このプロトコールに記載の代表的な結果を得るために生成魚のケアと使用はボストン小児病院、プロトコル番号の14-05-2673Rで機関動物実験委員会によって定められたガイドラインに完全に従って行きました。

1.ワムシ文化<ol><li> 100 L培養容器を用いて培養システムの基本コンポーネント <ol><li>ワムシ培養のセットアップのためのすべてのコンポーネントを収集します。ワムシ培養セットアップはワムシを成長させるために培養容器（CV）で構成されています。送り出しのワムシ（送り出し培養容器、FCV）を維持するために、同様の容器。藻類の供給混合物（AFM）を格納するための丸底孵化瓶（貯水池、FRフィード）。 CV、FCVおよびFRを通気するための空気供給（AS）; CVとFCVに藻フィードの配信を制御するために、測光タイマー（PMT）と蠕動ポンプ。 CVの内側に座って、フロス粒子フィルタ（FPF）。 注 ：サプライ品およびコンポーネントの完全なリストは、 物質一覧に記載されています。 </li></ol></li><li> コンフィギュレーション <ol><li>文化が簡単に収集続きに嵌合ドレインを経て収穫することができるように、スタンドまたはテーブルの上にCVとFCVを昇格ainer（ 図1）。各培養容器内の剛性チューブの長さにASを接続するための柔軟な空気供給チューブを使用してください。チューブは、CVやFCVの底に空気を提供するのに十分な長さであることを確認してください。 </li><li> AFMが含まれているFRの下まで延びて、剛性チューブの長さにASを接続するために小容量のエアラインを使用してください。空気の流れを調整するために、各エアラインにバルブを取り付けます。飼料供給チューブとのPMTにFRを接続し、上部付近に、CV / FCVの側面に開けた穴に、PMTからチューブを実行します。 図1。 </li></ol></li><li> 起動 <ol><li>逆浸透水（RO）で使用可能な容量の90％に培養容器を埋めます。 ROが使用できない場合は、きれいな、脱塩素水道水を使用します。しかし、バイオセキュリティのリスク評価には、潜在的に病原性生物が源水に存在しないことを確実にするために実行する必要があります。注：このような分析を行うことができますいずれかの資格を水試験所によって。 </li><li> 15グラム/ Lの塩分濃度に達するように水槽塩と培養容器の水を用量。それは「ローリング沸騰」を維持す​​るように容器内に空気の流れを設定し、それは完全に通気することによって溶解されるまで、ゆっくりと培養容器に一定量の塩を加えます。それは完全に酸素化であることを確実にするために&gt; 1時間水に空気​​を混入続けます。 </li><li>藻類の供給混合物を作ります。クリーンの3リットルに、新鮮な（0 ppm）で水を脱塩素アンモニア中和剤（ナトリウムhydroxymethylsulfonate）のNaHCO 3および100グラムの100グラムを追加します。この最後の試薬は、培養器材の消毒から水道水や漂白剤残留物から残留塩素を中和するという付加的な利点を提供します。これは、これらの化合物が完全に溶解されることを保証することが重要です。そして、藻類の濃縮物（バイオマス乾燥重量〜15％）の1 Lを追加します。 4℃でFRおよびストアへの供給混合物を追加します。 </li><li>千万 - 5のスターター培養物を追加します。 <eM&gt;通気さ15グラム/ Lの塩分の水を含むCVにBrachionus plicatilisワムシ。ワムシは、出荷または貯蔵中に冷却されている場合、それらは以下のようになり、徐々に培養容器内の水の温度に順応させ（30分以上の間）（25 - 27゜C）。 </li><li> PMTの電源をオンにし、ワムシ培養容器内に藻フィードをポンピング開始。 〜藻類供給混合物の1.6ミリリットル、1日あたり、培養中に百万ワムシごとに配信されるように、PMTのタイマー機能を使用すると、藻類の供給混合物の送達速度を設定します。 24時間の期間にわたって定期的に少量ずつ授乳を配布。授乳より頻繁に、より良いです。 </li><li>手動で設定された期間（ 例えば、1分）のためにPMTをオンにしてポンプの吐出流量を校正し、メスシリンダーやビーカーにこのインターバルの間にポンプ藻類を収集します。例えば、PMTの用量藻類5mlの1分であれば、線量率は次のようになります5 mlの藻類/分。 </li><li> 1.6ミリリットルによって、何百万人で、現在のワムシの数を乗じて、必要な毎日の供給速度を計算します。