この作品は、[CVB＆MEにMOP-1112666]カナダ衛生研究所からの資金によってサポートされていました。

倫理の声明：全ての実験および手順はブリティッシュ・コロンビア州、バンクーバー、カナダの大学の研究室バイオセーフティ指針と一致して行われました。 FRETベースの共焦点顕微鏡のための35ミリメートルのガラス底の培養皿の調製<ol><li>次の手順で36〜48時間前の実験とを使用してプレートを準備します。 </li><li> Cストレージ-20℃から選択されたゲル状のタンパク質混合物と0.25％トリプシン-EDTAを取得し、使用するまでモバイル氷浴に保管してください。 注：コーティングタンパク質混合物は、使用前に固化から混合物を防止するために、短時間室温にさらされるべきです。必要になるまでトリプシン溶液も冷やしておくべきです。代わりに、トリプシンは、ステップ1.5が完了した後、-20℃の貯蔵から取り出すことができます。 </li><li> DMEM（無血清添加、チルド）：タンパク質混合物の1時25希釈を準備します。各プレートが用意されているにタンパク質混合物/ DMEMの適切な量を転送。 35ミリメートルのガラス底板については、完全にプレートの底面に内側のガラスの円をカバーするために約200μlを添加します。 </li><li>安全キャビネット内、室温で少なくとも30分間座ってプレートを残します。この期間中の水浴中で37℃、10％NCSで暖かいDMEM。 </li><li>直前に次のステップに37℃に水浴中で暖かいトリプシン。 </li><li>ガラスピペットと吸引を用いて培養フラスコに現在あるDMEMを削除します。残りのDMEM残留物を除去するために暖かい滅菌PBSでフラスコの床を洗います。 </li><li>フラスコ底部から前培養平滑筋細胞を取り除きます。 注：フラスコは、細胞がプレートの準備の前に、所望の密集度（約80％）に達するようにするには、このステップに日に設立されました。細胞が元々 DMEM供給をリフレッシュし、細胞をインキュベーターに戻しした後、10％NCSを含むDMEM 20mlのフラスコ中に懸濁させ、24時間、5％CO 2電源で37℃でインキュベートしました。 DMEMは前夜に更新されました細胞がコンフルエントに達するまで、これらの初期の手順以下のRY 48時間。 <ol><li>ウォッシュは、トリプシンの1ミリリットルで素早くフラスコ、その後、吸引を用いて、1 mlのトリプシンを削除します。 </li><li>トリプシンの別の1ミリリットルに加え、酵素は、フラスコの底面全体に接触して確保するために、フラスコをswishing、より長い期間（約30-60秒）に向けて出発。 </li><li>フラスコからの分離に満足するまで、顕微鏡下で剥離しているどのくらいの細胞を観察します。代替は、トリプシン溶液をswishing、フラスコから分離された細胞の割合に満足するまで、細胞の剥離をチェックします。 注：フラスコを、37℃で、このプロセスをスピードアップするために約30〜60秒間インキュベーターに戻すことができます。 </li><li>細胞は、トリプシンを使用して取り除かれた後、（トリプシンをフラスコに総容量の1/8を形成するように十分な体積）トリプシン反応を停止し、フラスコに10％NCSを用いて新鮮なDMEMを加えます。 注：250mlの培養フラスコを使用した場合、例えば、これは、希望7 mlのDMEMを細胞溶液8mlにもたらすために、トリプシンの1mlに添加してもよいです。 </li></ol></li><li> （ラベル）クリーン50mlコニカルチューブにフラスコから細胞溶液を生じた譲渡。 </li><li>各プレートに1ミリリットルの新鮮なDMEM + 10％NCSを追加しますが（十分な媒体が24時間持続するために）準備されています。 </li><li>静かに形成された可能性のあるペレットを破壊するために細胞溶液を複数回含むチューブを反転。 </li><li>ピペットを各プレートに穏やかに混合した細胞溶液の体積を所望します。 