私たちは、最大効率や歩留まりのためのプロトコルを最適化する助けたロスラボの前にメンバーを承認したいと思います。

インフルエンザH3N2 VLPの生成1.哺乳動物発現系<ol><li>サブクローン例えば前述のpTR600のような真核生物発現ベクター内へのウイルス構造糖タンパク質ヘマグルチニン（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）のGag P55 7 </li><li>化学的にコンピテントな大腸菌（ 例えば 、DH5α）でDNAを増幅し当たり、製造業者の指示としてプラスミド精製キットを用いてトランスフェクショングレードのプラスミドを単離します。 DNAの量は、収率及びユーザのニーズに依存しています。 </li><li>加湿インキュベーター中5％CO 2で37℃で10％胎児ウシ血清（FBS）を含む増殖培地中で、哺乳動物細胞株、293Tを維持します。 </li><li> T-150組織培養フラスコは、フラスコには、次の日までに完全な細胞接着と百分の85から95までの細胞集密度を取得するように、フラスコ当たり45から75×10 6個の細胞を含むように細胞を増殖させます。希望conflu用顕微鏡下で細胞を検査ency。 注：高細胞密度は、典型的には、しかしながら過剰コンフルエント副産物細胞廃棄物の蓄積をもたらし、細胞生存率を減少させることができる商業的なトランスフェクション試薬を使用した場合、最小限の細胞毒性で最適なタンパク質の発現を得るために推奨されます。 </li><li>トランスフェクションの日に、製造業者の推奨に従ってリポソームとDNAの混合物を準備し、1のDNA組成物とDNA細胞をトランスフェクション：HAの2：1 NA：T-150フラスコあたり40μgの総DNA量とギャグ。各フラスコに20〜30 mlで全容積を含むように、抗生物質を含まない無血清トランスフェクション培地中でDNAとリポソーム溶液を希釈します。 注：遺伝子構築物の比率は、ユーザーの最適化を必要とし得ます。 1比：ここで実証されていないが、同様のトランスフェクション手順は、1で呼吸器合胞体ウイルス（RSV）FとHIV GAGと行われています。 DENVとCHIKV単一の発現プラスミドを、T-150フラスコあたりのDNAの20μgの合計に最適な電子のために使用されていますXPRESSION。 DNA：トランスフェクション試薬の比をユーザに最適化されています。使用はすなわち 、トランスフェクション法に基づくトランスフェクション培地を推奨、ポリカチオン性脂質トランスフェクションは、メディアが成長ホルモンを補充し、血清の非存在下での成長をサポートするために、微量元素することができるこのようにウシ胎児血清の減少または不在をお勧めします。 </li><li> 5％CO 2インキュベーターで37℃にフラスコを返します。 200ミリリットルの容量については、9 T-150フラスコを使用しています。細胞は、VLPの収穫日までトランスフェクション培地中で維持されています。 </li><li>収穫培養抗原に応じて72〜96時間後、トランスフェクション後の細胞からの上清、またはときに、顕微鏡検査によって推定されるように、細胞生存率は70〜80％に減少しました。転送50mlコニカルチューブに上清とは、細胞破片をペレット化し、4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。 注：付着細胞への新鮮予め温め、無血清トランスフェクション培地で3日間の上澄み液の交換はyielます類似またはわずかに低下し収率でVLPのダ第2のロットは、ユーザーが最適化されるべきです。 </li><li>超遠心分離を介して、沈降前に0.22μmの細孔膜を通じたプール上清およびフィルタ。 </li><li> 0.8％の七面鳥または哺乳動物の赤血球を使用して、標準的な血球凝集アッセイ14によるHA発現VLPの赤血球凝集活性を試験または抗原特異的ELISAを進めます。代表的な結果については、 図2を参照してください。 </li></ol>バキュロウイルス/昆虫細胞系を用いて2 CHIK VLP式<ol><li>商業バキュロウイルス発現系を用いて、S-27株からチクングニアウイルスのカプシドおよびエンベロープタンパク質（C-E3-E2-6K-E1）を発現する組換えバキュロウイルスを生成します。 </li><li> 28℃で100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを有する無血清Sf9細胞増殖培地中で培養スポドプテラ・フルギペルダ Sf9細胞。 suspens用スピナーフラスコ培養を開始するために3-5×10 5 C / mlで使用しイオンの細胞増殖。日常の通路彼らは2-4×10 6 C / mlの（3〜4日毎）の細胞密度に達します。 </li><li>スピナーフラスコ中の懸濁液中の培養Sf9細胞マルチスターラープレートシステム上で130rpmで撹拌しながら。適切な通気のために、スピナーフラスコの半分以下音量で培養容量を維持します。 </li><li> CHIK VLPの発現のために、1の感染多重度で組換えバキュロウイルスで、2×10 6細胞/ mlの密度で、Sf9細胞を感染し、28℃のインキュベーターに戻します。