例えば、億ワムシの人口サイズのワムシ培養の1日あたりの供給の〜160ミリリットル（100×1.6 ml）を必要とするであろう。 </li><li> 24時間の期間を通して一定の間隔で合計一日の供給要件を投薬するPMTを設定します。例えば、の送達は、160 mlの総毎日の送り量は、部分に5 mlの4分間/分の投薬ポンプ速度とPMTのセットを使用して、24時間の期間にわたって一回3時間、毎日8回（5を送達することができml /分×4分= 20ミリリットル×8授乳= 160ミリリットル）。 </li><li>収穫前に、72時間 - それは必要な人口を生成するまでの文化は一般的に48のために、成長できるようにします。 24時間で、最大始動後培養容器にフロス粒子フィルタを追加して、通常の保守を開始します。 </li></ol></li><li> メンテナンス 注：文化は継続的に動作し、routinが必要です理想的には、次の順序で、毎日同じ時刻に行われるべきである電子整備。 <ol><li>クリーンで利用可能な容量の90％にFCVを記入し、10グラム/ Lの水族館塩を投与された、新鮮な水を脱塩素。水が十分に混合すること、及び塩の全てが完全に溶解していることを確認してください。それは「ローリングボイル」を維持す​​るように容器内に空気の流れを設定します。屈折計で塩分を測定し、塩分濃度が10g / Lであることを確認してください。この目標を達成するために、それを超えない重要なことです。 </li><li>文化の異なる部分から、3ミリリットルホールピペットやautopipettorを使用して、各 - その後、2の3つのサンプルを収集し、文化が十分に混合されていることを確認します。CVにおけるワムシのサンプル。これらのサンプルは、便利なサイズ（ 例えば、10 ml）をチューブまたはバイアルに結合します。 </li><li>それは、解剖顕微鏡下で可視化することができるように、ペトリ皿に合わせたサンプルを2ml - トランスファー1。文化の品質をチェックします（の振る舞い​​を泳ぎますワムシ、切り離された卵の存在、汚染原虫）。 </li><li> 50％Lugols試料にヨウ素溶液100μlを加えることによって、残りの混合試料中のワムシを固定します。秒以内にLugolsを添加した後、水泳を停止するにはワムシを観察します。さて、簡単にワムシを数えます。 注：エタノール、希釈漂白剤、または酢はLugolsの代わりに使用することができます。酢（2滴/ 10 ml）をあることの利点を有している非危険、およびワムシの契約をすることはできません漂白剤とヨウ素溶液などの記憶装置に強度を失うので、繊毛のコロナと「足」は、拡張のままではなく、動物がより自然に見えます。 </li><li>その後すぐにプラスチック製のピペットで〜2ミリリットルのサブサンプルを取り、（固定化されたワムシは急速に沈降する）、サンプルが十分に混合されていることを確認し、Sedgewick-ラフターカウントスライドに1ミリリットルを分配（20×50 1 mmの正方形）（ 図2 ）。解剖や化合物の顕微鏡を使用して、無傷のワムシをカウントし、トンこれらのワムシ（図2）に接続されている卵のotal数。 〜100ワムシをカウントするために、必要に応じてスライド領域の多くを数えます。 1ml当たりのワムシの数を計算して、スプレッドシートやログブックでこれを記録します。 </li><li> CVにおけるワムシの量の収穫は〜30％：、空気供給およびフロスフィルターを取り外し、ゆっくりとCVの下部にあるバルブを開け、水が53ミクロンメッシュスクリーンでプランクトンのコレクタに流入することを可能にします。バケツやドレインにフィルタリングした後、集電体の底から流れ出る水を収集します。ワムシの損傷を防ぐために、適度な流れに優しいを使用してください。ワムシは、画面上で乾燥させないでください。 </li><li>一貫性の理由から、毎日ワムシの標準数のFCVを確立することが望ましいです。したがって、既知のCVのワムシ密度と収穫量に基づいて、一貫性の最終密度を達成するために、FCVの総音量を調整（ 例えば 、1500ワムシ/ mlで）。収穫ロティを追加FCVへFERSは：（ - 15グラム/ Lの10）静かにきれいな海水で満たされた洗浄ボトルを使用して、コレクション画面からワムシを転送します。 FCVの上に画面を反転し、食塩水の穏やかな流れでFCVにワムシを洗います。 FCVへの供給（一日あたり百万ワムシ当たり〜1.57ミリリットル）を提供するためのPMTを開始します。 </li><li>きれいな、柔らかいナイロンブラシやスクラブパッドでCVの内部全体をスクラブ。 </li><li>水の量を置き換えるために5ガロンのバケツにきれいなRO水の測定量に塩の適切な量を添加することにより、15グラム/ Lの水の新しいミックスを作る収穫する失いました。バケツの水に塩を加え、完全に溶解するまで激しく攪拌した後、CVに追加します。 </li><li>シンクに高圧スプレーを使用して、それは破片がなくなるまでフロスフィルターを洗浄した後、CVにそれを返します。 </li><li>ワムシ/ mlの毎日の数に応じて、各投与イベントの持続時間を変更することにより、CVに送達藻類の供給量を調整します。配信される飼料の適切な量を決定するために、上記のステップ1.3.8で提供さの計算を使用してください。 </li><li>約24時間後、プロセスを繰り返します。上記の（ - 1.4.10 1.4.2ステップ）と同様に（前日に不要であった）、FCVに残っているワムシを収穫することにより開始します。新鮮な、きれいな脱塩素水（5グラム/ Lの塩）の2リットルでそれらを濃縮します。これらは、バックアップ電源として4℃で保存するか、このプロトコルに記載されるものを超えて、魚の後の段階を供給するために使用することができます。 注：このプロトコルは、2まで許可 - CVにおけるワムシが深刻な結果なしで収穫の省略を許容することができるので、（通常の自動給紙に）減少培養維持の3日間。 </li></ol></li></ol> 2. Polyculture <ol><li> セットアップ <ol><li>ティーストレーナーを通して生成された胚を注ぎ、その後静かに滅菌FISですすぐことにより産卵イベントからゼブラフィッシュの胚を収集時間、水（または適切に調整され、溶液の他の非汚染源、 例えば、胚培地、E3など）ペトリ皿に洗浄瓶から。 </li><li> 5日間皿当たり50胚 - 40の密度でペトリ皿中で28℃ - 25で胚を培養します。 </li><li> 5日後に受精、または孵化した幼虫の90％以上が積極的に水柱の中に泳いでいるのpolycultureフェーズを開始します。 </li></ol></li><li> 接種 <ol><li> 3.5 L保育園タンクにFCVから直接ワムシ培養液500ミリリットルを追加します。ワムシ培養水を含めることはpolyculture中ワムシの栄養成分を維持藻類フィードを提供します。 </li><li>ゆっくり保育園タンクに1ペトリ皿から幼虫を注ぎます。何の幼虫が皿に残っていないことを確認してください。 </li><li> 1 Lの最終体積と最終秒に到達するためにタンクに再循環システムまたは専用の水源からのクリーンな、コンディショニング魚水500mlを加えます5 G / Lのalinity。 注：塩分は塩分&lt;2グラム/ Lの場合&gt; 7グラム/ Lとワムシの生存率はマイナスの影響を受けるの場合はゼブラフィッシュの幼虫の生存率がマイナスの影響を受けるため、この塩分濃度は非常に重要です。 </li></ol></li><li> Polyculture段階 注：polyculture段階は（日5-9受精後に対応し、5日間の合計）までの4日後の接種に続くべきです。 <ol><li>ワムシや魚が存在し、成長していることを確認するために、この期間中に少なくとも1日1回あたりpolycultureタンクを確認します。ワムシは水柱全体に表示されていることを確認してください。 fishsはワムシの中で泳いで、水柱の中にも表示されていることを確認してください。 </li><li>タンクを介して通常の水の流れを開始します。スクリーンを配置したり、タンクからフラッシュされない幼虫を確保するための排水口の上にバッフル。 注：この段階の終わりに、魚は、 アルテミアのようなより大きな獲物のアイテムを消費するのに十分な大きさになります125ミクロン - 75のサイズ範囲のノープリウスまたは処理フィード項目。 注：代表polycultureタンク内のワムシ個体群動態はステップ1.4.2で説明したのと同じ方法で、タンクからワムシをカウント/サンプリングによって測定した - 1.4.5。それが完了するまでこれがpolycultureフェーズの開始から一日一回行われました。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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ECヘンリーはリード養殖社、養殖や魚の愛好家の市場にワムシ、藻類の濃縮物、およびその他の消耗品を提供する企業で採用されています。

