Name: isolation of murine embryonic hemogenic endothelial cells
Uploaded: 2016-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

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この作品は、助成金HL128064 byNIHサポートされていた、HL096360、EB017103、およびCTのイノベーションは、15 RMB-YALE-04 KKHに、およびNICHD / NIH T32HD007094を付与します。

特定の発達の窓の間にのみ出現する一過性および小細胞集団を研究に固有の技術的な問題に起因まだ揺籃期にあるフィールド - hematovascular開発の分野で多くの未解決の問題が残っています。上記で概説した技術は、ほとんどのラボで一般的に利用可能である試薬や機器を使用して、重要な発達の時点で胚組織における造血内皮細胞およびHSPC集団からでも単一細胞の単離を可能にすることにより、これらの問題の多くを改善します。我々のプロトコルは、独立した分析のために使用することができるYSおよびAGM由来の非造血内皮細胞分画の並列単離を可能にする、またはその後の分析における造血内皮細胞分画のためのコントロールとして。 この多色FACSベースの方法を用いて、造血内皮細胞の単離のキーポイントは、適切なスペクトル共同でmpensationと単色ゲートの正確な描画。このように、強く染色されていないと、単一色のコントロールは、すべての実験試行中に含まれることが推奨され、それらはこと - に沿ってアイソタイプ適合対照抗体で処理したサンプルと - 最初に適切なスペクトル補償及びゲートの図面を確立するために使用すること。しかし、非特異的な染色は、このように染色されていないと単色コントロールはFACS選別機の設定が最適化された後、ゲートの日常的検証のために十分であるこのプロトコルにより、最小限です。 不正確に描かれたSPのゲートは、このレポートに記載されたアプローチと特に懸念しています。以前の研究は、多能性幹細胞は、FACSによってSPにおけるそれらの出現のための生理学的基礎を形成する、ヘキスト赤色17の優先的な流出を示すことが示されています。我々は、造血、内皮細胞およびHSPCも同様SP細胞画分5,11内に見出されることが示されています。そのような中でカルシウムチャネルなどの薬物hibitorベラパミルは、膜貫通多剤耐性トランスポーターの様々な閉塞を経由してSP細胞におけるこのヘキスト染料流出の動作をブロックします。造血幹細胞および前駆細胞では、これは主に、ABCG2 / BCRP1トランス24を介して起こります。典型的には、ベラパミルSPの&gt; 50％の閉塞を誘発する、しかし、見ベラパミルによってヘキスト流出の全体的な程度とその後の閉塞は、おそらく、差動ヘキストで複数の多剤耐性トランスポータータイプの発現を変化させることに、発生のタイミングによって影響されることが示されています流出能力、およびベラパミル5に対する感度。したがって、強くベラパミル処置することが推奨され、ヘキスト染色陰性対照標準的に適切なSPゲーティングを確実にするために含まれる：SPゲートが正しく描画されている場合、SP細胞の数の顕著な減少がでヘキストで染色した試料中に検出されるべきベラパミルの存在。 我々は以前にソートすることが示されていますE9.5のマウス卵黄嚢からのSP細胞は〜80持っている- E9.5未分画の一致した数と比較した場合、メチルセルロースベースの造血培養でHSPCを生成するために90倍高い能力を、非ヘキストは全体YS組織細胞5を染色しました。 SPのさらなる特徴付けは、とのFlk-1 VE-カドヘリンE8.0で初期造血および血管発生時のマウス卵黄嚢で、かなりの表現があることが示されているが、幹の低発現（C-キット）および造血マーカー（CD45）。したがって、この発達時点、原始（非造血）EC、であるFlk-1 + / CD31 + / CD45 - 非SP細胞が優勢のように定義されました。内皮マーカーの発現は減少し、CD45およびc-kitの発現が増加し、E9.5とE11.5 5との間の in vitroで HSPCを生成するために増加する能力との併用としてこの発現プロファイル移行します。