interference+among+nasal+inhabitants:+eradication+of+Staphylococcus+aureus+from+nasal+cavities+by+artificial+implantation+of+Corynebacterium+sp.">Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp.</a> J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).</li><li>Wos-Oxley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poke+into+the+diversity+and+associations+within+human+anterior+nare+microbial+communities.">A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities.</a> ISME J. 4, 839-851 (2010).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

他人からそれを区別し、この細菌種の競争プロトコルの重要なステップで、阻害剤の一晩のインキュベーションは、競合他社の単離物の添加前に隔離される。阻害剤の株は、阻害化合物を生成するために、この成長期間を必要とします。競合株を同一培地の上にオーバーレイされているように、この方法は完全な可能性を観察するための研究を可能にします 競合他社の株の増殖を妨害する阻害剤株の。その結果、このアッセイは、自然と何が起こるかを反映しています。 1分離株は完全にニッチに設立され、他方が正常にニッチに侵入することができるように、任意の阻害変数に対抗することができなければなりません。 誤って行うと、誤った結果を引き起こす可能性が最も高いこのプロトコルには2つの部分があります。まず、気化器ボトルの不完全な滅菌は、アッセイに細菌の混入導入することができます。 Incu滅菌容器に、ステップ3.6において気化ボトルを洗浄するために使用される培養液のbationを完全に滅菌したボトルを確認するために使用することができます。追加の殺菌が必要な場合などVirkonなどの消毒剤溶液中での追加の洗浄は、ステップ3.2で説明した界面活性洗浄剤で前洗浄に使用することができます。 誤った結果を引き起こす可能性がある第二段階は、競合他社株（ステップ6.1）の希釈です。希釈が最適でない場合には、阻害の明確な測定が容易に決定されなくてもよいです。このアッセイは、阻害剤を産生するS.対グラム陽性およびグラム陰性種の幅広い株をなど、様々な鼻の分離株を用いて最適化しました競合他社株7,8として黄色ブドウ球菌 SH1000。続いて、それを競合他社と阻害剤生産菌として様々なコアグラーゼ陰性とコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を使用してテストされています。競争相手として上述したもの以外の属のテスト時株は、接種物のための希釈のいくつかの最適化が必要になることがあります。 透明度スコアは繰り返しの間で大幅に変化した場合、特定の光学密度に設定することで、競合他社株接種物を標準化する必要があるかもしれません。しかし、これは、アッセイがセットアップにかかり、実験ごとに処理することができる株の数を削減する可能性がある時間が長くなります。