Name: large-scale scanning transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain
Uploaded: 2016-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
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仕事の大半はNWO 175-010-2009-023とZonMW 91111006が主催してUMCG顕微鏡およびイメージングセンター（UMIC）で実施されています。 BNGGへSTW「顕微鏡バレー12718」。この作品はTJvHにZonMW VENIの助成金、（瀕死ニューロンを保存）マリー・キュリーのキャリアの統合助成金およびアルツハイマーオランダの交わりが主催しました。

ゼブラフィッシュの幼虫を持つすべての実験は、国内およびEUのガイドラインに従ってフローニンゲン大学の動物実験委員会によって承認されました。 1.試料の調製<ol><li> 固定と埋め込 ​​み <ol><li> 固定 <ol><li>トリカイン（0.003％）で稚魚をAnaesthetizeを静かに突っついによってE3（5のNaCl、0.17のKCl、0.33mMのCaCl 2を、0.33 mMのMgSO 4を、10mMのHEPES、pHは7.6）、麻酔の深さのためのゼブラフィッシュの水とテストに追加しました解剖顕微鏡下で200μlのピペットチップを用いて動きはもはや（ 図1A）が検出されなくなるまで。 </li><li>説明したようにアガロース1.8％で共焦点または2光子イメージングを使用してインビボ撮像データに取得した後に相関EMのためにサンプルを処理する場合、アガロースで5,15修正幼虫は、トリトンX-100（0.05％）を含有するPBS中4％PFAを用いました。 </li><li>アガロースおよびプロセスのための幼虫をカット大規模なEM 5。 </li><li>プラスチックチューブで、室温で2時間、トリトンX-100を含むPBS中で新鮮な4％パラホルムアルデヒド（0.05％）で幼虫を修正しました。 注：次のステップ（1.1.1.5）で説明したように（ インビトロで ）培養物中で増殖させた細胞は、直接、グルタルアルデヒドで固定することができます。 </li><li>溶液を除去し、100μlの0.5％PFA、2％グルタルアルデヒド（GA）、および0.1 Mカコジル酸ナトリウム（pH7.4）に追加します。 4℃で一晩保管してください。 0.1 Mカコジル酸ナトリウム中で二回サンプルを洗浄します。 </li><li>オスミウムの浸透を容易にするために、後脳に吻方幼虫の頭をカットします。細かいシリンジ/鉗子を使用してください。 </li><li> 2時間氷上で0.1Mのカコジル酸ナトリウム中の1％四酸化オスミウム（OsO 4）/1.5%フェロシアン化カリウムの、Postfixの幼虫（K 4 [Fe（CN）6]を）および二重蒸留H 2 Oで3×5分間のすすぎ</li><li>エタノール濃度の増加で20分間のインキュベーション（50％、70％、3回、100％）をエタノール中で脱水します。 </li></ol></li><li>埋め込 ​​み <ol><li> EMラボで使用される標準的なレシピに応じて、エポキシ樹脂を準備します。 注：次のように私たちは、エポキシ樹脂を使用する：19.8グラムのglycidエーテル100、磁気撹拌機を用いて、9.6グラムの2-ドデセニルコハク酸無水物及び11.4グラム化メチル無水物を混ぜます。 0.5グラムDMP-30（トリス - （ジメチルアミノメチル）フェノール）を追加し、再び混ぜます。 </li><li> （RT）を回転させながら（v / v）エタノール中の50％のエポキシ樹脂中に幼虫一晩インキュベートします。 </li><li>純粋な樹脂で希釈したエポキシ樹脂を交換してください。 、30分間インキュベートし、再度新たな樹脂を添加し、さらに30分間インキュベートします。再び樹脂をリフレッシュした後、58℃で15分間、低圧（200ミリバール）下、室温でさらに1時間、続いて室温で3時間を、インキュベートします。 </li><li>オリエント針を使用して、解剖顕微鏡の下で市販されているシリコンフラット埋め込み金型で頭や金型の側を向い前方にまたは必要に応じて爪楊枝します （ 図1B）。 </li><li>エポキシ解像度を重合58℃で一晩インチエポキシ樹脂である場合は、まだ柔らかすぎ別の日が重合し、58℃で硬化することができます。