これはE9.5とE11.5の間で最も顕著になって、YS組織の造血活性は、SP内に含まれていることを示唆している、と回の出現内皮特性の時限損失および造血能力の段階的な買収を通じてる。このように、SP表現型を生じる多剤耐性輸送体の発現は、造血内皮5の重要な表現型マーカーです。実際には、AGMからの非SP細胞は、血液形成の可能性12を示しません。ヘキスト染色を経由してSPのこのように、成功した分離YSおよびAGMの両方は、細胞が与えられた組織の造血幹細胞区画から選別され、この分画内の細胞のその後の抗体染色は、造血の差別（のFlkできるようになることを保証するには-1 + /のc-kit + / CD45 - ）HSPC（Flk1- /のc-kit + / CD45 +）集団5,11,12対。また、以前になって卵黄嚢とAGM組織のSP内のCD41 +細胞は、メチルセルロースベースの培地11,12に多系列コロニー形成することができることを指摘しています。私たちは、のFlk1 +ののc-kit + CD45 - SP細胞などの造血内皮細胞を定義しますFlk1およびCD45の発現は5,11事実上相互に排他的であることを私たちの発見与えむしろCD41よりも、造血系の指定されたマーカーとしてCD45を使用しての。これは、両方の内皮細胞（FLK-1）を持つSP内の細胞の純粋な単離を可能にし、造血への遷移内皮のために必要な特性（C-Kit）を幹が、これらにCD45が存在しないことによって決定されるようにまだ、この変更を受けていないいます細胞。最近ゴメスらによって報告されたように、CSF1R +へのFlk-1 - /のc-kit + / CD45 + / SP細胞、（組織マクロファージ）とCsf1r-（HSC）割合として定義され、HSPC人口のサブ​​分画を考慮することが有用であろう25、これは組織マクロファージ前駆細胞集団に対する真のHSPCのより高い解像度を提供するであろうが、これは分離我々がCSF1R以来概説しているマクロファージ前駆細胞26のマーカーである造血内皮細胞画分の完全性に影響を与えるべきではないとして。 HemogENIC内皮細胞は、（1含ん - 内皮細胞の3％）YSおよびAGMの両方において稀亜集団であり、従って、それらの研究における大きな課題は、その後の用途のために不十分な細胞収率です。このプロトコルは、通常、10〜20％のみであっても最適な条件の下でわずか数百の細胞を生じ得るソートの時間、および複数の胚から得られたプールされた組織からの代表的な造血の内皮細胞ソートによって実行可能な残りのセル70〜80％において結果メチルセルロースの製造コロニーの中に埋め込まれた細胞を取り出しました。組織が急速に解剖し、プールされるべきであり、サンプルは可能な限り氷上に維持する必要があります。ソートされた細胞数を最大化するために、強く研究者は手順のすべてのステップを通して組織および細胞生存率を確保するための措置をとることをお勧めします。サンプルは、直前にFACSソーティングに新たに調製し、説明するようメチルセルロース文化に直接高血清コンテンツ、またはを含むコレクションチューブにソートしておく必要があります上記日間。生存能力の問題が解消されない場合は、収集管は、さらにソートされた細胞の生存を強化するために、血清で予めコーティングすることができます。造血内皮細胞の収率が低いままの場合、成人骨髄または市販のフルオロフォアコンジュゲートビーズは、本明細書に記載の胚組織由来の単一カラーコントロールの代わりにスペクトル補正のために使用することができます。選別された細胞を培養することを意図している場合は、造血内皮細胞およびHSPCは、組織培養ウェルに直接ソートしておく必要があります。選別された細胞は、DNAまたはRNAに関連する遺伝子発現解析のために意図されている場合は、造血および非造血、内皮細胞およびHSPC細胞の損失を最小限にするために、試料溶解緩衝液を含むコレクションチューブに直接にソートすることができます。 概説技術は成功した（と同時）造血および非造血内皮細胞の単離、ならびにHSPCと同じ胚組織から成熟血液細胞分画を可能にします。このアプローチは、別のスタッドを可能にします内皮細胞は、血液を生成するように発生する重要な遷移の分子基盤のy座標。洞察は、優勢な造血障害の治療のための幹細胞を、潜在的に自己次に多能性のヒト造血の内皮細胞及びHSPC子孫の生成を最適化するために使用することができ、これらの発達の研究から得られた、と。

