我々は、プロトコル上の重要なフィードバックのためにエリザベス・バーン、デイヴィッドGootenberg、クリスティーナGosmannに感謝したいと思います。サンプル調製の指導やデモのためのミーガン・ボルドリッジ、スコット・ハンドリー、シンディモナコ、そしてジェイソン・ノーマン。プロトコルのアドバイスと実りある議論のためのウェンディ・ギャレット、カーティスHuttenhower、スキップヴァージン、そしてブルース・ウォーカー。および配列決定をサポートするためのジェシカHoisington-ロペス。この作品は、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団とNIAID（1R01AI111918）によってサポートされていました。 DSKは、バローズウェルカム基金から追加支援を受けました。 MNAは、受賞数NIGMSからT32GM007753、とポールとデイジー・ソロスフェローシップによってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIGMSまたはNIHの公式見解を示すものではありません。

<ol>
	<li>Huttenhower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486, 207-214 (2012).</li><li>O'Hanlon, D. E., Moench, T. R., Cone, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf</a> (2008)</li><li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greengenes,+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB.">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).</li><li>Vazquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMPeror:+a+tool+for+visualizing+high-throughput+microbial+community+data.">EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data.</a> GigaScience. 2, 16 (2013).</li><li>Eren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+diversity+of+Gardnerella+vaginalis+in+the+genitourinary+tract+microbiota+of+monogamous+couples+through+subtle+nucleotide+variation.">Exploring the diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous couples through subtle nucleotide variation.</a> PloS one. 6, e26732 (2011).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature biotechnology. 31, 814-821 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここでは、人間の膣スワブ内での相対的な細菌存在量の同定および特徴付けのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、容易にそのような糞便や他の身体部位のスワブのような他のサンプルタイプ、および多種多様な供給源から収集されたサンプルに適合させることができます。フェノールおよびクロロホルムの緩衝溶液中のビーズビーティングによる核酸の抽出は、臨床研究を通じて収集貴重なサンプルを扱うときに特に重要である、DNAとRNAの両方を単離することができます。 RNAの同時コレクションは、RNA-seqのを介して機能性細菌、ホスト、およびウイルスの寄与を決定する機会を提供しながら、単離された細菌DNAは、細菌の分類学的同定およびゲノムアセンブリに最適です。記載したプロトコルを正常ヒト、イヌ、および環境サンプル10を含むサンプルタイプの広範囲に展開された検証一工程プライマーセットを使用して</suP&gt;。バーコードプライマーの何千人もの利用可能性は、シーケンシングコストをサンプルと膨大な貯蓄の多重化を可能にします。 200サンプルが多重化されているとき（全ての試薬、単一の配列決定ラン、及びプライマーではなく、機器を含む）完全なコストは、サンプルあたり約$ 20です。また、同じサンプルサイトからの複数の綿棒がパイプライン全体を通して独立して処理されている非常に高い再現性があります。全体的に、プロトコルは、コスト、効率的で柔軟性、信頼性、および再現性があります。 このプロトコルの核酸抽出部分をフェノール及びクロロホルムで作業する際に必要な安全上の注意事項、および高スループット、96ウェルプレートフォーマットへのパイプラインを自動化するという課題によって制限されます。また、積極的なビーズの鼓動は約6キロベースの断片に機械的溶解ばさみのための細菌のDNAを使用します。より長いDNA断片を、ビーズビーティング秒の期間、下流側アプリケーションに必要である場合houldを短縮します。