典型的には250mlのSf9細胞を含む1つまたは2つのスピナーフラスコを感染させます。 注：私たちは、このメソッドを使用していないが、Sf9細胞をシェーカープラットフォームを使用して28℃で振盪フラスコ中で培養することができます。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってトリパンブルー排除によって決定されるように細胞生存率が70〜80％に減少した72〜96時間の感染後、または後に収穫培養。 注：細胞は、感染しながら増殖し続けるとがあります3日、感染後に組換えCHIK VLPをバキュロウイルスに感染したSf9培養における〜80％の生存率（解像度）。バキュロウイルス感染細胞は、外観が大きくなっています。形態はまた、長楕円形をラウンドから変更されることがあります。バキュロウイルス感染の後期段階では、細胞が溶解し始めました。 </li><li>円錐管50ミリリットルに懸濁培養から直接文化を移し、4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。 </li><li>上清を収集し、超遠心分離を介して沈降する前に、0.22μmの細孔膜でろ過します。 </li></ol> VLP /のSVPの3沈降/精製<ol><li>バイオセーフティーフード内で70％エタノール、25ミリメートル×89ミリメートルオープントップの超遠心管を滅菌します。エタノールを使用する前にオフに乾燥していることを確認します。 </li><li>きれいなチューブに上清の32ミリリットルまでロードします。 25ミリリットルの最小容量は崩壊し、不十分満たされた超遠心管の損傷を防止することをお勧めします。 </li><li>慎重下敷き上清ウィットPBS中のH無菌3 mlの20％グリセロール（v / v）です。チューブがバランスしていることを確認してください。 </li><li> 4℃で4時間、135,000×gでスピン。 </li><li>ペレットがチューブから外れるません確実に上清を吸引し、。 </li><li>再懸濁を激しくピペッティングにより滅菌PBSでチューブの底にVLPのを沈降させました。 PBSの量は、VLPは、VLP総タンパク質収量と下流のアプリケーションに依存して再懸濁する必要がありました。一般的に、少なくとも100μlの各VLPペレットを再懸濁します。 </li><li>短期記憶および長期保存のために-80℃で貯蔵のためにストアサンプル4°C。 </li></ol> 4.タンパク質収率および特異抗原の収量を決定します<ol><li>製造業者のプロトコルに従って、このようなBCAアッセイなどの市販のタンパク質定量法を用いて、総タンパク質含有量を決定します。 </li><li>特定の抗原含量を評価するために、標準的な抗原及び2-5の連続希釈液を塗布して直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を行います1; ELISA 96ウェル平底プレートへの総タンパク質試料のG。 <ol><li>プレート上の抗原の存在を探索し、マイクロプレートリーダーのための検出可能な吸光度を産生するために、従来のELISAの開発の基板を使用する抗原特異的な抗体を用いて、次のとおり。 VLPを、HAを発現するサンプルのHAおよびELISAアッセイの代表的な結果については、 図2を参照してください。 HAとNAの多くの組み合わせは、おそらくですが、収量はHA-NAの互換性15時に異なる場合があります。 注：抗原特異的抗体は、可変の親和性を持って、抗体の終点希釈滴定は、VLPの定量化を行う前に決定されることが推奨されます。市販の抗体は、濃度または希釈範囲ELISAで使用するための、ならびに提案したプロトコルを提案しているでしょう。 </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice.">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li><li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy.">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li><li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A/goose/Guangdong/1/96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+:+Morbidity+and+mortality+weekly+report.">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は成功し、様々な病原体のための複数の構造タンパク質で構成のSVPとのVLPを発現し、精製するために、上述の技術を使用しています。一般的に、我々は我々のVLPを生成するために、哺乳動物発現系を使用しています。しかし、私たちの手で、哺乳動物細胞は、CHIKのVLPの収量が低かった派生しました。組換えバキュロウイルス - 昆虫細胞系を使用する場合CHIKのVLP収率はより堅牢でした。?...