機能的な循環系は、血管や血液細胞の並行開発が必要となります。血液の開発（原始造血）の初期段階では、赤芽球の起源を激しく1を議論まま。これとは対照的に、血液細胞の発達（決定的な造血）の後期段階で、それは卵黄嚢、胎盤、およびAGM内で多系列HSPCは、潜在的な（造血内皮細胞）を形成し、血液を取得する特殊な血管内皮細胞から生じることが次第に明らかになってきました2-5と同様に、卵黄と臍帯血管、胚性心内膜6、および頭部血管系7インチこれらの異なる組織内造血の内皮細胞の仕様は、開発の特定の段階で発生します。例えば、〜E8.25で卵黄嚢内と〜E10 8-12でAGM内。それにもかかわらず、あってもこれらの特定の発生の窓、造血エンドの人口中11,12 - （卵黄嚢とAGMの内皮細胞の3％1）thelial細胞は、すべての内皮細胞の小さな割合を表します。造血内皮細胞「仕様」のプロセスは、マウス、ならびにヒト、造血のために重要です。造血細胞は、卵黄嚢の血管の内皮細胞およびヒト胚13における大動脈から出芽することが示されており、いくつかの研究室は、ヒト多能性幹細胞からの血液細胞産生は14-16中間内皮細胞が必要であることを実証しました。このように、マウスの造血内皮細胞の表現型を定義し、ヒト多能性幹細胞から造血内皮細胞の生成のためのin vitro技術の追求を促進すべきであるこの動物モデルでの開発につながる分子事象を理解します。今度は、多系列HSPCから分化した血液細胞型の大規模な生成のためのアプローチの最終的な開発 - 自体はDERI中間生理学的に関連する造血内皮細胞を介したヒト多能性幹細胞からVEDは - 血液学、腫瘍学および再生医療のための信じられないほどの治療可能性を持っているでしょう。この目標に向かって、我々は、マウスの卵黄嚢11とAGM 12、胚発生の間に決定的なHSPC生産の2の主要なサイト内で、クローンレベルで、造血内皮細胞の表現型を定義しています。 HSPCのような成人の骨髄17、胚性造血内皮細胞およびHSPCの展示内のヘキスト染料流出特性、したがって、FACSプロット5,11,12上の細胞の「サイドポピュレーション」（SP）（ 図3に示すように）内に表示されます。また、我々はまた、造血内皮細胞が両方の内皮細胞のマーカーを発現し、（それぞれのFlk1とCKIT、）幹細胞が示されているが、造血系マーカー、CD45 5,11,12を発現しません 。したがって、造血内皮細胞は、identをすることができますifiedとのFlk1 + / CKIT + / CD45 - SP細胞としてFACSによって単離し、そして我々は、これらの細胞が卵黄嚢とAGM細胞5,11,12のFlk1- / CKIT + / CD45 + SP画分内に含まれるHSPCを生じさせることが示されています。造血内皮細胞およびHSPCは、または（ 図1に示されるように）ex vivoでの胚培養で最大48時間培養した胚から同定され、卵黄嚢や新鮮に安楽死させた胚のいずれかから収穫AGM組織から単離することができる。 エクスビボ文化が選択可能になります薬理学的薬剤との個々の胚の前処理は、そしてまた、所望の導入遺伝子（ すなわち、レンチウイルス形質導入によって）の一過性発現を可能にします。本明細書に記載の方法により造血、内皮細胞およびHSPCのFACS同定は、遺伝子操作マウスモデルにおける決定的造血発達の定量的尺度として使用することができます。細胞は、血液-FOを含むその後の実験的なアプリケーションのために取得することができますrmingアッセイ、発現解析、および移植。 動物対象：を使用して倫理的配慮 文学の成長体は、胚発生の決定的な造血段階中HSPC形成に対する造血内皮細胞の重要な貢献を確立しています。しかし、造血運命に向かって内皮細胞の亜集団の仕様を促進する生理的条件及び信号はよくわかっていないままであり、したがって、まだインビトロの設定で模倣することはできません。実際、この論文に記載された技術は、ex vivo造血内皮細胞の仕様とHSPCの生産のためのアプローチは、1日が開発されるかもしれないようにhematovascular開発の分野の理解を改善するための我々の研究室や他のグループによって現在使用されています。そのような時まで、ただし、フィールドは、プライマリ、野生型由来の組織（および遺伝子に依存したままtically修正された）マウス胚は、さらなる研究のために造血内皮細胞およびHSPCを指定し得ました。造血内皮細胞およびHSPCを確実に識別し、いずれかE8.5から単離することができる（10から12体節対）卵黄嚢またはE10.5（35から40体節対）11,12 AGM。複数の組織のプール- （これらの組織内の総内皮細胞11,12の3％、典型的には1を表す）造血内皮細胞の相対的な希少性のために（〜8から10）は、単一のサンプルに同腹子強くするために推奨されますその後の実験のために十分な細胞を得ます。造血内皮細胞およびHSPCが正しく同定され単離されたことを検証は、造血分化を誘導する条件下で取得された細胞を培養することによって達成することができます。これらの条件下では、造血の内皮細胞及びHSPCはERYを含むコロニーの出現をもたらす、多系統の造血性分化を示すことになりますthroid前駆細胞（BFU-E）、顆粒球およびマクロファージ前駆細胞（CFU-GM）、および顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球前駆細胞コロニー（CFU-GEMM）。