注：このプロトコルのためにメッキ推奨SMCの数が35ミリメートル培養皿あたり0.5〜0.8×10 6です。これらの数は、細胞型に依存して変化してもよく、各研究所で試験され、修飾されるべきです。 </li><li>ガラス下部に細胞の平等な分配を確保するために、各プレート徹底的に時計回り/反時計回りの渦巻。 </li></ol> D1SRのCa 2+インジケーターを運ぶアデノウイルスベクター2.一過性トランスフェクション<ol><li>私の添加後各プレートにdiumとセルソリューション、細胞は皿の底にガラスに正しく取り付けることができるように、少なくとも1時間、5％CO 2電源で37℃でインキュベートし、プレートを残します。細胞が明確に添付されるまで、15分間隔で顕微鏡下でプレートを確認してください。 </li><li> -80℃ストレージからのアデノウイルスD1SRアリコートを取り出し、生物学的安全キャビネットに輸送するために、モバイル氷浴中に保ちます。 </li><li>ピペット所望の投与量を各プレートに冷却D1SRの（100の感染多重度）。 注：プレートごとに必要なアデノウイルス溶液の体積の計算は、プラーク形成単位（P​​FU）として提示され、元の原液、中のウイルス力価に依存します。我々の経験に基づいて、我々は培養プレートに1平滑筋細胞（SMC）を感染させるために必要な番号やウイルス粒子として解釈される100の（MOI）を、感染の多重度をお勧めします。 </li><li> 5％CO 2供給O / Nで37℃で感染させた細胞をインキュベートします。 </li><li>翌日、新鮮なDMEM + 10％NCSの1ミリリットルで細胞を補充します。 </li><li> 5％CO 2、O ​​/ Nで37℃の加湿インキュベーター中で培養します。 </li></ol> FRETベースの共焦点イメージングを使用して3.測定SR腔のCa 2+ <ol><li> O / Nインキュベーション後、プレートから培地を除去します。 </li><li>含む1ミリリットル温かい生理HEPES-PSS緩衝液で培養プレートを洗浄（mmol·Lに- 1）のNaCl 140、グルコース10、塩化カリウム5、HEPES 5、CaCl 2を1.5およびMgCl 2 1（pH7.4）で3回。 </li><li>直前の記録の開始に1ミリリットル新鮮な温かいHEPES-PSSのバッファを追加します。 </li><li>共焦点顕微鏡の関連ソフトウェアにFRET SE（増感エミッション）アプリケーション（または同様の機能）を使用して初期撮影を行います。 <ol><li>アプリケーションが開いたら、目的の実験条件を達成するために、設定を調整する「設定」タブにクリックします。 </li> &lt;李&gt;は手動（アクセプターチャネルのために）細胞は（ドナーのためにとチャンネルをFRET）440 nmで順番に興奮しているように、チャネルの設定を変更し、513 nmの。 （ドナー用）488 nmおよび535 nmの（FRETとアクセプターのため）で発光波長を収集します。 </li><li>露光の間で10秒間隔（3つの連続CFPドナー、FRET、およびYFPアクセプターチャネルのための時間を記録する）、細胞の150ミリ秒の励起の露光時間で、15％の透過率で光の強度を設定します。 </li></ol></li><li>顕微鏡ステージ上のプレートを安定させます。 </li><li>画像の解像度を確認するには、「ライブ」ボタンを使用します。所望の解像度に達するまで、さらに設定を微調整します。 </li><li>それでも「設定」タブの下に、「キャプチャ画像」ボタンを使用してサンプルの画像を取ります。 </li><li> 「評価」タブに移動する、行われている実験のためのFRET効率を計算するために適切な方法を選択します。レシオメトリック計算[E A（I）= B / Aを使用して方法3、]、このようなD1SR指標としてカメレオンを含む実験のために推奨されます。 </li><li>実験中にグラフ形式で記録された強度値を観察することができるように、「グラフ」タブに切り替え。 </li><li>実験が進むにつれて、グラフ上の関心のこの領域の対応する平均強度を観察するために、画像ビューアでROIを描きます。 注：研究者はまた、複数のROIを描き、対応する強度を記録し、グラフ上に同時に表示するように選択することがあります。また、研究者らは、最初の記録のための単一のROIを概説し、ソフトウェアのデータ分析指向のバージョンに実験ファイルを開くことによって、後で複数のROIの輪郭を描くに進むことができます。 注：FRETベースの実験をセットアップするために必要な手順に関するさらなる詳細は、FRETアプリケーションウィザードのマニュアルに記載されています。顕微鏡はFRETウィザードが装備されていない場合は、以下のプロトコルは、のパラメータを設定するために使用することができます手動で記録。 </li><li>記録を開始し、目的の薬剤を導入する前に、信号の安定した基礎記録を確実にするために、少なくとも3分のデータ収集を可能にします。 </li><li>手動で関心ビーイングの領域と近くにスポットでプレートに直接所定の線量をピペッティングすることにより、SRのCa 2+を枯渇させるためのツールとして、（100 nmのエンドセリン-1 例えば、2μMタプシガルギン）のCa 2+ -movingエージェントを導入可能性として記録。所望の時間の後処理のために記録を続けます。 </li><li>レシオメトリックをキャプチャFRET SEアプリケーションを用いた共焦点倒立顕微鏡の63X油浸対物レンズとのシリアル画像（512×512ピクセル）をFRET。 </li><li>関心の各領域における5-10のSMC（ROI）のクラスタからの撮像結果のデータを収集し、その後にフォーマットし、統計ベースのソフトウェアを使用して分析します。 <ol><li>後で使用するためにデータを保存するには、記録されたトレース上で右クリックして、SAVする「エクスポート」オプションを選択します電子記録とのスプレッドシートは、研究者の選択したドライブ上の信号強度を意味します。 </li><li>時点0秒​​で観察された開始強度値によって各データポイントを分割して、各個々の実験からのデータを正規化します。 </li><li>手動で元のスプレッドシート/秒から関連するデータ行をコピーして貼り付けることにより、統計プログラムのプロジェクトファイルへのスプレッドシートからのインポート正規化されたデータ。 </li><li>自動的にプログラムに貼り付けられたデータセットに対応するグラフを生成。 注：プログラムのデフォルト設定は、インポートしたデータから線グラフを生成します。表示されるグラフの種類は、メインツールバー内で見つかった見出し「変更」の「グラフの異なる種類を選択」ボタンをクリックして変更することができます。 </li><li>単一のデータ・シートに同一の実験の大きなグループ内の複数の独立した試験を表すプールのデータは、実行される特定のテストの平均トレースを生成します。 </li></ol></li></oL&gt; 細胞質のCa 2+インジケーターの4準備<ol><li>黒のマイクロ遠心チューブ内のジメチルスルホキシド（DMSO）1ml中0.0125 gでプルロニック酸（PA）を溶解（PAの溶解を助けるために、モバイル水浴中でチューブを暖めるために有していてもよいです）。 </li><li> -20℃の保存から細胞質のCa 2+指示薬色素（あるFluo-4 AM）のチューブ（50μgの）を取得します。 </li><li>光との接触からできるだけそれを保護するために、箔中の染料のチューブを包みます。 </li><li>色素を含有するチューブにDMSO + PAソリューションのピペット45μlの。 RTで箔とストア内のDMSO + PAソリューションを包みます。 </li><li>徹底的に解決策の上下に複数回ピペッティングすることにより、チューブの内容物を混合。あるいは、10分間染料管超音波処理。 