ピンセットを使用して圧力を印加することにより、試験剛性。これは簡単にインデントを残す場合は別の日には重合し、58℃で硬化することができます。試料が完全に硬化されると、トリミングし、切片に進みます。 </li><li> （ 図1B）かみそりの刃を使用して、スタブから余分な樹脂を切り落とします。 </li></ol></li></ol></li><li> 、セクショニング対照的な、および取り付け <ol><li> セクショニング <ol><li>ウルトラミクロトームを用いて、セクションエポキシ樹脂ブロック。 </li><li>ガラスナイフやトルイジンブルー/塩基性フクシンのための半薄切片（500 nm）をカットするダイヤモンドhistoknifeを使用します（ 図1D）右の位置を検出するために染色します。 </li><li>その先端火炎中で溶融して閉じられたガラスパスツールピペットでそれらをピックアップして、顕微鏡スライド上の半薄切片を転送します。ホットプレートuの上にドライntilに水が残っていません。ホットプレート上で、そして水ですすいだ後、水に1％トルイジンブルー、1％の四ホウ酸ナトリウムで0.05％塩基性フクシンで10秒間染色で10秒間染色。 40Xに10Xで通常の光学顕微鏡で調べます。 </li><li>脳内の適切な部位/配向に到達すると、超薄切片を切断するためにダイヤモンドナイフを用いてエポキシ樹脂ブロックを区画続ける（〜70nmで、 図1E） </li><li>超薄切片中に関心領域を識別するために、サンプルを傾けると切片の角度を調整するために、嗅覚ピット、目、グレー白質の境界を含め、中および脳の周りに容易に識別できる解剖学的構造を使用してください。 </li><li>シングルスロットL2×1銅グリッド（ 図1F）、上のマウント部は、格子バーによって中断されることなく、取得を可能にします。セクションをサポートするためにホルムバールコーティングされたグリッドを使用してください。 </li></ol></li><li> 対照的な <ol><li>グリッド上のステイン超薄切片別の2分16レイノルズクエン酸鉛、続いてメタノール中の2％酢酸ウラニルで2分間秒。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.画像​​取得<ol><li> 大規模STEM 注：私たちは、STEM検出を用いた高解像度3,5,7,17 ​​で、ビューの複数の大規模なフィールドを取得することができる外部スキャン発生器をスキャンEMを使用しています。典型的に、一つの画像は、この方法はかなりのステッチの量を減少させる、〜100透過型電子顕微鏡（TEM）画像の視野に相当する生成されました。 <ol><li> 顕微鏡でサンプルをマウントします <ol><li>複数のグリッドサンプルホルダ内のセクションにグリッドを配置し、SEMのチャンバーに移します。 </li></ol></li><li> STEM検出器のアライメント <ol><li>ビームの下でサンプルとグリッドを入れて、それは約になりますので、それを上に移動。レンズポールから5ミリメートル。使用して20 kVので画像を取得レンズ内検出器。 </li><li>グリッドのエッジに集中し、4.0ミリメートルに作動距離を調整します。 </li><li>安全な位置に試料ホルダーを移動し、STEM検出器をもたらします。 </li><li>インレンズ検出器を用いて、最大速度で撮像しながら調整ネジを回すことで、画像フィールドにSTEM検出器の穴を中央に配置します。 </li><li>慎重にちょうどレンズの極と検出器との間に収まるように試料ホルダーを戻します。 </li><li>断面積になるようにしてくださいするには、レンズ検出器を用いて画像を取得します。 </li><li>スイッチは検出（利得媒質と「マイナス」に設定されているすべての象限）をSTEMと画像を取得し、スキャンする領域を選択します。 </li><li> 21 kVのに加速電圧を上げて（再び安定した画像）ビームの安定化を待ってから、2 kVのステップで29 kVのに行きます。 </li></ol></li><li> 画像を取得します <ol><li>サンプルを予め照射ズーミングによって、（電子ビームによる輝度の変化を防止するため）スキャンする完全な領域ので、外画像ウィンドウにフィットします。 </li><li> （検出器利得が1ステップを小さくする必要があり、適切なダイナミックレンジを維持するために）120μmの開口部を変更します。 </li><li>デフォーカス画像がぼやけるようにします。 </li><li>小面積のスキャンオプションを使用して、可能な限りタイトな走査領域を作成します。 </li><li>フレームは、約に走査されるように設定されたスキャン速度。 1から2秒。 注意：サイズや組織に応じこれは、一般的に取る½時間（100×100μmのFOV）を最大3時間（千×500ミクロン）に。 </li><li>少なくとも100Xでのズームと10秒間小さな領域をスキャンします。 注：この領域は、その周囲の、照射前に比べて明るさを変更しない場合には、十分なものです。 </li><li> 30μmの開口部を連れ戻す（とメディア益をSTEM） </li><li>サンプルを集中します。 </li><li>ワブラー（〜40,000Xの倍率で）を使用して、開口部の位置を合わせます。 </li><li>焦点で最も明るいエリア/機能を選択しながら、スキャン速度を設定するような詳細こと表示されています。 </li><li>顕微鏡ソフトウェアで慎重にダイナミックレンジ内のすべてのピクセルを維持するためにヒストグラムを見ながら明るさとコントラストを調整します。最も暗いエリア/機能についても同じ操作を行います。 </li><li>明るい領域に戻り、もう一度確認してください。ヒストグラムの両側にいくつかのスペースがあるので、安全側にあります。 </li><li>スキャンする完全な領域が撮像窓に合うようにズームアウト、および大面積取得プログラムを起動します。 </li><li>画面からエリアを選択して、モザイクを設定するためのウィザードオプションを使用します。詳細は必要であるかに応じて、5 nmの - ピクセルサイズ2を使用してください。 STEMのための滞留時間を3マイクロ秒を使用してください。 </li><li>オプションを選択 &quot;前のタイル上のオートフォーカス」、「実行前に設定を確認します」とどこにデータを保存するために定義する]チェックボックスをオンにし、デフォルトの会社の設定で大規模な収集ソフトウェアのオートフォーカスを使用しています。 </li><li>押して、顕微鏡の設定を確認するために「最適化」。 注：今必要な時間は、SHになります自分の。これは、1×0.5ミリメートルの領域の場合は最大72時間であるかもしれません。 </li><li>ウィンドウ「最大タイル解像度」タイプ20,000ので、個々のタイルは鈍いエッジ効果を防止することで、x 20K 20Kよりも大きくなりません。押して「実行」。 </li><li>フォーカス、明るさ/コントラスト（B / C）をチェックするように求められたときは、外部スキャン発電機のスイッチをオフにし、慎重に顕微鏡ソフトウェアにフォーカスし、非点収差を調整します。 B / Cを変更しないでください。 注：ステージを移動することができ、倍率が変更されたが、倍率はバック所望の画素サイズに設定する必要があります。 </li><li>再び外部スキャン発生器のスイッチを押し、「継続」。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3.データ解析<ol style="margin-left: 40px;"><li>大規模EMファイルビューアプログラムを開き、ファイル &quot;モザイク情報」を開きます。これは、すべてのタイル張りのTIF-ファイルを開きます。これは、好ましくは、新たな取得を妨げないように、別のワークステーション上で実行されます。 </li><li>オプション &#39;AUを選択してください（パラメータは、ズーム、場合ステッチ基準は満たすことができない。閾値0.90、自動ノイズリダクションをステッチ、半分にモードをオーバーラップし、手動位置にタイルを配置し、「そのまま続ける」をクリックしてください）​​全体モザイクをステッチします。 </li><li> htmlファイルとして書き出すか、あるいは単一TIFなど。 TIFのための縮小が必要となる可能性があるエクスポートすることに注意してください。後で測定を可能にする、ファイル名の最後のピクセルサイズを含めます。 </li><li>画像編集プログラムでそれを開くことにより、TIFファイルに注釈を実行します。並行して、最適な分解能観察用のWebブラウザでズーム可能なhtmlファイルを開きます。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