<table><tbody><tr><td>DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td>TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling.</td></tr><tr><td>Absorbent bench underpad</td><td>Covidien</td><td>7134</td><td></td></tr><tr><td>#5 Straight Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>8.5 cm straight scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Isothesia)</td><td>Henry Schein&amp;nbsp;</td><td>50033</td><td>TOXIC inhalant: Use in fume hood.</td></tr><tr><td>100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000 U/ml Penicillin, 10,000 mg/ml Streptomycin, 29.2 mg/ml L-glutamine)&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Type II Collagenase</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;#956;M nylon cell strainer</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31 - PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>561259</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td>TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25 mg/ml in distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, store aliquots at -20 &amp;#176;C until ready for use.</td></tr><tr><td>Verapamil Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>1711202&amp;nbsp;</td><td>TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling.&amp;nbsp;&amp;nbsp; Prepare stock solution of 5 mM (100x) in 95% ethanol.&amp;nbsp; Store at -20 &amp;#176;C until ready for use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>Thaw and aliquot per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Modified Giemsa Stain</td><td>Sigma</td><td>GS500</td><td>TOXIC: Contains Methanol - use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution.</td></tr><tr><td>Cytospin Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Clipped Funnel Starter Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120110</td><td>Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge</td></tr><tr><td>Anti-Mouse B-220 - FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Gr-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-85</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter-119-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (4.5 g/L)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Buffered Salt Solution</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate</td><td>EMD Millipore</td><td>PIFB24P05</td><td></td></tr><tr><td>IgG2A-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>IgG2B-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>556923</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of murine embryonic hemogenic endothelial cells

胚の血管内皮からの造血内皮細胞の仕様が明確な組織内の短い発達期間中に発生し、マウスの胚体外の卵黄嚢、胎盤、臍帯血管、および胚の大動脈 - 生殖腺 - 中腎（から決定的なHSPCの出現のために必要ですAGM）領域。この細胞集団の一時的な性質および小さいサイズは慎重に定量化し、実験的な用途のために、その再現性の分離が技術的に困難にします。私たちは、卵黄嚢とAGMにおけるそれらのピーク発生時間中に造血内皮細胞およびHSPCの同時単離するための蛍光活性化セルソーティング（FACS）ベースのプロトコルを確立しました。我々は、マウス胚から卵黄嚢とAGM組織の切開のための方法を実証する、と私たちは前にFACSを介して識別と検索に最大細胞生存のために最適化された組織消化および抗体共役条件を提示します。代表的FACS ANA溶解プロットは、それは造血内皮細胞およびHSPCの表現型を特定し、クローンレベルで彼らの血形成の可能性を評価するためのメチルセルロースベースのアッセイを記載して示されています。