注：完全にDMSO + PAソリューション全体に染料を分配する方法のいずれかが十分であろう。単に研究者の好みの問題です。治験責任医師は、溶液を超音波処理することを選択した場合、それ他はノイズによって影響されない孤立した地域/部屋で行う必要があります。研究者はまた、耳を保護するために重いマフラーを使用する必要があります。 <ol><li>ソリューションを超音波処理した場合、超音波洗浄器（ の dH 2 Oで）フル2/3の内側に発泡チューブホルダーと場所の内部に染料を含有するアルミホイルにくるまれたチューブを挿入します。 </li><li>上の孤立した地域/部屋とパワー機に入れ超音波処理浴が（保護帽子を確保する前に、超音波処理プロセスを開始する場所にあります）。 （できるだけ長く光から保護するためにホイルで包んでおく）部屋を出ると、それを遮断し、チューブを取得する前に10分間実行しているマシンのままにしておきます。 </li></ol></li><li>暗いマイクロ遠心チューブに今完全に混合した溶液アリコート（チューブあたり5μLを、10チューブ総作ることができるはずです）。 </li><li>ホイルで各アリコートチューブを包みます。使用するまで-20℃の条件で乾燥剤でラベルのチューブとストア。 </li></ol> 5.細胞質のCa 2+測定<ol><li>ラット大動脈のSMCの培養プレートを準備するために1.1から1.12の手順に従ってください。 </li><li> 48時間後の培養液でプレートから培地を除去します。 </li><li> -20℃の保存から細胞質のCa 2+インジケーター（5マイクロリットル）の先に調製したアリコートを削除し、使用するまでモバイル氷浴中で維持します。 </li><li>含む1ミリリットル温かい生理HEPES-PSS緩衝液で培養プレートを洗浄（mmol·Lに- 1）のNaCl 140、グルコース10、塩化カリウム5、HEPES 5、CaCl 2を1.5およびMgCl 2 1（pH7.4）で3回。 </li><li>暖かいHEPES-PSSの1ミリリットルでインジケータを混合し、培養プレート上にロードします。 </li><li> RT（24℃）で1時間の指標でのSMCをインキュベートします。 </li><li>培養プレートからインジケータを削除し、1ミリリットル温かい生理HEPES-PSSバッファ3回洗​​浄します。 </li><li>直前の記録の開始に1ミリリットル新鮮な温かいHEPES-PSSのバッファを追加します。 </li><li> 63X Oとシリアルの画像（512×512ピクセル）を取得共焦点倒立顕微鏡のIL-浸対物レンズ。 <ol><li>手動で細胞が488nmで励起されるように設定を変更し、発光波長は700ヘルツの走査速度で555 nmで収集されます。 </li><li>細胞の150ミリ秒の励起露光時間（細胞を記録中、指定された時間間隔で光に暴露される時間量）と露光の間に5秒間隔で、15％の透過率で光の強度を設定します。 </li></ol></li><li>顕微鏡ステージ上のプレートを安定させ、記録を開始します。 </li><li>前関心の薬剤を導入する信号の安定した基礎記録を確保するために、少なくとも3分間録音。 </li><li> SRのCa 2+を枯渇させるためのツールとしてのCa 2+ -moving剤（ 例えば 、2μMタプシガルジン）を導入する（ステップ3.16で説明したように）と時間後処理所望の量の記録を継続します。 </li><li>蛍光SIを平均化することにより、顕微鏡固有のソフトウェアを使用して記録信号強度興味（ROI）の各領域における5-10のSMCのクラスタからgnals（F / F 0）。収集フォーマット、およびデータ分析ソフトウェアを用いて画像化から生じるデータを分析します。このソフトウェアを使用して、データ収集の説明と分析のための手順を3.18.1-3.18.5参照してください。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