ウイルス様粒子（VLP）は、ヒトのワクチン接種のために承認された技術です。実際には、ヒトパピローマウイルス（HPV）を含む多くの現代的なライセンスワクチンの一部及び肝炎Β（HepΒ）ワクチンは、このアプローチを採用します。 VLPは自己集合することが可能な構造タンパク質から形成されます。組み立てられた粒子は、ウイルスの形態を模倣するが、彼らはウイルスゲノムを欠くので感染または複製することはできません。 VLPは、発現され、原核生物および真核生物系の数から精製することができます。 - 28％、酵母- 20％、植物- 9％、昆虫- 28％、および哺乳動物- 15％1細菌：文献のレビューは、異なった発現系は、以下のレートで使用されていることを明らかにしました。注目すべきは、L1カプシドタンパク質に基づくHPVワクチンは、酵母（ガーダシル）または昆虫細胞システム（サーバリックス）2で製造されます。 HepΒワクチン、RecombivaxとENGERIX-Βは、また、酵母で生産されており、HepΒ表面抗原3で構成されています、4。 我々は、アセンブリのための複数の構造タンパク質の同時発現を必要とするのVLPを産生する哺乳動物および昆虫細胞発現系を使用します。インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、デング熱ウイルス（DENV）、およびチクングニアウイルス（CHIKV）：私たちの仕事は、人間の病原体に対する設計、生産、および精製VLPに基づくワクチンに焦点を当てています。我々の方法は、複数の発現プラスミドからの複数の構造タンパク質、または単一の発現プラスミド（ 図1）の共発現を可能にするために十分に柔軟です。以前、我々は、製造および精製H5N1 VLPは、インフルエンザ赤血球凝集素（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、及びヒト胚性腎臓293T細胞におけるマトリックス（M1）5,6をコードするプラスミドとの共発現から組み立て。遺伝子は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化さpTR600、transcを開始するためのサイトメガロウイルス初期プロモータープラスイントロンAを含む真核細胞発現ベクターにクローニングしました。真核生物の挿入と転写7の終結のためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルのription。 HA、NA（ 図1A）および代替ウイルスマトリックスタンパク質、HIVのGag P55、の三プラスミドの同時発現を用いて同様のアプローチがこの研究にヒト季節性インフルエンザ亜型H3N2 VLPの生成に使用し、生成することが示されていますインフルエンザ粒子8と同様のサイズのVLPを。インフルエンザワクチンは、主に抗HA抗体を誘発するが、インフルエンザノイラミニダーゼの添加は、トランスフェクトされた細胞9も存在する追加の免疫原性標的から出芽VLPを可能にするためにシアリダーゼ活性を媒介します。 RSVのVLPを生成するために、我々はまた、先に説明し、電子顕微鏡6,10によって特徴付けられるように、さらに、HIVギャグを使用して、VLP形成の柔軟性を実証するために排他的にRSV表面糖タンパク質を提示原型ワクチンを設計するHIVのGagの無関係なコアを選択しました。他人以前それはRSV糖タンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）11、およびインフルエンザマトリックス12から種々のウイルス成分を用いて組み立てることができる提示するVLPを示しています。全長表面糖タンパク質配列は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を介して機能的受容体結合および抗体認識のアッセイのために必要とすることができる天然のコンホメーションを維持するために、この研究において使用しました。 粒子を生成するために単一のプラスミド発現系を使用するための私達の例としては、DENVおよびCHIKVあります。 DENVのケースでは、我々は、PRM / E構造遺伝子発現カセット13を含む単一プラスミドからの293T細胞における無カプシドとサブウイルス粒子（のSVP）を生成することができます。用語SVPは、ウイルス構造タンパク質のアセンブリにおいて、コアまたはカプシドタンパク質の欠如を示すために使用されます。 CHIK VLPはまた、カプシドおよびエンベロープタンパク質をコードする、またはIで、CHIKV構造遺伝子カセットを含む単一プラスミドを用いて製造することができます昆虫細胞発現（ - C 図1B）のために最適化された同じ構造遺伝子カセットをコードする組換えバキュロウイルスに感染させることによってnsect細胞。 上述の式アプローチの最終結果は、その後、20％のグリセロールクッションを介して超遠心によって精製することができる細胞培養培地中にVLPを放出します。本稿では、哺乳動物および昆虫細胞系からこれらのVLPを発現し、精製する方法を提示します。