成功した胚YSまたはAGMからの造血内皮細胞およびHSPCのラベリング、図3に示す代表的なプロットと類似のFACS散布図を生成しますが。（図示せず）が、前方および側方散乱によって標準生細胞とダブレット差別に続いて、サイドポピュレーション（SP）イベントは「肩」としてベラパミル非存在下での線形ヘキストレッドヘキスト対ブルー差プロットで可視化されている（非SP）イベント（ 図3A）の過半数から左にシフト。総生存YS細胞の3％3 - - 総生存AGMイベントの5％SPゲートが正しく描画されたときに、SP細胞は、約1を表します。ベラパミルの処理にかかわらず、組織源のSPイベントの&gt; 50％阻害（ 図3A、上部パネル）をもたらすはずです。我々は以前のSP肩の外に現れるだけでなく、ベラパミルによってブロックされている他の集団は、TER119陽性erythrであることを決定しましたoblasts、およびしたがって、当社のSP人口5から除外されています。 SPと比較して、非SP細胞は、SP「肩」（ 図3A）に隣接するセルの密集クラスタとして識別されます。この集団は、CD31 + / CD45 -イベントとして、CD45-FITCの娘プロット（ 図3B）対CD31-PEを使用して区別することができる非造血ECが含まれています。バック比較的容易に選別することができるAGM（ 図3B）または卵黄嚢（ 図示せず ）、およびこれらの細胞の高い数から非SP細胞の5％ -非造血ECは、典型的には2です。 HSPCおよび造血ECの同定のために、娘のゲートは、CD45 +およびCD45 -細胞を同定、SP画分から描かれている。ここで、CD45 +細胞は、&lt;通常、AGM（ 図3C）またはYS（ 図示せず ）の両方における全イベントの20％です。造血ECは、その後のFlk1-PECy7の娘のp対の差動CKIT-APCでCD45 - 細胞から同定されています多くの二重陽性事象として、典型的には1表す- AGM（ 図 3 D）またはYSのいずれかから単離された場合CD45-事象の3％（ 図示せず ）。 HSPCはFlk1- / CKIT +細胞としてのFlk1-PECy7娘プロット対別々 CKIT-APCでCD45 +画分から同定され、また、典型的には約25表している-のいずれかYSから得られたとき（CD45 +細胞の小集団の30％をありません示されている ）またはAGM（ 図3 E）。したがって、造血EC及びHSPCの両方が（全細胞事象の〜0.01％）、非常にまれであり、このプロトコルは、複数の胚からの組織をプールした場合でも、各細胞型の数百を返すことが典型的です。娘プロットでゲイツは、陰性対照群を参照して確立されるべきです。特異的および非特異的抗体染色を区別するために、ゲートが最初に両方の非染色コントロール（ 図3を参照して描画します蛍光コンジュゲートアイソタイプ一致（のIgG2aまたはIgG2bの）コントロール抗体（ 図示せず ）で処理されたC）、ならびにサンプル。この後者の制御は、非特異的な染色は、我々はアイソタイプ適合対照抗体（ 例えば 、IgG2aの-PEまたはIgG2bの-FITC）は、最初にFACSソーター設定を最適化し、ゲートの境界を決定するために使用することをお勧めします、したがってながら、このプロトコルによって最小限であることを示しました、我々はまた、未染色のコントロールがソートルーチンFACS時にゲート境界と実験の品質を確認するのに十分であることがわかります。ゲートが適切に描画される場合は、未染色またはアイソタイプ適合対照から録音するとき、最小の正の散布は、単一または二重陽性ゲートで観察する必要があります。 AGMとHSPCから造血内皮細胞はメチルセルロース（ 図4A）での培養の14日間の造血分化を受けます。コロニータイプの相対的な割合は、典型的には、これらの中で観察され培養物を組織源に依存します。 E10.5 AGMから単離された造血内皮細胞は、主にCFUを生じるのに対し、BFU-EにE8.5-E9.5の所与の上昇、CFU-GM、およびいくつかのCFU-GEMM 5で卵黄嚢組織から単離された造血内皮細胞-GEMM 12、 図4B（左上のパネル）に示すように、他の系統はまだ観察されているが。 