魚を養うために、連続ワムシ培養系の確立と維持、及び同タンク内のワムシと一緒に最初に送りゼブラフィッシュの幼虫を培養：早期幼虫のゼブラフィッシュを供給するためのワムシpolyculture方法の実装を成功させるには、二つのタスクのための有効なプロトコルが必要です。 最初のローレンスおよび共著者14で説明したゼブラフィッシュの研究室用の連続塩水?...

5 -ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、発生遺伝学、毒物学、行動、水産養殖、再生生物学、多くのヒトの疾患1のモデル化を含むがこれらに限定されない科学分野の増加、で利用卓越した実験動物です。種は実験室で維持することは比較的容易であるが、彼 ​​らの文化6に関連する管理上の課題がいくつかあります。これらの中で最も顕著なのは魚が第一ガス膀胱インフレ7以降のフィードを開始する場合は特に、幼虫の飼育です。成長の5日7特に重要である-通常の、制御された条件の下では、この発達イベントには、次の3で、受精後（DPF）〜5日後に発生します。フィード項目は、diges適切なサイズでなければなりません - この段階で中心的な技術的な難しさは十分に第1の給電幼虫の栄養要求を満たすためにあります培養タンクに過度の廃棄物を作成せずに、ほぼ連続的に魅力的、および使用可能なtible、。歴史的にこのルーチン水交換8,9とともに、タンクで魚に餌の多数の少量を提供することで、一般的に達成されました。これらの方法はある程度成功しているが、それらは、非効率的で高い労働投入を必要とし、唯一の変数と成長と生存10の制限されたレートを返します。 自然界では、ゼブラフィッシュの幼虫は、おそらく水柱11に豊富に小さな動物プランクトンの存在を餌に。このため、このようなゾウリムシ 、ワムシ、およびアルテミアなどのライブフィードを組み込むlarvicultureプロトコルは、通常、7最も効率的です。 2010年、最もよく、共著者は、外因性の摂食12の最初の5日間塩水ワムシと一緒に静的な、汽水水に幼虫のゼブラフィッシュを成長させることが可能であることを実証しました。このアプローチは、どのハーネスエスワムシ培養の自然な高生産性が低い労働投入12,13と幼虫の成長および生存の収率が非常に高い料金、水を汚染することなく、十分な、栄養価の高い獲物を提供します。近年では、世界中の研究室の数は増加し、このプロトコルのバリエーションを採用しており、その多くが今保育園のシステム14をサポートするために、連続的にワムシを培養しています。 過去数年にわたり、ワムシ/ゼブラフィッシュpolycultureとワムシ生産の両方のための方法は、洗練され、より標準化されたと容易に拡張可能になるように改善されました。この記事では、1のためのステップバイステップの手順）は、連続かつ堅牢なワムシの生産と2）外因性の給餌の最初の5日間魚の力強い成長をサポートするために使用ワムシ/ゼブラフィッシュpolycultureシステムの確立を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Infrastructure</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">100 Liter Culture Vessel</td>
			<td style="width:135px;">Aquaneering</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:264px;">Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">5 Gallon Culture Bucket Kit</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">CCS Starter Kit</td>
			<td style="width:264px;">Small volume culture vessel for small facilities</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing 1/2&#34; O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Mesh tube</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">RT444X</td>
			<td style="width:264px;">Mesh tube support for floss filter</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rotifer Floss</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotifer floss 12&#8221; x 42&#8221;</td>
			<td style="width:264px;">Particulate waste trap</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD</td>
			<td style="width:135px;">Grainger</td>
			<td style="width:119px;">38M003&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture)</td>
			<td style="width:135px;">Coral Vue</td>
			<td style="width:119px;">SKU: IC-LQD-DSR</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Silicone Tubing&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;">Tubing for algae delivery to rotifer vessel</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing &#34; O.D.,36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery to algae paste</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for algae delivery</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifers</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Type L 5 million</td>
			<td style="width:264px;">Rotifer stock culture for system startup</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Feed</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Sodium hydroxymethylsulfonate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">ClorAm-X&#174; 1lb tub</td>