EMは、生物学的状況における巨大分子の高分解能イメージングと細胞の状況の分析を可能にします。しかし、これは、典型的には、視野を制限します。大規模3D EMは、複雑なデータ処理10を必要とする 、ナノスケールの分解能を3次元再構成を作成することによって、神経接続をマッピングするのに特に適しています。対照的に、2D大規模EMは、画像データの単一の部分とステッチを必要とし、データの評価は、インターネットブラウザへのアクセスを誰でも可能です。我々と他の人は、以前の組織および動物全体を分析するために大規模なEMを使用します。ほとんどのアプローチとしては、TEMおよびSEMベースのステッチは、独自の利点を持っています。ここで、走査透過EM（STEM）は、高解像度で大きな視野の生成を可能にしました。典型的には、1つのSTEM像は、大規模な金融商品取引法を撮像する際に著しくステッチの量を減少させる、約100 TEM画像の視野に相当します高解像度でのビューのDS。より高い解像度が必要な場合は、TEMは、有利であり得ます。 STEMは、非対照試料は、良好な超コントラスト6を使用することができることを、TEMを上回る利点を有します。 さらに、ここに記載された方法は、単にセクションの後方散乱電子検出器（BSD）で使用するために調整することができる複数の顕微鏡システムに使用を広げ、シリカウェーハ上に取り付けられています。 HTML-ズーム可能な組織EMファイルには、患者のデータを分析するために、科学的研究にLMとEMデータ（CLEM）8、プレゼンテーションの目的を組み合わせ、その完全なコンテンツに分析されていない可能性があり、データを共有し、教育のために、定量化のために非常に有用です。 BSDを使用することができる、より一般的に検出ステムよりも走査型電子顕微鏡で使用可能である。代替的に、SEMの大規模EMではなく、TEMで、シリカウェーハは、2つの主な利点を有し、使用することができます。第二に、大規模なセクション（&gt; 1mmの2分野の取り付け関心は）簡単です。シングルスロットグリッド上にマウントすると、労働集約的で技術的に困難です。 TEM、SEMおよびSTEMの間の詳細な比較は、他の場所で6詳述されています。 BSDイメージングの欠点はSTEMに比べて、画像にノイズが増加している、ということです。これは、部分的にはるかに長い取得時間をもたらす、ピクセル滞留時間を増加させることによって補償することができます。 サンプル調製比較的標準EM処理（固定、包埋および切片）のための5-7を必要とされるが、アーティファクトを完全に欠い大超薄切片をカットすることは技術的に困難です。セクションは、非常に脆弱であり、容易に破損、折ったり、典型的には、データセットごとに複数の時間を要するイメージング、中に破壊されています。しかし、生の公平なデータのオンライン共有のために、それが公表されたデータに、より容易に比較することが可能になるはずであり、コントロールとしてオープンドメインで公開されたデータセットを使用します。現在、ラすることのできる、いくつかのEMデバイスRGE規模解析に使用されている、最もイメージングセンターは共同の努力を歓迎するものの、したがって、この技術へのアクセスは、やや限られています。 大規模なセクションのために組織を適切にサンプル全体に固定されなければなりません。それは高速だが、中程度の固定剤PFAの混合物は遅いが強力な固定液GAとの組み合わせで使用されている理由です。アーティファクトなしで大規模なセクションを切断し、ピックアップすることは困難です。 BSDとの組み合わせでウェハを操作する単一の穴グリッド上のセクションを集めるに比べて容易です。ヘビーメタルポスト染色は、古典的なEMに比べてより重要です。セクション全体が撮像されているので、すべてのアーティファクトが表示されます。 TEMのユーザーは、典型的には、それが困難なため、顕微鏡操作の違いにより、SEMへの切り替えを見つけます。 定量化とデータ共有 -細胞内の機能を定量化は、単一のEM画像では困難です。大規模のでズームイン、ズームアウトする可能性画像は容易に細胞内でナノスケールの測定を続けることができ、目的の細胞の同定を可能にします。これらのデータセットは、特定の細胞型が急速に異なるスケールで検出可能な特徴に基づいて、これらの大規模な組織切片における公平な方法で識別し、定量化することができることを示しています。例えば、ミクログリアは、その形態と密な細胞質に基づいて同定することができます。我々は以前に大規模なEM組織培養セット2内のERの幅のために示したように続いて、個々の細胞上でのズーミングに際して、これらの細胞のナノスケールの細胞内および分子的特徴は、同じデータセット内で測定することができます。 nanotomyのさらなる利点は、オンライン、大規模なデータセットのホスティングをするかもしれない他の機能のために、他の人がデータを検査することを可能にし、新たな仮説に彼らの結論を引き出すことです。 CLEMは -定量的なEMを容易にすることに加えて、大規模なEMは、それが簡単に光microscoを相関させることができますEMレベル8にPIC標識。本実施例ではゼブラフィッシュ切除モデルにおける貪食ミクログリアの存在が示されています。神経科学の主要な質問は、個々の機能と貢献は、ミクログリアおよび貪食細胞および免疫細胞の潜在的な他の源であるものです。初期のEM研究は、病気18ミクログリアの特徴的な細胞内の特徴を示しています。残念ながら、それは、遺伝子発現、形態および機能における他の免疫細胞との大きな重なりを示すように、病理学的設定において特にミクログリアを選択的に標識することが困難です。したがって、それは不明であるかどうか、および超微細構造レベルでのミクログリアは、マクロファージ浸潤単球由来を含む他のソースからの免疫細胞と異なるとき。これらの細胞間の超微細構造の違いがあるかどうかを理解することは、機能の違いを分析するための出発点を提供します。選択的遺伝子導入または発現マーカーを組み合わせるとC​​L​​EMはDETを許可します特定の集団に対して選択的超微細構造の特徴のection。 診断＆プレゼンテーションと教育 - 1つのデータセットEMデータ内にマイクロナノスケールを可視化することで大幅に広い聴衆に促進されます。相関と大規模なEMのための増加の可能性とツールにより、私たちは基本と医学研究におけるEMの復活を期待しています。ここで示される手法は、ゼブラフィッシュ脳損傷モデル5に適用されるが、糖尿病4のための細胞培養2のラットモデルにおいて、ヒト組織7、ラット脳3で使用されており、また、TEMと組み合わせて使用することができますこの方法の汎用性を示すベースのアプローチ1。顕微鏡のオペレータは、もはや高度に選択されていない、ので、バイアスされた画像が、すべての多数の超微細構造の特徴を記録し、世界的な分析のために開いている記録されています。