このプロトコルの細菌同定部分の制限は、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定に依存している任意の方法に固有です。 16S rRNAの塩基配列決定属、さらには種レベルに細菌同定のための理想的ですが、まれに歪みレベルの識別を提供しません。 16S rRNA遺伝子のV4可変領域は、ほとんどの細菌種11の間で強固な識別を提供するが、そのようなOligotyping 31のような付加的な計算方法は、正確にこのようなラクトバチルスcrispatusなどの特定の種を同定するために使用される必要があり得ます。このプロトコルは、この目的に向けて使用することができる全ゲノムDNAとRNAの抽出を可能にしても最終的には、特定のサンプル内の正確な細菌の機能的能力についての情報は、単独で、16S rRNA遺伝子の配列決定により決定することができません。 このプロトコルで成功を確保するために最も重要なステップは、汚染のDURを防止するために、細心の注意を取っていまする試料収集、核酸抽出、およびPCR増幅。清潔な手袋を着用してと滅菌綿棒、チューブ、はさみを使って、サンプル収集の時に無菌性を確認してください。コレクション物質の汚染について評価するために、サンプリング時に輸送管に直接追加未使用の綿棒を配置することによって、陰性対照スワブを収集します。ラボでは、唯一の除染物資を含有し、唯一の分子グレード、DNAフリー試薬を用いて滅菌フード内のすべての前の増幅の手順を実行します。核酸抽出時には、各サンプルに新しい滅菌ピンセット、新鮮な手袋を使用し、使用中の場合を除き閉じたすべてのチューブを維持することによって交差汚染を防止します。並行して、未使用の綿棒を処理するサンプル収集及び核酸抽出の両方の無菌性を保証します。未使用の綿棒は、イソプロパノール沈殿及びエタノール洗浄後、ペレットを得てはなりません。ペレットが表示されない場合は、の可能性のあるソースを決定するために、16S rRNA遺伝子の増幅を行います汚染（ 例えば、 連鎖球菌やブドウ球菌の存在は、皮膚の汚染を示すであろう）。また、PCR試薬と反応が汚染されていないことを確認するために並列に鋳型なしコントロール反応でPCR増幅を行います。バンドはテンプレートなしのコントロールに表示されている場合、試薬を廃棄し、新たな試薬と増幅を繰り返します。これらの予防措置をとることは目的の細菌の正常なシーケンシングを保証します。 PCR増幅工程は、ほとんどのトラブルシューティングを必要とする傾向があります。 12サンプルのセットで増幅し、効率性と一貫性の間のバランスを提供します。与えられた増幅セット内のすべてのサンプル全体でのバンドの完全な欠如は、 例えば、試薬を追加し忘れたり、間違ってサーモサイクラーのプログラミングを、系統的な障害を示します。いくつかのサンプルからのバンドの不在は通常、ヒューマンエラーによるものであり、増幅は再-Rでなければなりませんサンプルおよびリバースプライマーの同じペアとアン。バンドの連続不在の場合には、試料は、異なるバーコードを有するリバースプライマーを使用して再増幅することができます。複数のリバースプライマーを用いて繰り返し増幅の失敗は、試料中に存在する阻害剤を示すことができます。その場合には、カラムでDNAを洗浄することは、しばしば大幅に相対的な細菌の存在量を変更することなく、阻害剤を除去します。複数のバンドが増幅後に生じた場合は、異なるリバースプライマーのバーコードでサンプルを再増幅します。 ライブラリー・プールを作成する際に、環境汚染を防止し、単一の特定の製品の増幅を確保することに加えて、成功したシークエンシングは、介護に依存しています。目標は、約シーケンシング同じ数のサンプルあたりの読み込みを保証するために、各サンプルのアンプリコンの等モル量を組み合わせることです。増幅前に核酸濃度が同等である場合は、単純に各SAの等容量を追加しますmpleのアンプリコンライブラリー・プールを作成するときには十分です。核酸の濃度が非常に異なると等量で添加されている場合には、低い核酸濃度を有するサンプルは不十分読み取りの低い数で表されます。この場合には、ゲルのバンドの相対強度に基づいて、低濃度サンプルからアンプリコンのより高い量を添加することが可能です。あるいは、より厳密に各試料の等モル量を、個々のアンプリコンのプライマーを除去蛍光のdsDNA定量キットを使用して、個々のサンプルのアンプリコンの濃度を定量し、正確に組み合わせることも可能です。 バランスのとれたアンプリコンのプールが生成されると、それは慎重にプールの濃度を測定することが重要となります。その後の慎重な希釈およびスパイクでPHIXで読み取り複雑さを増加させるためには、最適な配列決定の結果を達成するために重要です。 sequenを使用するハイスループットシーケンサー合成によってcingフローセル上のクラスタ密度に非常に敏感です。あまりにも低い品質スコア、下位データ出力、および不正確な分波32と、overclusteringになります集中しているライブラリープールをロードします。あまりにも希薄されたライブラリーのプールをロードすると、低データ出力になります。慎重に配列決定前にライブラリープールを定量化することは、最適な結果を保証します。 16S rRNA遺伝子配列決定は、所与の試料内に存在する細菌の包括的な評価を提供し、仮説生成における絶対的に重要な最初のステップです。さらに、メタデータの豊富なセットの存在は、特定の細菌種及び重要な生物学的要因との関連性をテストするための研究を可能にします。また、同一の16S情報は、PICRUSt 33のようなツールを使用して細菌の機能を推定するために使用することができます。最終的な目標とすることができる新規の関連付けを識別するために16S特徴付けを使用することですさらに、ヒトの健康および疾患に対する細菌microbiomeの影響の成長を続ける当社の理解に追加、モデル系でテストおよび検証。