このプロトコルは、SRのルーメン内のCa 2+濃度を研究するためにD1SRアデノウイルスとのVSMCのトランスフェクションを説明します。この方法は、異なるカルシウム移動剤を適用した結果に/ SRのうち、直接この細胞小器官内のCa 2+の測定だけでなく、その動きを可能にします。この方法は、SRおよび細胞質のCa 2+レベルの変化は、全体的な携帯の健康に影響を与えるとどの...

Ca 2+が 、体内のすべての単一のセル内に豊富に見られる非常に重要なイオンで ​​す。それは、成長、増殖、遊走、およびアポトーシス1-4を含む多くの異なる細胞機能、で重要な役割を持っています。よくのCa 2+は両方の直接的および間接的な作用を介してこれらのプロセスに影響を与えることができることが確立されているため、このイオンの正常な細胞内濃度の変更が容易に影響を受けた細胞についてのネガティブな結果をもたらすことができます。 SRは、セル5内の最大の細胞内Ca 2+ストアとして考えられています。 SRと細胞質の両方におけるCa 2+の定常状態レベルは正常にし、この細胞小器官のの Ca 2+ -transportingチャンネルのうち、一定の磁束によって維持されています。損傷または疾患のいずれかの形式に起因する細胞に課さストレスの多い条件は、一般的に、彼に長期的な効果を持っているために行くSRのCa 2+の有意な変化と関連していますセルのALTH。例最も深刻で、ストレスを受けた細胞のできないことは、定常状態のSR Caを回復し、維持するため2+レベルはあっても、アポトーシス6-8により死に終わることがあります。 携帯のCa 2+動態への現在の研究は、その数少ない研究試験細胞小器官の Ca 2+ストアのコンテンツを直接9-11事実によって制限されます。最も一般的な方法ではなく、SR の Ca 2+含有量12-14の変化の間接的な測定として、細胞質のCa 2+レベルの測定を含みます。これらの実験において、 の Ca 2+は、一般的に細胞小器官の枯渇を引き起こす薬剤（ 例えば、タプシガルジン）の使用を介してSRから放出されるように誘導されます。結論は、その後、細胞質のCa 2+濃度の変動に基づいて、SRのCa 2+への変更に関連して描かれています。ラウンドアバウトのミリアンペアで、このような結論を導き出すために研究者のための残りの能力にもかかわらず、nner、のCa 2+測定SRのこの方法は明らかに収集されたデータの解釈に関する多くの制限で、そのような情報を収集するための間接的な方法です。この明確な制限を回避するためには、SR管腔ネットワーク内で直接見出さの Ca 2+の量を測定する必要があります。 直接管腔内SRのCa 2+レベルを記録することができるというの最終的な結果にバイタルは、細胞培養ツールと使用のCa 2+指標です。現在の原稿に参照されるデータについては、使用されたVSMCは、凍結した細胞株からのものであることに注意することが重要です。細胞を、5％CO 2電源で一定37℃でインキュベート概説した実験用通路22-26上ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％新生仔ウシ血清（NCS）で培養しました。現在の方法を使用して、例えば、細胞が非常にうまく外をシミュレートするタンパク質混合物に成長しました組織15の多くの異なる種類の環境。 SRのCa 2+研究の静脈に沿って成功のための重要なのは、使用されるタンパク質の混合物の一種です。この場合には、低成長因子品種は、通常のCa 2+シグナル伝達と絶えず試験された細胞内で起こる動きに影響を与えることから、このツールの構成要素を回避するために必要でした。試験細胞の正常な成長に続いて、のCa 2+インジケータも効果的に、これらの培養細胞に導入されなければなりません。これは、SR-在住のCa 2+インジケーターD1SRを運ぶアデノウイルスベクターを使用することによって可能となりました。高いトランスフェクション効率を達成するために、細胞は、イメージングの前に、少なくとも36〜48時間のためのウイルスベクターを用いてインキュベートされなければなりません。この調製は、高い精度と再現性でSRルーメン内のCa 2+トランジェントを測定するための信頼性の高いツールを提供します。 このプロトコルで使用されるD1SRインジケータはD1ERのCa 2+、iの修正変異体でありますもともとカリフォルニア大学の博士ロジャー・Y・チエンの研究室、サンディエゴ、USA 9,16によって作成されたndicator。元D1ERは、前のCa 2+指標9,16に比べてはるかに広い範囲（0.5から160μM）を介してのCa 2+感受性を表示カメレオンと呼ばれる遺伝的にコード化された Ca 2+指標の第二世代に属しています。新しい変種D1SR、博士ウェイン・チェン（アルバータ大学、カナダ）からの親切な贈り物は、しかし、（代わりに元D1ERのように、カルレティキュリンシーケンスの）変異カルセケストリンシーケンスを運びます。変異カルセケストリンは11ルーメンSR内のCa 2+に結合する内因性カルセケストリンと競合の問題を解消するのCa 2+への結合を減少しています。 D1SRインジケータが変更されたカルモジュリン（CAM）とM13（トンを含むリンカータンパク質によるその結合切り捨て強化シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）を運びます彼のCaM）配列に結合ミオシン軽鎖キナーゼの26残基ペプチド。カムM13配列は、内在性カルモジュリンに結合するM13のを防止するように改変されています。また、SR保持を確実にするために、カルセケストリン配列はCFP 11の5 &#39;末端に追加されています。 Ca 2+と結合すると、カムM13ドメインは、FRETシグナル強度の増大として記録され、隣接CFPとYFPとの間のエネルギー伝達の増加をもたらす立体構造変化を経ます。ドロップ2+ SR腔のCa濃度は、カムM13ドメインが隣接CFPとYFPの間のエネルギー移動、及びFRETシグナル強度の有意な低下が低下、逆コンフォメーション変化を通過する一方、 。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (high glucose, pyruvate)</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C until right before use</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Keep at -20 &amp;deg;C until right before use</td></tr><tr><td>35 mm glass-bottomed plates</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 0.2 &amp;mu;M vented blue plug seal cap flask</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution</td><td>Life technologies</td><td>25200056</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C until right before use</td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene Conical Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gift</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life technologies</td><td>F-23917</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C until right before use</td></tr><tr><td>1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of calcium fluctuations within the sarcoplasmic reticulum of cultured smooth muscle cells using fret-based confocal imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