HSPCは、これらの細胞はまた、同様に他の造血コロニー型に分化するが、また、メチルセルロース培養の際にCFU-GEMMに主に上昇する（ 図4B、上部中央のパネル）を得E10.5 AGMから単離されました。非造血内皮細胞（CD31 + / CD45 -非SP）も（ 図4B、右上のパネル）メッキされています。これらの細胞は、14日後の造血文化の中で全く成長を示しません。 造血aの発現をせずに細胞を含む細胞型を発現する個々の表面マーカーの造血能力のアッセイ、ND内皮マーカーはCD31、のFlk1、C-Kitは、VE-CAD E10.5でのAGMのSP画分内で、CD41、およびCD45を制限されて実行され、E10.5 AGMでその多系列コロニー形成活性を実証​​されてきましたCD31 +に、VEカドヘリン+、c-キット+、CD41 +およびCD45 + SP細胞の12。興味深いことに、コロニー形成活性は、両方のFlk-1 +およびFLK-1 - SP細胞で認められたが、唯一のFlk1 +ののc-kit + CD45 - SP細胞は、両方の「石畳によって特徴づけ中間内皮単層を介して、多系列コロニーを生じさせました「内皮細胞の形態（ 図4B、左下パネル）とのDil-AcLDLの取り込み12による。また、C-kitの発現はAGM SPセル12の造血活性のために必要です。 造血の内皮細胞と比較した場合、いくつかの骨髄前駆細胞に類似した形態学的特性を有することが示されているが、骨髄性前駆細胞がCD45を発現し、多系列コロニーを生成することができません<ein vitroでのメートル&gt;。 HSPCはまた、多系列コロニーを生成しますが、これらの細胞が、CD45は、彼らがFLK-1発現12,23を欠き、根本的な内皮単層（ 図4B、右下のパネル）することなく、丸みを帯びた細胞クラスターを生じます。したがって、人口は我々は、SCLのよう造血内皮を定義する（または、FLK-1 + /のc-kit + / CD45-SP細胞）血液はGATA-1/2、LMO2含む可能性と堅牢hematoendothelial遺伝子発現を、形成して内皮細胞を表します/造血幹細胞および前駆細胞、ならびにそれらの非造血内皮細胞の対応は異なっているタル-1、ランクス-1、C-キット、CD34、CD41、およびCD45 11。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig1.jpg" /> 図1. ワークフロー全体を。簡単に言えば、胚は妊娠中のダムから除去され、YSまたはAGM組織が ​​収穫されます。胚は、オプション2のために培養することができます<html> 4から48時間のex vivoでの組織の収穫の前に。収穫YSまたはAGM組織は、対照およびサンプルチューブに分注し、単一細胞懸濁液に消化し、Hoechst色素および/または蛍光標識抗体の存在下でインキュベートされます。ベラパミル、カルシウムチャネル阻害剤は、また、SP画分の正確なゲーティングの検証のための本質的なネガティブコントロールを生成するために使用されます。造血内皮細胞をFACSによって識別されているようなのFlk1 + / CKIT + / CD45 - SP細胞、HSPCは、細胞のFlk1- / CKIT + / CD45 + SP画分の中に含まれている間、両方の細胞型は、造血ポテンシャルの確認のためメチルセルロース上にソートされています。 （必要であれば、検索された）また、非造血内皮細胞は、CD31 + / CD45 -非SP細胞と識別することができます。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54150/54150fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> igure 2 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg &quot;/&gt; YSおよびAGM組織の 図2. 解剖。 A）YSは、E10.5胚のトランクの両方前肢及び後肢芽下水平カットすることによって単離される）E8.5胚から離れて切開、およびその後の消化。Bのための無菌のHBSS +中に全体が配置されます。 