人間の下生殖器官、消化器系、呼吸器、皮膚を組織の恒常性を維持し、ホスト1の健康をサポートするために重要である複雑な細菌群集によって植民地化されています。例えば、特定の乳酸菌は、膣円蓋を酸性抗菌エフェクターを生成し、ローカルホスト免疫2-4を調節することにより、病原体のための無愛想環境を作成します。細菌microbiomeの重要性の高まり感謝も多くの臨床の状況で細菌群集を特徴づけるの関心を増大させました。ここでは、生殖器スワブからの細菌microbiomeの組成を決定する方法を説明します。プロトコルは、容易に他の解剖学的位置および他の宿主種から収集便試料及びスワブ用に修正することができます。 与えられたスタッドから収集し、保存することができるサンプル数に固有の制限のためにYの参加者は、このプロトコルは、適合フェノール-クロロホルムベースのビーズビーティング法5,6を使用して単一の綿棒から潜在的にDNA、RNA、さらにタンパク質を抽出するために設計されました。洗剤とビーズビーティングおよび化学的破壊を有する細菌の細胞壁の物理的破壊の組み合わせは、追加の酵素消化段階なしに、グラム陽性、グラム陰性、および抗酸菌の迅速な溶解を可能にします。高品質のRNAを得るためには、すぐに回収後、実験（該当する場合）への輸送中に、またはC°4以下に保たれた乾燥綿棒を使用することをお勧めし、-80℃で長期間保存されます。 与えられた試料内の細菌microbiomeを決定するには、この手順は、現在、総合的に細菌の分類を割り当て、相対定量を行うための最も費用対効果の高い手段である16S rRNA遺伝子アンプリコンのシーケンシングを利用します。代替方法では、標的のqPCR 7、カスタムmicroarrを含みますAYS 8、及び全ゲノム配列9。 16S rRNA遺伝子は、9超可変領域を含み、膣microbiome研究のためのシーケンスに最適なV領域に関するコンセンサスはありません。ここでは、515F / 806Rプライマーセットを使用し、Caporaso らによって設計されたパイプラインの上に構築。10-12。 Caporaso らの515F / 806Rプライマーセットが原因検証バーコードプライマーとイルミナシーケンシングプラットフォームとの互換性の何千もの可用性に単一の配列決定ランでのサンプルの何百もの多重化を可能にします。人間Microbiomeプロジェクトの27F / 338Rプライマーセット13とは異なり、515F / 806Rも有効Bifidobacteriaceaeを増幅し 、したがって、正確ガードネレラ膣 、一部の女性では膣の微生物群集の重要なメンバーは、キャプチャします。あるいは、338F / 806Rプライマー対は、正常膣サンプル14及び515F / 926Rプライマー対はRECEを有するのパイロシーケンシングのために使用されていますntly次世代シーケンス12のために利用できるようになります。 最後に、このプロトコルは、微生物生態学（QIIME）ソフトウェアパッケージ15に定量的洞察を使用して、16Sアンプリコンの分析を実行するための基本的な手順を説明します。ここで説明するQIIMEコマンドの実装を成功させるには、各サンプルの細菌分類学上の存在量を含むテーブルを生成します。 QIIMEウェブサイト（http://qiime.org/index.html）に詳細に記載されるように多くの付加的な品質管理工程、分類学的分類方法、及び分析ステップは、分析に組み込むことができます。分析は、Appleコンピュータ上で実行する場合は、MacQIIMEパッケージ16は QIIMEとその依存関係の簡単なインストールを提供します。 16S rRNAの遺伝子配列解析のための代替ソフトウェアパッケージはMothur 17とUPARSE 18が含まれます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>PCR workstation</td><td></td><td></td><td>Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600.</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td>Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200.</td></tr><tr><td>Electrophoresis system</td><td></td><td></td><td>Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Any other DNA quantification method will be sufficient</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful.</td></tr><tr><td>MiSeq or HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catch-All Sample Collection swab</td><td>Epibio</td><td>QEC89100</td><td>Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher</td><td>04-355-31</td><td></td></tr><tr><td>SteriFlip 50 ml filtration device (0.22 &amp;micro;m)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mm glass beads</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>2 ml screw-cap tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td>For bead beating</td></tr><tr><td>UltraPure 5M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9856</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9260G</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution</td><td>Fisher</td><td>BP1311-200</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-free distilled water</td><td>Ambion</td><td>10977-015</td><td>Molecular Biology Grade, for buffer preparation</td></tr><tr><td>2-Propanol BioReagent, for molecular biology, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ML</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td>Warning: Toxic</td></tr><tr><td>3 M Sodium Acetate, pH 5.5</td><td>Life Technologies</td><td>AM9740</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Disposable sterile polystyrene forceps, PS</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06443-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml, clear, PCR clean tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td></td></tr><tr><td>PCR grade water</td><td>MoBio</td><td>17000-11</td><td>For PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Sigma</td><td>D7295-0.5mL</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1492-3900</td><td>Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioExpress</td><td>E-3121-25</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE buffer</td><td>Lonza</td><td>51216</td><td></td></tr><tr><td>DNA gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6x DNA Loading Dye</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>50 bp GeneRuler Ladder</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>SM0373</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA kit</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>UltraClean PCR Clean-up Kit</td><td>MoBio</td><td>12500-100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td>An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primers:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>515F (forward primer) 5&#039;-AATGATACGGCGACCACCGAG&lt;br/&gt; ATCTACACTATGGTAATTGT&lt;br/&gt; GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3&#039;</td><td></td><td></td><td>Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &amp;micro;M. **&lt;strong&gt;Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.**&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded&lt;br/&gt; _primers_515F_806R.txt</td><td>IDT is recommended</td><td></td><td>If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 &amp;mu;M. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and&lt;br/&gt; _resuspension.doc.&amp;nbsp; **&lt;strong&gt;Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.**&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Read 1 Sequencing Primer 5&#039;-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3&#039;</td><td></td><td></td><td>25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>Read 2 Sequencing Primer 5&#039;-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3&#039;</td><td></td><td></td><td>26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>Index Sequencing Primer 5&#039;-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3&#039;</td><td></td><td></td><td>27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX.</td></tr></tbody></table>