最近の技術開発は、超微細構造解析の復活につながる、EMの汎用性、適用性および定量的性質を改善しています。進歩はEMレベル8-10に直接顕微鏡分析の他のモードを比較するために3D EM、大規模な2D EMと相関光学顕微鏡および電子顕微鏡のための改良された方法および試薬（CLEM）が挙げられます。大規模な2D EMは、定量化またはヒト病理のための（新規の）疾患の特徴を識別し、疾患および組織培養モデルの動物モデルを研究するために特に適しています。ビューの一般的に小さなフィールドには、組織全体の規模に高倍率での変化を相関させるだけでなく、unbiasedlyかつ定量的超微細構造の特徴を解析することは困難です。 ヒト組織または動物モデルにおいて病状の評価、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）着色包埋ホルマリン固定パラフィン切片（FFPE）TISの病理学的分析のためにスーは標準です。単純なH＆E染色の免疫標識の他にも、病的異常を識別するために行われます。このような組織は、EMレベルで特定の細胞型を分析することができ、細胞内変化を同定することができる。場合大規模EMの公平な性質は、病気の予期しないと新規な特徴を見つけることができます。大規模EMによって平方ミリメートルまでの領域を可視化することができます。我々と他の人は、以前膵島4、細胞培養2、ラット脳3、皮膚や粘膜7と全体ゼブラフィッシュ幼生1,5（www.nanotomy.org）をラットにするnanotomyを適用しました。ゼブラフィッシュ特に脳免疫細胞11を含めた哺乳動物の組織中のアクセスが困難な細胞タイプを可視化するために、 インビボイメージングのために非常に適しています。ここでnanotomy手順は、ニューロンによってメトロニダゾールの変換によって条件神経切除を受けているゼブラフィッシュヘッドの冠状切片に適用され、詳細に記載されていますニトロレダクターゼ（www.nanotomy.org）5,12-14を表明しました 。すべての生データは、組織規模の変化の分子可視化、ズーム可能なHTMLファイルとして表示されます。生データの提示は、世界中の専門家による他の角度からのデータセットの公平な分析を可能にします。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>low melting point agarose</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>sodium cacodylate</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>osmium tetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>potassium ferrocyanide (K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;[Fe(CN)]&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>uranyl acetate&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>sodium tetraborate</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>toluidene blue</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>basic fuchsin</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>lead citrate</td><td>BDH</td><td>discontinued</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EPON&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-dodecenylsuccinicacid anhydride&amp;nbsp;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>methylnadic anhydride</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>glycid ether 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>standard flat embedding mold</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>diamond knife</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>copper grids&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>double sided carbon tape&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scanning EM Zeiss Supra55</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultramicrotome Leica EM UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>atlas external scan generator&amp;nbsp;</td><td>Fibics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale scanning transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain

大規模な二次元電子顕微鏡（EM）、又はnanotomy、ナノスケールの分解能電子顕微鏡の組織全体のアプリケーションです。その他、我々は以前にヒトの皮膚膵島、組織培養および全ゼブラフィッシュ幼生1-7に、大規模なEMを適用します。ここでは、サブ細胞および分子機能の公正な検出のための組織規模スキャンEMのための普遍的に適用する方法について説明します。 Nanotomyは健康および神経変性ゼブラフィッシュ脳を調査するために適用されました。我々の方法は、標準化されたEM試料調製プロトコルに基づいています：固定グルタルアルデヒドとオスミウムと、エポキシ樹脂の埋め込みに続いて切片とウラニルとリード付きポスト染色に続いて1ホールのグリッド上の超薄切片、の実装極薄。大規模な2D EMモザイク画像は、走査透過EM（STEM）を用いて、外部の大面積スキャン発生器に接続された走査EMを使用して取得されます。 50 G画素I - 大規模EM画像は、典型的には〜5ですn個のサイズ、最高のオンライン地理的なHTMLマップに似た任意のWebブラウザで開くことができるズーム可能なHTMLファイルを、使用して表示。この方法は、（ヒト）の組織、動物全体の断面、ならびに組織培養1-5に適用することができます。ここでは、ゼブラフィッシュ脳を非侵襲的神経切除モデルで分析しました。私たちは、1つのデータセットの組織、ニューロンおよびミクログリアを含む種々の細胞型に定量することができる細胞および細胞内の変化、脳のマクロファージ内で可視化します。大きな表面積は、以前に蛍光顕微鏡を用いて画像化されるように加えて、nanotomyは同じ組織で8（クレム）光学顕微鏡を用いてEMの相関関係を容易に、その後ナノ解剖（nanotomy）、その結果、大面積EMに供することができるの組織。すべてでは、nanotomyは、組織全体の定量化可能な方法でのEMレベルでの機能の公正な検出を可能にします。