<table><tbody><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 multipoint stirrer plate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Polyclear ultracentrifuge tubes</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size</td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate citrate buffer</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-phenylenediamine dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m vacuum filter top (500 ml)</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>339741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

expression and purification of virus-like particles for vaccination

ウイルス様粒子（VLP）およびサブウイルス粒子（のSVP）は、ライブ病原体の使用よりも増加した生物学的安全性と安定性の利点を提供するウイルスワクチン設計の代替的なアプローチです。非感染性および自己集合、VLPは、ライブの病原体または抗原の送達のための組換えウイルスベクターの必要性を迂回し、免疫原としての構造タンパク質を提示​​するために使用されます。この記事では、前臨床動物試験で将来のアプリケーションのためのVLPの設計と開発のさまざまな段階を示しています。抗原の選択、選択、VLPを/のSVPの精製、および抗原投与のための定量化の細胞株における抗原の発現：手順は、以下の段階を含んでいます。私たちは、抗原の発現のための両方の哺乳動物および昆虫細胞株の使用を実証し、方法論は収量が異なる方法を示しています。提示された方法論は、様々な病原体に適用することができるし、免疫原性STRで抗原を置換することによって達成することができます興味のあるユーザーの微生物のucturalタンパク質。 VLPおよびのSVPは最高のワクチン候補の抗原の特徴付けおよび選択を支援します。

VLPの収量は、ウイルス抗原構造物の設計によってばらつきがありました。このプロトコルでは、我々は、超遠心分離によって上清中のSVPまたはVLPの産生および精製のための昆虫および哺乳動物細胞を使用することを実証しました。 DENVのprM / E構造遺伝子発現カセットの4つのサブタイプは、 表1の（1-4として画定）DENVのSVPのバージョンを構築する0.6 mlの体...

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Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

expression-and-purification-of-virus-like-particles-for-vaccination

Research

JoVE Journal

Biology

21.8K ビュー.  University of Georgia. ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。 

ビデオ: Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for safe and effective therapies tailored to individual tumor immune profiles. Oncolytic viruses enable the induction of anti-tumor immune responses as well as tumor-restricted gene expression. This protocol describes the generation and ex vivo analysis of immunomodulatory oncolytic vectors. Focusing on measles vaccine viruses encoding bispecific T cell engagers as an example, the general methodology can be adapted to other virus species and transgenes. The presented workflow includes the design, cloning, rescue, and propagation of recombinant viruses. Assays to analyze replication kinetics and lytic activity of the vector as well as functionality of the isolated immunomodulator ex vivo are included, thus facilitating the generation of novel agents for further development in preclinical models and ultimately clinical translation.

This protocol describes a detailed workflow for the generation and ex vivo characterization of oncolytic viruses for expression of immunomodulators, using measles viruses encoding bispecific T cell engagers as an example. Application and adaptation to other vector platforms and transgenes will accelerate the development of novel immunovirotherapeutics for clinical translation.

腫瘍標的免疫のパラミクソ ウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

がん研究

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

アラントイック液からの高力価組換えニューカッスル病ウイルスの生産

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチの開発のための抗原キャプシド取り込み戦略を活用

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

免疫・感染学

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

トリマーエピトーププレゼンテーションを必要とするワクチンに対する大腸菌の自己組織化タンパク質ナノ粒子の産生

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

生物工学

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane vesicles (OMVs) are mainly secreted by gram-negative bacteria during average growth, with a nano-sized diameter and self-adjuvant activity, which may be ideal for vaccine delivery. OMVs have functioned as a multifaceted delivery system for proteins, nucleic acids, and small molecules. To take full advantage of the biological characteristics of OMVs, bioengineered Escherichia coli-derived&#160;OMVs were utilized as a carrier and SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) as an antigen to construct a &#34;Plug-and-Display&#34; vaccine platform. The SpyCatcher (SC) and SpyTag (ST) domains in Streptococcus pyogenes were applied to conjugate OMVs and RBD. The Cytolysin A (ClyA) gene was translated with the SC gene as a fusion protein after plasmid transfection, leaving a reactive site on the surface of the OMVs. After mixing RBD-ST in a conventional buffer system overnight, covalent binding was formed between the OMVs and RBD. Thus, a multivalent-displaying OMV vaccine was achieved. By replacing with diverse antigens, the OMVs vaccine platform can efficiently display a variety of heterogeneous antigens, thereby potentially rapidly preventing infectious disease epidemics. This protocol describes a precise method for constructing the OMV vaccine platform, including production, purification, bioconjugation, and characterization.