efficient nucleic acid extraction and 16s rrna gene sequencing for bacterial community characterization

人間の健康と病気の重要な調節因子として微生物群集の役割のための成長の感謝があります。ハイスループットシークエンシング技術は、さまざまなソースからの16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を使用して細菌群集の迅速かつ効率的な特徴付けのために許可されています。 16S rRNA配列の分析のために容易に利用可能なツールは、計算ワークフローを標準化しているが、DNA抽出のための試料処理は、研究間の変動の継続元のままです。ここでは、綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。我々はまた、シーケンシングライブラリーの生成、データ品質管理、および配列分析を含む16S rRNA遺伝子配列決定のための下流の方法を描きます。ワークフローは、解剖学的位置と宿主種の多様から収集した便や綿棒など、複数のサンプルタイプを、対応することができます。また、DNAを回収し、RNAを分離して使用することができます全ゲノムシーケンシングまたはRNA-seqのなど、他のアプリケーションのため。記載された方法は、複数のサンプルのタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、ゲノムメタゲノムおよび転写情報を下流の解析に対応しています。

<html> 16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を使用して、綿棒からの相対的な細菌の存在量の決意を可能にするプロトコルの一般的な概要は、1【選択プロトコルは人間の膣スワブ用に最適化された図に示されているが、簡単にほとんどの粘膜サンプリングサイトに適合させることができます他のホスト。 図2ビーズビーティングプロトコルを用いて単離することができる高品質のDNAとRNAを示す。 図3は、サンプルと各増幅が正しいの単一の強いバンドが得られた12サンプルの成功したPCR増幅を示しますサイズと各水対照バンドが得られなかった。 図4、配列決定前に最終的なライブラリープールの定量化を示している。 図5のシングルエンド300 bpのMiSeqランの後に典型的なシーケンスの品質プロファイルを示します。 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 53939 / 53939fig1.jpg &quot;/&gt; 図1プロトコルの概略概要まず 、核酸は、イソアミルアルコール、フェノール、クロロホルムなどを含む緩衝液中でビーズビーティングによりスワブから抽出されます。 16S rRNA遺伝子の可変領域4は、その後、PCRを用いて得られた核酸から増幅されます。サンプルの数百までからのPCRアンプリコンは、単一の実行に合わせて、配列決定されます。結果のシーケンスは、相対細菌の存在量を決定するための参照データベースに一致しています。プロトコル全体は約3日で実施することができる。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53939/53939fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig2.jpg" /> 図2.高品質の核酸抽出は、フェノールを用い：クロロホルムビーズはMを打ちますethod。 （A）DNAの品質、分光光度計を用いて評価しました。 1.8と2.0の間のA260 / A280比は、フェノール又はタンパク質で汚染されていない純粋な核酸を示している。（B）カラムクリーンアップの後、このプロトコルは高品質のRNAを得ることができる、強力な16Sおよび23S rRNAのピークによって示されました。サンプルは採取後（輸送および保管中に）冷たい保たれていない場合（C）RNAの分解が発生する可能性がありますまたはリボヌクレアーゼが処理中に存在している場合。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53939/53939fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig3.jpg" /> 515Fとバーコード806Rプライマーセットを使用して成功した16S rRNAの遺伝子増幅の図3.確認。トップ ）ゲル電気泳動は、380塩基対の周囲の単一バンドの存在を確認するために使用されるInはテンプレートを用いて増幅したすべてのサンプル。バンドの不在が失敗した増幅を示しています。