視覚的に迅速な代替手段を提供することができるマクファーランド標準を使用して、適切なODに培養物を調整します。 この手法の1つの制限は、それが唯一の培養可能細菌に適用することが可能です。多くの研究は競争的排除の相互作用3,4,13を予測するために、16S rRNAの塩基配列決定を使用する理由です。しかし、遺伝的およびメタゲノム技術が唯一の種レベルにコミュニティのメンバーを区別することができ、および/または特定の種内の形質変化を考慮していません。 particulの関連性についてスクリーニングすることが可能です細菌種5の有無に形質をコードするAR遺伝子が、しかし、この種の排除と関連する可能性が高い遺伝子の事前知識を必要とします。 この技術の安全性の考慮事項は、細菌のエアロゾル生成のために、それが唯一のレベル2の安全キャビネットに研究室で使用される、または類似の安全上の注意事項を説明することができ、ということです。種内特性ばらつきを考慮し、菌のエアロゾルを発生させない分離株との間の競合をテストするための代替技術があります。そのような方法の一つは、同時拮抗アッセイ2です。この方法では、1分離株の接種材料を寒天プレート上に広げられ、最初は乾燥させた後に第二の分離株の接種材料は、上部にスポットまたは刺されています。これは、両方の阻害化合物を生成し、最初の栄養素​​を捕捉するために競合する、株は直接競合（同時拮抗作用）にある環境を生成することになります。 advantag同時拮抗アッセイを超える繰延増殖阻害アッセイのeは阻害剤の分離株は、常に完全に競合分離株の侵攻前に確立されているの競争上の優位性を持っているべきであるということです。これは、別の歪みが追加される前に、ほとんどのニッチでは、1分離株ではなく、2つの単離は、同時に8で追加されているよりも、確立されるように、環境に何が起こるかをより反映しています。 細菌のエアロゾル発生を回避するための別の方法として、注ぎよりもむしろ阻害剤の単離物の上に噴霧することができたトップアガー、に分離する競技者を追加することです。しかし、追加されたトップ寒天の量は、プレートの偶数カバレッジを確保するために、約3 mlであることが必要であろう。このボリューム内では、競合他社の分離株は、阻害剤の分離株と同じメディア上に成長されることはないので、縮小栄養素苦しむないだろう。競技者はまた、UNT任意の阻害化合物と直接接触しないであろう彼らはトップアガー中に拡散IL。このようなアッセイは、繰延阻害または同時拮抗作用として記述することができませんでした。 同様の方法は、以前の臨床S.間バシトラシン耐性のレベルを評価するために使用されています黄色ブドウ球菌は 10を分離します。プロトコル間の主な違いは、ここで説明し、それが10で説明した、などの機密（スコア0 inhibition-明瞭さを完了）または耐性後者のみ分類された競合他社の株（無inhibition-明快に部分的には1-5のスコア）です。繰延成長阻害アッセイは、したがって、特定の抗菌剤の生産に対する耐性のレベルをスクリーニングするために使用することができ、あるいは多剤耐性病原体に対して活性な新規な抗菌剤を検索します。 ホスト微生物叢が細菌コミュニティ9の望ましくないメンバーを排除するように操作され得ることが示唆されています。コリネバクテリウムまたは黄色ブドウ球菌の応用ylococcus表皮すでにS.を排除することが示されています人口11,12のかなりの割合で鼻孔内球菌のコロニー形成。競争的にホスト内細菌叢の望ましくないメンバーを除外することができ、特定の株への研究は、そのようなここで説明したものなどの技術を介して、したがって、将来の治療法につながる可能性があります。