このセクションでは、間接的に、細胞質のCaの変動を観察することによっての Ca 2+ストア濃度オルガネラへの変更を測定する一般的に用いられる方法と比較して、SR腔Ca 2+濃度データを捕捉するために記載された方法を用いて得られる結果の例を提供する2+ 。 図1Aは、（514 nm励?...

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Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

measurement-calcium-fluctuations-within-sarcoplasmic-reticulum

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.6K ビュー.  University of British Columbia. Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

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Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

AMフラ-2を用いて皮質ニューロンのカルシウムイメージング

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

生物学

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

発生生物学

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼSERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング<sup&gt; 2+</sup&gt;センサーキャッチャー<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

<meta charset="utf8"></head><body>チャネル活性化研究のためのシングルセルカルシウムイメージング

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and chemicals et al. It primarily relies on microscopy imaging technology and the related Ca2+ indicator Fura-2/AM (AM is the abbreviation for Acetoxymethyl ester). Inside the cells, Fura-2/AM is hydrolyzed by esterases into Fura-2, which can reversibly bind with free cytoplasmic Ca2+. The maximum excitation wavelength shifts from 380nm to 340nm (when saturated with Ca2+) upon binding. The emitted fluorescence intensity is quantitatively related to the concentration of bound Ca2+. By measuring the 340/380 ratio, the Ca2+ concentration in the cytoplasm can be determined, eliminating errors caused by variations in the loading efficiency of the fluorescent probe among different samples. This technology allows for real-time, quantitative, and simultaneous monitoring of Ca2+ changes in multiple cells. The results are stored in &#8220;.XLSX&#8221; format for subsequent analysis, which is fast and generates intuitive change curves, greatly improving the detection efficiency. From different experimental perspectives, this article lists the use of this technology to detect Ca2+ signals in cells with endogenous or overexpressed channel proteins. Meantime, different methods for activating cells were also showed and compared. The aim is to provide readers with a clearer understanding of the usage and applications of single cell Ca2+ imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

This article presents a method for real-time, quantitative monitoring of calcium ion (Ca2+) concentrations in cells using single-cell Ca2+ imaging with the Fura-2/AM dye. This technique enables efficient dye loading and accurate calculation of Ca2+ levels through fluorescence intensity ratios, making it a simple and rapid approach for research applications.

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

要約

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AMフラ-2を用いて皮質ニューロンのカルシウムイメージング

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

焦点のCa^{2 +過渡検出}

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

イメージングローカルCA

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

要約

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AMフラ-2を用いて皮質ニューロンのカルシウムイメージング

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

焦点のCa 2 +過渡検出

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

イメージングローカルCA

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

焦点のCa^{2 +過渡検出}