これが原因で、ヒューマンエラーと繰り返されるべきで、そのサンプルからのPCR反応に通常である。 ボトム ）いいえテンプレート（水）コントロールは、バンドの存在を持つべきではありません同じプライマー対と並行して実行されます。水管理におけるバンドの存在は、汚染された試薬を示しています。そのプライマー対のためのテンプレートや水管理の両方のPCR増幅を汚染し、再実行することができる試薬を廃棄する。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53939/53939fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig4.jpg" /> 個々の試料のアンプリコンをプールした後、 ライブラリサイズの最終図書館プール濃度および検証の図4.定量。、目最終的なライブラリープールの電子濃度が決定されなければなりません。ライブラリプールはその後さらに2 nMの濃度を達成するために希釈しなければならない。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53939/53939fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig5.jpg" /> 図5.代表バー読むの各位置でのシーケンス品質スコアのプロット。シーケンスの品質は200塩基対の後にドロップするのは正常ですが、平均品質スコアが30以上に維持する必要があり<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53939/53939fig5large.jpg" target="_blank">、より大きなバージョンを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> #SampleID </td><td colspan="2"> バーコード <br/&gt;シーケンス</td><td colspan="3"> LinkerPrimer シーケンス </td><td> rcbcPrimer </td><td> SampleType </td><td> 抽出 バッチ </td><td> 増幅 プレート </td><td> 説明 </td></tr><tr><td> http://qiime.org/_static/Examples/File_：#An例マッピングファイルはで見つけることができます フォーマット/ Example_ マッピング_ FILE.TXT </td><td colspan="2"></td><td colspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> AG2350 </td><td colspan="2"> TCCCTTGTCTCC </td><td colspan="3"> CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT </td><td> rcbc000 </td><td>頸部の 綿棒</td><td> 1 </td><td> A </td><td></td></tr></tbody></table> 表1 のマッピングファイルのテンプレート。クレアティン正確かつ徹底したマッピングファイルが正常にプロトコルを実行するために重要です。マッピングファイルはQIIMEを実行するために必要とされるだけでなく、それはまた、サンプルバーコードとメタデータとの間のリンクを維持するために、任意の体系的バイアス（ 例えば、バッチ間変動）のデータを分析すること、および決定するために研究を可能にしますメタデータと細菌集団の間で興味深い相関関係。ベアボーンマッピング・ファイルが提供されていますが、ユーザーは、可能な限りメタデータを含むなど、多くの列を追加することをお勧めします。膣スワブのための追加のメタデータの例としては、綿棒コレクション、ホルモン避妊薬の種類（該当する場合）、性感染症検査結果などの参加の年齢、日付/時間を含みます<img alt="Suppliment 1" src="/files/ftp_upload/53939/53939suppliment.jpg" /> バーコードリバースプライマー配列 10 の補足ファイル1.一覧 </suP&gt;。最初の3列は、マッピングファイルを完了するために使用することができ、最後の列は目的を注文するため、全プライマー配列を提供しています。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53939/Supplemental_Code_File.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