AGMは、その後、肢芽や鉗子を使用して、腹側の組織から分離されている。C）明視野画像は、E10.5胚= 1ミリメートル（スケール）からYSとAGMの両方の解剖を示す。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54150/54150fig2large.jpg" target="_blank">の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig3.jpg" /> 差別 のためのゲートの階層を実証する 図3. 代表的 プロットE8.5 YSから FACSによる 造血内皮細胞 の（のFlk1 + / CKIT + / CD45 - SP細胞）、HSPC（Flk1- / CKIT + / CD45 + SP細胞）、および非造血内皮細胞（CD31 + / CD45 -非SP） の またはE10.5 AGM。（ 図示せず ）、前方および側方散乱によってYS（左パネル）またはAGM（右パネル）のいずれかからの細胞の生細胞とダブレット差別に続いて、A）サイドポピュレーション（SP）ゲートが描かれ、検証されますベラパミル処理したネガティブコントロールでSP画分の有意な減少によって。非SP集団は、SPに隣接するセルの密集クラスタとして識別されます。 20,000のイベントが表示されている提示プロットの各B）非造血の内皮細胞は、非SP画分内CD31 + / CD45-細胞として同定され、そして2表す- AGMから得られたかどうか、非SP細胞の5％（図示）またはYS（ 図示せず ）。 discriへminate造血ECまたはHSPC、C）娘ゲートは、CD45 +およびCD45-細胞を同定するために、SP画分から引き出されている。D）AGM（図示）またはYS（ 図示せず ）のいずれかからの造血の内皮細胞の同定のためには、追加のドーターゲートが描かれていますCD45-画分からCKIT +（cKit-対）及び（Flk1-対）のFlk1 +細胞を区別するために。 YSまたはAGMのいずれかから造血EC通常、〜1である- 。CD45-イベントの3％E）HSPCはCKIT +とFlk1-としてCD45 +画分から同定され、そして典型的には20表している- AGMから選別するかどうかをCD45 +細胞の30％を（図示します）またはYS（ 図示せず ）。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54150/54150fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig4.jpg" /> 図4. Visuaメチルセルロース 。A）メチルセルロース上にメッキの7日以内にソートされた個々の細胞からコロニーをフォーム上の造血内皮細胞の培養および HSPCを以下の造血分化のlization。多系統の造血の可能性は明確なコロニーの形態11の評価によって識別され、複数の造血コロニーの種類を観察することにより確認することができる。 図示していない AGM（またはYSからソートされた造血ECおよびHSPCのB）位相顕微鏡イメージング、）多系列の造血を表示メチルセルロース培地中での培養の7日後にコロニー形成。 （ 図示していないか、YS、）AGMから非造血ECは、これらの条件下で成長を示すものではありません。より高い倍率では、古典的な「丸石」内皮細胞の形態（白矢印）を有する接着細胞をCULに造血細胞のクラスターを生じる分かります造血ECのトゥーレス。そのような内皮細胞がソートされたHSPC（スケール= 100ミクロン）の培養で観察されない。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54150/54150fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）は、まだ少しはいくつかの内皮細胞は、血液が形成になることを指定するプロセスについて知られている、開発中に特殊な（造血）内皮細胞に由来します。我々は、マウス胚組織から造血内皮細胞およびHSPCの同時分離を可能にするフローサイトメトリーベースの方法を示しています。