1週齢のゼブラフィッシュの幼虫の頭部の冠状断面の大規模EMデータセットは、単一の大規模な画像（www.nanotomy.org）で、多くの組織および細胞の特徴を示しています。 コントロール脳切片のNanotomyは、嗅覚繊維束、ニューロン核とシナプスを含む神経細胞のサブコンパートメント（ 図2A、www.nanotomy.org）を含む吻側前脳の神経組織の典型的な超微細構造の特徴を明らかにする。区別することができる頭の中で細胞型は下顎の大きな液胞、嗅神経細胞のオスミウム親和性のミエリン、小血管の内皮細胞と軟骨細胞を含む、構造体は髄膜（髄膜のゼブラフィッシュの対応、膜状層の収容を含みます哺乳類の脳）。細胞内構造は、異なるセルにおける表皮の糖衣、異なる核形態および病巣を含みます<html>ゴルジ体、小胞体（ER）、ミトコンドリアおよびシナプス小胞とシナプス後密度を含むリットルタイプと細胞小器官。 予想外に心室の内側を覆う細胞の核は、脳内のより横方向に分散させ、他の細胞と比較して非常に高電子密度です。さらに、これらの心室の核は、脳内の他の細胞に存在しない暗い病巣を示し、貪食ミクログリアの核で発見されたヘテロクロマチン、（ 図2）から大きさや構造に異なる表示されます。ゼブラフィッシュの開発に心室の内側を覆う細胞は、より分化した細胞よりも変化したクロマチンの状態を反映している可能性がある、主に放射状グリア細胞や神経前駆細胞が含まれます。組織中の幹細胞は、一般的に非常に稀であるので、組織スケールEMで幹細胞マーカーのための組織の標識を相関させるnanotomyしたがって、幹細胞の超微細構造の特徴を識別するために使用することができます。 ve_content：神経切除を受けたゼブラフィッシュ幼生における冠状断面の「FOキープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt;大規模EMは（www.nanotomy.org）見られない多くの特定の組織、および細胞および分子の特徴を明らかに対照動物に。携帯電話の機能が貪食ミクログリアを含み、おそらく死細胞（ 図2B、www.nanotomy.org）を表す、細胞の大きさを液胞。以前EM研究は、脊椎動物18,19にミクログリアを同定した。ミクログリアの特徴は、細長い核を含みます、核膜の隣に斑状のクロマチン塊、著名なゴルジ装置、無料のポリリボソーム、粒状の小胞体（ER）細長い嚢、比較的暗い/高密度の細胞質、及びそのような食細胞、脂肪滴およびリソソームなどの多数の介在物、と。これらのすべての哺乳動物組織におけるミクログリアに起因する顕著な特徴は、また、ゼブラフィッシュ脳（ 図2B、www.nanotomy.org）にこれらの細胞で発見されました。 &lt;キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt;：FO Pクラス= &quot;jove_content&quot; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> 図1：ゼブラフィッシュの脳に大規模な組織電子顕微鏡のワークフロー。 （A）7日齢のゼブラフィッシュ幼虫。（B）エポキシ樹脂に並んで埋め込 ​​まれたゼブラフィッシュ幼虫の頭。半切片標本を配向-thinための（C）ガラスナイフ。（D）2を示す代表的半薄トルイジンブルー染色したセクションサイド・バイ・サイド組み込みゼブラフィッシュの幼虫。極薄（70 nm）のセクションをカットする（E）ダイヤモンドナイフ。（F）編集した画像位置を示すために、1穴グリッド上の全体のゼブラフィッシュの幼虫の脳切片の（D）。（G）で本研究では、大規模な2D EMのために使用される顕微鏡システム。画像処理の（H）の流れ。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてください</a>この図の拡大版を表示します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> 。 図2：Nanotomy 結果：高分子由来の組織に処理された7日後の受精制御および（B）の脳の（A）Nanotomy（神経アブレーション; 図1）、神経細胞に特有の特徴を示すが、脳変性をアブレーション（B）これらの細胞死および神経組織（（A）及び（B））のスポンジ状の外観を受ける食ミクログリア、暗い細胞が含まれます。 （5から適応）アッパーパネル：中央のパネルに示された領域の10X拡大図。中央のパネル：下のパネルに示された領域の10X拡大図。 （A、下パネル）、シナプス小胞（SVの）にシナプスを示す神経網の（A、中央のパネル）高倍率ビューとシナプス後密度（PD）。 （B、中央のパネル）高倍率アメーバミクログリアのビューまたはおそらく著名なゴルジ装置（G）、リソソーム液胞（L）を含む介在物を含む典型的なアメーバミクログリアの機能（下のパネル）を示すマクロファージ（中央のパネル、M）。スケールバー：50μmの（上）、5ミクロン（中央）と0.5ミクロン（下）。この図は、5から変更されている。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a> 、または完全なデータをオンライン（nanotomy.org）をご覧ください。

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Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

健康と負傷ゼブラフィッシュ脳の大規模な走査型透過電子顕微鏡（Nanotomy）

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

large-scale-scanning-transmission-electron-microscopy-nanotomy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

11.0K ビュー.  UMC Groningen. Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury. 

ビデオ: Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

発生生物学

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

神経科学

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

ゼブラフィッシュとメダカを用いた成体視神経筋の刺創損傷モデルによる再生能力の比較解析

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

ゼブラフィッシュの幼虫を用いて出血性脳卒中の病理学的結果を研究する

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

目覚めしたゼブラフィッシュ幼虫と頭蓋骨と皮膚除去による若年組織の完全に活性な脳組織のインビボイメージング

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

成虫ゼブラフィッシュにおける鈍力損傷の影響を研究するスケーラブルモデル

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

インビボ ゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

著者スポットライト:三次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生のin vivo全脳イメージング  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

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健康と負傷ゼブラフィッシュ脳の大規模な走査型透過電子顕微鏡（Nanotomy）

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インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

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