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.

<table><tbody><tr><td>Brain heart infusion broth</td><td>Lab M</td><td>lab049</td><td>rich general purpose media</td></tr><tr><td>agar-agar</td><td>Merck Milipore</td><td>101614</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Plastic perfume vaporizer</td><td>not known</td><td>-</td><td>10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket</td></tr><tr><td>Universal bottles</td><td></td><td>no longer in production, alternative SLS BOT5006</td><td>28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon&amp;nbsp;</td><td></td><td>surface active cleaning agent&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

deferred growth inhibition assay to quantify the effect of bacteria-derived antimicrobials on competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

アッセイの結果は、中央にスポット阻害剤産生株（ 図1）の近くにオーバーレイされた競合他社の株の違いとして観察可能でなければなりません。これらの違いは、完全な阻害（ 図1A）、部分的な阻害（ 図1Bおよび1C）、無阻害（ 図1D）または正の関連性として解釈することができます。広く利用可能なラボは、S菌株表皮 Tü3298とS.表皮 Rp62A、およびS.表皮 Rp62AとS.黄色ブドウ球菌 Newmanのは、それぞれ図1Bおよび1Dに使用しました。我々は、これらの株は、このプロトコルを試験するために使用され得ることを示唆しています。 テストした種に応じて、完全な阻害と部分的な阻害は、最も可能性の高い抗菌ペプチド、抗生物質または他の拡散性の成長inhibitoの結果であります阻害剤産生株によって産生されるrsの。部分的な阻害はまた、阻害剤株6によって競合他社の取り込みに起因する歪みや栄養素の封鎖のための減少栄養利用にリンクされています。 同じ競合他社株に対して試験した異なる阻害剤を産生する分離株の間で阻止帯の大きさの比較は、次のいずれかの違いを示しています阻害剤生産菌によって産生される抗菌剤の量;メディアを通じて拡散する阻害剤の能力;阻害剤の種類が生成され、生成される阻害剤の競合株の抵抗レベル。同じ阻害剤産生株に対してテスト異なる競合他社の株の間で阻止帯の大きさを比較すると、生成される阻害剤に競合他社株の抵抗レベルの指標です。 細菌の一貫性のないアプリケーションが発生した場合のプレートを使用するべきではありません。例えば、テスト競合文化はあまりにも阻害ゾーンは、典型的には、（ 図2A）が観察されたよりも大きく、あまり明確に定義されたエッジに表示されます希薄である場合、これは、任意の比較ゾーンの測定値の信頼性に影響を与えるだろう。阻害剤産生株のスポットが完全に一晩のインキュベーションの前に乾燥されなかった場合、阻害剤の株は、典型的には、ゾーンの測定に影響を与えるだけでなく、透明度スコアに影響を与える可能性が明確に定義されたスポット（ 図2B）を形成広がっていない可能性があります。競合株である場合均等に噴霧していない、これは、細菌（ 図2C）の不均一広がりにつながることができます。競合他社株があ ​​まりにも集中している場合、それは競合他社の株が阻害剤株（ 図2C）の上に成長する可能性があり、極端な場合には、これは競合他社/インヒビター株の役割のいくつかの反転につながることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig1.jpg" /> 図1： 繰延増殖阻害アッセイから得られる定性的および定量的な結果の範囲増殖阻害についての結果は、（B）部分阻害（スコア1）、（A）完全な阻害（0のスコア）の範囲とすることができます、（C）部分阻害（2のスコア）（D）阻害なし（4のスコア）へ。ラベルは（Y）阻害剤の株の増殖のエッジと抑制の最も外側のエッジを示していますゾーン（X）。 A、B、CおよびDの結果は、最近のブドウ球菌の分離株について示されているで撮影プレートのための測定値を示す（E）に示すように0 mmのから10mm以上の阻害帯のゾーンのサイズ、（ 、C）または共通ラボブドウ球菌は、Sを分離します表皮 Tü3298（阻害剤）とS.表皮 Rp62A（競争相手）（B）、及びS.表皮 Rp62A（阻害剤）とS.球菌ニューマン（競技者）（D）。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig2.jpg" /> 図2： 貧しい技術による矛盾した結果の例 （た場合の結果は予想よりも異なる場合があります</stro競合他社株が均一に散布していなかった、あまりにも濃縮した場合はNG&gt;）競技株があ ​​まりにも希薄た、（B）阻害剤の株は、インキュベーション/プレートの前に完全に乾燥しませんでしたが、乾燥または（C）はありませんでした。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition at JoVE.com

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

繰延成長阻害アッセイは、競争上の細菌由来の抗菌剤の効果を定量化するために

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

deferred-growth-inhibition-assay-to-quantify-effect-bacteria-derived

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K ビュー.  University of Liverpool. The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

ビデオ: Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

免疫・感染学

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

ソフト寒天オーバーレイ技術の使用は、細菌産生阻害する化合物をスクリーニングするために

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

蛍光標識株の共同栽培による細菌細胞集団における種内競争のモニタリング

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

生物学

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

単細胞蛍光イメージングによる細菌間競争の定量化

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Bacterial Co-Incubation Assay: A Fluorescence Microscopy-Based Technique to Visualize Intraspecific Bacterial Competition at the Single-Cell Level

Source: Smith, S., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/62851">Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a fluorescence microscopy-based method to study bacterial competition at the single-cell level. This method provides insights into the structure and function of bacterial communities.

繰延成長阻害アッセイは、競争上の細菌由来の抗菌剤の効果を定量化するために

要約

さらに動画を探す

この動画の章