			<td style="width:264px;">Ammonia reducer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S25533B</td>
			<td style="width:264px;">pH buffer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Microalgae concentrate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotigrow Plus&#174; 1 liter bag</td>
			<td style="width:264px;">Nutritionally optimized rotifer feed</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Water Preparation</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:305px;">&#160;Reef Crystals Reef Salt</td>
			<td style="width:135px;">That Fish Place</td>
			<td style="width:119px;">198210</td>
			<td style="width:264px;">Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Refractometer</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SR6</td>
			<td style="width:264px;">measuring salinity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Plankton Collectors 12&#34; Dia, 53 microns</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">BBPC20</td>
			<td style="width:264px;">Mesh screen for collecting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Scrub Pads</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SCR-58</td>
			<td style="width:264px;">Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Scrub Brush</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Bucket</td>
			<td style="width:135px;">Grainger Supply&#160;</td>
			<td style="width:119px;">43Y530</td>
			<td style="width:264px;">Graduated bucket for mixing culture water</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Hatching Jar</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">J30</td>
			<td style="width:264px;">Storage of algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Lugol&#8217;s Solution, Dilute</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S99481</td>
			<td style="width:264px;">Agent used to immobilize live rotifers for counting</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Eco-Systems</td>
			<td style="width:119px;">M415</td>
			<td style="width:264px;">Counting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Miscelleneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Tea Strainer</td>
			<td style="width:135px;">Kitchenworks</td>
			<td style="width:119px;">971972</td>
			<td style="width:264px;">Used for collecting zebrafish embryos after spawning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

ここに記載の連続ワムシの培養システムは動的であり、そして毎日の給餌、収穫率のばらつきがある場合ワムシ数が経時小さい程度に変動することは正常です。ボストン小児病院での養殖施設での積極的な文化の一つでワムシの人口は、上記のように維持し、30日（ 図3）をモニターしました。この期間中の平均培養密度は1330ワムシ/ mlの最大値及び510ワ?...

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The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

飼育第1の給電ゼブラフィッシュの完全および更新された「ワムシPolyculture方法」

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.3K ビュー.  Boston Children's Hospital. Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

発生生物学

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

フルーツフライを飼育<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;無菌およびノトバイオート条件の下で

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

飼育第1の給電ゼブラフィッシュの完全および更新された「ワムシPolyculture方法」

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