The present protocol describes the bioengineering of outer membrane vesicles to be a "Plug-and-Display" vaccine platform, including production, purification, bioconjugation, and characterization.

SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate antigen-displaying VLPs. Surface antigen-specific antibodies are coupled to, and thus immobilized on a solid and insoluble matrix such as beads. Due to their high affinity to the target antigen, these antibodies can capture VLPs decorated with the cognate antigen anchored in the membrane envelope of the VLPs. This protocol describes the binding of antigen-specific antibodies to protein A- or G-conjugated magnetic beads. In our study, human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs formed by the group-specific antigen (Gag) viral core precursor protein p55 Gag and displaying the envelope glycoproteins (Env) of HIV are examined. The VLPs are captured utilizing broadly neutralizing antibodies (bNAbs) directed against neutralization-sensitive epitopes in Env. The VLP capture assay outlined here represents a sensitive and easy-to-perform method to demonstrate that (i) the VLPs are decorated with the respective target antigen, (ii) the surface antigen retained its structural integrity as demonstrated by the epitope-specific binding of bNAbs used in the assay and (iii) the structural integrity of the VLPs revealed by the detection of Gag proteins in a subsequent Western blot-analysis. Consequently, the utilization of bNAbs for immunoprecipitation facilitates a prediction of whether VLP vaccines will be able to elicit a neutralizing B cell response in vaccinated humans. We anticipate that this protocol will furnish other researchers with a valuable and straightforward experimental approach to examine potential VLP-based vaccines.

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle VLP-Based Vaccines Using a Capture Assay

Here, we present a protocol to detect neutralization epitopes on antigen-displaying virus-like particles (VLPs). Immunoprecipitation of the human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs is performed using envelope glycoproteins-specific monoclonal antibodies coupled to protein G-conjugated magnetic beads. Captured VLPs are subsequently subjected to SDS-PAGE and Western blot-analysis employing viral core protein Gag-specific antibodies.

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate ...

Generating a Multivalent-Displaying Outer Membrane Vesicle Vaccine

Source: Feng, R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/64213">A &#34;Plug-And-Display&#34; Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates a method to generate multivalent-displaying outer membrane vesicle (OMV) vaccines. Mammalian cells are transfected to express and secrete viral antigens fused to a SpyTag and a polyhistidine tag. These antigens are then purified using a nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity column. The purified antigen is mixed with outer membrane vesicles expressing surface-bound SpyCatcher (SC) protein. Multiple antigens covalently attach to SpyCatchers via their SpyTags (ST), creating OMVs that display the antigen, serving as a multivalent vaccine.

多価表示外膜小胞ワクチンの作製

1. Plasmid construction

	Insert DNA encoding SpyCatcher sequence (Figure 1) into an ampicillin-resistant pThioHisA-Cytolysin A (ClyA) plasmid (see Table ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫療法

免疫原性とワクチン開発

A Technique for the Generation of Influenza Virus-Like Particles via a Mammalian System

Source: Arevalo, M. T., et al.&#160; <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54041">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the generation of influenza virus-like particles (VLPs) in a mammalian system. Upon expressing three eukaryotic expression vectors &#8212; encoding different viral structural proteins &#8212; in suitable mammalian host cells, the expressed viral proteins self-assemble into VLPs on the host plasma membrane and release via budding from the cell surface.

哺乳類系を介したインフルエンザウイルス様粒子の生成技術

Source: Arevalo, M. T., et al.&#160; Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the ...

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

要約

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腫瘍標的免疫のパラミクソウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

アラントイック液からの高力価組換えニューカッスル病ウイルスの生産

アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチの開発のための抗原キャプシド取り込み戦略を活用

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

トリマーエピトーププレゼンテーションを必要とするワクチンに対する大腸菌の自己組織化タンパク質ナノ粒子の産生

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

多価表示外膜小胞ワクチンの作製

哺乳類系を介したインフルエンザウイルス様粒子の生成技術

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

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高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

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腫瘍標的免疫のパラミクソウイルス: 設計と評価 Ex Vivo