マウス胚性造血内皮細胞の単離

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

isolation-of-murine-embryonic-hemogenic-endothelial-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K ビュー.  Yale University School of Medicine. 造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）は、まだ少しはいくつかの内皮細胞は、血液が形成になることを指定するプロセスについて知られている、開発中に特殊な（造血）内皮細胞に由来します。我々は、マウス胚組織から造血内皮細胞およびHSPCの同時分離を可能にするフローサイトメトリーベースの方法を示しています。 

ビデオ: Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These regions are crucial in establishing the blood system in the embryos and leads to the eventual movement of stem cells into the fetal liver and then development of adult stem cells in the bonemarrow. Early hematopoietic stem cells can be isolated from these organs through microdissection of the embryo followed by flow cytometric sorting to obtain a more pure population. It remains unclear how these stem cell populations contribute to the fetal and adult stem cell pool.   Also, our lab investigates how early stem cells functionally differ from fetal and adult hematopoietic stem cells. Furthermore, our lab sorts different populations of hematopoietic stem cells and test their functional role in the context of a variety of genetic models. In this video, we demonstrate the micro-dissection procedure we commonly use and also show the results of a typical FACS plotfter isolating these rare populations, it is possible to perform a variety of functional assays including: colony assays and bone marrow transplants. 



This video shows how to micro-dissect the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region from embryos and use flow cytometry to sort hematopoietic stem cells.

マウス卵黄嚢とAGMから早期の造血幹細胞の分離

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

生物学

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

神経科学

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies revealing novel paradigms in vascular biology. Applying these methods to models of vascular development requires the optimization of cell isolation techniques from embryonic and postnatal tissues. Cell yield, viability, and purity all need to be maximal to obtain accurate and reproducible results from next-generation sequencing approaches. The neonatal mouse retinal vascularization model is used by researchers to study mechanisms of vascular development. Researchers have used this model to investigate mechanisms of angiogenesis and arterial-venous fate specification during blood vessel formation and maturation. Applying next-generation sequencing techniques to study the retinal vascular development model requires optimization of a method for the isolation of retinal endothelial cells that maximizes cell yield, viability, and purity. This protocol describes a method for murine retinal tissue isolation, digestion, and purification using fluorescence-activated cell sorting (FACS). The results indicate that the FACS-purified CD31+/CD45- endothelial cell population is highly enriched for endothelial cell gene expression and exhibits no change in viability for 60 min post-FACS. Included are representative results of next-generation sequencing approaches on endothelial cells isolated using this method, including bulk RNA sequencing and single-cell RNA sequencing, demonstrating that this method for retinal endothelial cell isolation is compatible with next-generation sequencing applications. This method of retinal endothelial cell isolation will allow for advanced sequencing techniques to reveal novel mechanisms of vascular development.

This protocol describes a method for the isolation of murine postnatal retinal endothelial cells optimized for cell yield, purity, and viability. These cells are suitable for next-generation sequencing approaches.

次世代シーケンシングのためのマウス網膜内皮細胞の単離

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

発生生物学

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

胚心室内皮細胞の単離

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

初代マウス肺内皮細胞の単離

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

免疫・感染学

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

血管壁からのマウスCD34+ 幹細胞の単離と磁気分離

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

著者スポットライト:磁気ビーズスクリーニング結合フローサイトメトリーを使用した血管壁常在マウスCD34+ 幹細胞の分離と特性評価の強化

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

マウスからの血管壁常在型CD34+ 幹細胞の免疫磁気的単離

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

マウス胚性造血内皮細胞の単離

要約

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マウス卵黄嚢とAGMから早期の造血幹細胞の分離

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

次世代シーケンシングのためのマウス網膜内皮細胞の単離

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

プライマリマウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

胚心室内皮細胞の単離

初代マウス肺内皮細胞の単離

ネズミ弁内皮細胞の単離

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

マウスからの血管壁常在型CD34⁺ 幹細胞の免疫磁気的単離

マウス胚性造血内皮細胞の単離

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初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

次世代シーケンシングのためのマウス網膜内皮細胞の単離

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

胚心室内皮細胞の単離

初代マウス肺内皮細胞の単離

ネズミ弁内皮細胞の単離

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

マウスからの血管壁常在型CD34+ 幹細胞の免疫磁気的単離

プライマリマウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

マウスからの血管壁常在型CD34⁺ 幹細胞の免疫磁気的単離