私たちは、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて細菌群集の特徴付けのために綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。方法は、複数のサンプルタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、下流分析プロセスの数を収容します。

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

efficient-nucleic-acid-extraction-16s-rrna-gene-sequencing-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

38.2K ビュー.  Massachusetts General Hospital. 私たちは、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて細菌群集の特徴付けのために綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。方法は、複数のサンプルタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、下流分析プロセスの数を収容します。 

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Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

リアルタイムPCRによる沿岸堆積物および定量16SのrRNA遺伝子と転写物からの同時DNA-RNA抽出

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

環境学

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

遺伝学

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data may include mobile genetic elements, such as plasmids and extrachromosomal phage, that contribute to the dissemination of antimicrobial resistance and further complicate treatment of urinary tract infection (UTI). In addition to providing fine resolution of genome structure, complete, closed genomes allow for the detailed comparative genomics and evolutionary analyses. The generation of complete genomes de novo has long been a challenging task due to limitations of available sequencing technology. Paired-end Next Generation Sequencing (NGS) produces high quality short reads often resulting in accurate but fragmented genome assemblies. On the contrary, Nanopore sequencing provides long reads of lower quality normally leading to error-prone complete assemblies. Such errors may hamper genome-wide association studies or provide misleading variant analysis results. Therefore, hybrid approaches combining both short and long reads have emerged as reliable methods to achieve highly accurate closed bacterial genomes. Reported herein is a comprehensive method for the culture of diverse urinary bacteria, species identification by 16S rRNA gene sequencing, extraction of genomic DNA (gDNA), and generation of short and long reads by NGS and Nanopore platforms, respectively. Additionally, this method describes a bioinformatic pipeline of quality control, assembly, and gene prediction algorithms for the generation of annotated complete genome sequences. Combination of bioinformatic tools enables the selection of high quality read data for hybrid genome assembly and downstream analysis. The streamlined approach for the hybrid de novo genome assembly described in this protocol may be adapted for the use in any culturable bacteria.

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

This protocol details a comprehensive approach for the culturing, sequencing, and de novo hybrid genome assembly of urinary bacteria. It provides a reproducible procedure for the generation of complete, circular genome sequences useful in studying both chromosomal and extrachromosomal genetic elements contributing to urinary colonization, pathogenesis, and antimicrobial resistance dissemination.

短読シーケンシング技術を用いた尿細菌の完全ゲノム生成のためのハイブリッド デノボ ゲノムアセンブリ

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

免疫・感染学

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

生物学

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

16S rRNA Sequencing: A PCR-based Technique to Identify Bacterial Species

Source: Ewa Bukowska-Faniband1, Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Planet Earth is a habitat for millions of bacterial species, each of which has specific characteristics. Identification of bacterial species is widely used in microbial ecology to determine biodiversity of environmental samples and medical microbiology to diagnose infected patients. Bacteria can be classified using conventional microbiology methods, such as microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. In recent decades, molecular microbiology methods have revolutionized bacterial identification. A popular method is 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing. This method is not only faster and more accurate than conventional methods, but also allows identification of strains that are difficult to grow in laboratory conditions. Furthermore, differentiation of strains at the molecular level enables discrimination between phenotypically identical bacteria (1-4).
16S rRNA joins with a complex of 19 proteins to form a 30S subunit of the bacterial ribosome (5). It is encoded by the 16S rRNA gene, which is present and highly conserved in all bacteria due to its essential function in ribosome assembly; however, it also contains variable regions which may serve as fingerprints for particular species. These features have made the 16S rRNA gene an ideal genetic fragment to be used in identification, comparison, and phylogenetic classification of bacteria (6).
16S rRNA gene sequencing is based on the polymerase chain reaction (PCR) (7-8) followed by DNA sequencing (9). PCR is a molecular biology method used to amplify specific fragments of DNA through a series of cycles that include:
i) Denaturation of a double stranded DNA template 
ii) Annealing of primers (short oligonucleotides) that are complementary to the template 
iii) Extension of primers by the DNA polymerase enzyme, which synthesizes a new DNA strand
A schematic overview of the method is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig1.jpg" /> 
Figure 1: Schematic overview of the PCR reaction. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/10510/10510fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
There are several factors that are important for a successful PCR reaction, one of which is quality of the DNA template. Isolation of chromosomal DNA from bacteria can be performed using standard protocols or commercial kits. Special care should be taken to obtain DNA that is free of contaminants that can inhibit the PCR reaction.
Conserved regions of the 16S rRNA gene permit the design of universal primer pairs (one forward and one reverse) that can bind to and amplify the target region in any bacterial species. The target region can vary in size. While some primer pairs can amplify most of the 16S rRNA gene, others amplify only parts of it. Examples of commonly used primers are shown in Table 1 and their binding sites are depicted in Figure 2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primer name</td>
			<td>Sequence (5&#39;&#8594;3&#39;)</td>
			<td>Forward/ reverse</td>
			<td>Reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8F b)</td>
			<td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td>
			<td>forward</td>
			<td>-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27F</td>
			<td>AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td>forward</td>
			<td>-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515F</td>
			<td>GTGCCAGCMGCCGCGGTAA</td>
			<td>forward</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>911R</td>
			<td>GCCCCCGTCAATTCMTTTGA</td>
			<td>reverse</td>
			<td>-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1391R</td>
			<td>GACGGGCGGTGTGTRCA</td>
			<td>reverse</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1492R</td>
			<td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td>
			<td>reverse</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Examples of standard oligonucleotides used in amplification of 16S rRNA genes a). 
a) The expected lengths of the PCR product generated using the different primer combinations can be estimated by calculating the distance between the binding sites for the forward and the reverse primer (see Figure 2), e.g. the size of the PCR product using primer pair 8F-1492R is ~1500 bp, and for primer pair 27F-911R ~900 bp. 
b) also known as fD1
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig2.jpg" /> 
Figure 2: Representative figure of the 16S rRNA sequence and the primer-binding sites. Conserved regions are colored in grey and variable regions are filled with diagonal lines. To allow for the highest resolution, primer 8F and 1492R (name based on location on rRNA sequence) are used to amplify the whole sequence, allowing for the sequencing of several variable regions of the gene. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/10510/10510fig2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Cycling conditions for PCR (i.e. the temperature and time required for the DNA to be denatured, annealed with primers, and synthesized) are dependent on the type of polymerase that is used and the properties of the primers. It is recommended to follow the manufacturer&#39;s guidelines for a particular polymerase.
After the PCR program is completed, the products are analyzed by agarose gel electrophoresis. A successful PCR yields a single band of expected size. The product must be purified prior to sequencing to remove residual primers, deoxyribonucleotides, polymerase, and buffer which were present in the PCR reaction. The purified DNA fragments are usually sent for sequencing to commercial sequencing services; however, some institutions perform DNA sequencing at their own core facilities.
The DNA sequence is automatically generated from a DNA chromatogram by a computer and must be carefully checked for quality, as manual editing is sometimes needed. Following this step, the gene sequence is compared with sequences deposited in the 16S rRNA database. The regions of similarity are identified, and the most similar sequences are delivered.

16S rRNA Sequencing: Identifying Bacterial Species by PCR

16S rRNAシーケンシング:細菌種を同定するPCRベースの技術

Source: Ewa Bukowska-Faniband1, Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, ...

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

要約

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リアルタイムPCRによる沿岸堆積物および定量16SのrRNA遺伝子と転写物からの同時DNA-RNA抽出

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

短読シーケンシング技術を用いた尿細菌の完全ゲノム生成のためのハイブリッドデノボゲノムアセンブリ

水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

16S rRNAシーケンシング:細菌種を同定するPCRベースの技術

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

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