0315741：私たちは、この研究は、教育研究のドイツ連邦省（BMBF）プロジェクト仮想肝臓でサポートされていた、図1の作成を支援するための嘉李劉に感謝したいと思います。

注：すべての細胞を、一次または二次肝腫瘍を有する部分的な肝切除後に残っ切除非腫瘍性ヒト肝臓組織から単離しました。 Universitätsmedizinベルリン - 患者のインフォームドコンセントをシャリテの倫理指針に従って得ました。 材料とソリューションの作製<ol><li>分離プロセス中に細菌汚染を避けるために、事前にすべての機器および材料を滅菌します。 </li><li>新たに調製された消化液を除いて、 表1及び2に記載の肝臓組織試料、肝細胞および非実質肝細胞の単離方法と初代ヒト肝細胞の培養の灌流のために必要な溶液を調製使用前に。全ての溶液は4℃で保存することができ、調製後4週間以内にそれらを使用することが推奨されます。 </li><li>殺菌します0.22μmのボトルトップフィルターを用いて全ての溶液。 </li></ol>灌流機器の作製<ol><li> 図1Aに示すように、肝臓組織試料の灌流および消化のための機器を設定します。 </li><li>灌流および消化中に最適なコラゲナーゼPの活動を確保するために39℃に水浴温度を調整します。 </li></ol>肝臓組織試料の3灌流および消化（1.5時間） <ol><li>切除した肝臓組織から無傷のグリソン鞘と組織サンプルを選択します。組織サンプルを切断すると、良好な可視隻と小型の切断面を得ることを試みます。輸送および灌流まで氷上で肝臓組織試料を処理することにより、暖かい虚血時間を避けてください。 </li><li>無菌条件下で組織重量を取り、層流中でペトリ皿に肝臓組織試料を配置します。再から滅菌圧縮して組織試料の表面を清掃してください血液をmainingと私はすべてのカニューレが浸透したことを確認するために、1×灌流-Solutionを使用してカニューレセットをフラッシュします。 </li><li>いくつかのより大きな血管にカニューレのオリーブを修正するために組織接着剤を使用してください。肝臓組織試料の大きさ及び表面の血管の数に応じて、3~8カニューレで設定カニューレを使用します。灌流をテストし、漏れをチェックします。組織接着剤で、明確な1×灌流溶液Iを漏らすすべての血管を、閉じます。 </li><li>その穴のあいたフィルターディスク（ 図1A）上のブフナー漏斗にカニューレ肝臓組織試料を置きます。 </li><li> 7.5ミリリットル/分であり、使用されるカニューレの数と肝組織の抵抗に応じて14.6ミリリットル/分の蠕動ポンプの流量を設定します。現在しかし遅い灌流があることを確認するために流量を毎回調整します。全血を流し出さないが、少なくとも20分されるまで、組織を灌流。良いperfusi地域で明るくなって組織を観察に。 注：いくつかのケースでは、プラスチッククランプを有するカニューレの一方をクランプするために必要であり得るか、または灌流を最適化するために、肝臓カプセルに対してスパチュラで静かに押して領域内の圧力を増加させます。光茶色がかった色に黄色の光への完全な色の変化は、良好な灌流を示しています。 </li><li>コラゲナーゼP（ 表1）を含む消化液に灌流液を変更します。 </li><li>消化段階のセットアップ（ 図1A）を並べ替えます。そのため、最大15分間、 図1Bによれば消化-ソリューションの円形の流れを行います。 注：肝臓組織サンプルが十分に消化されるとき、すぐに灌流を停止することが重要です。良好な消化は、それがスパチュラで押されると、カプセルの変形を維持することによって評価されるような組織は、弾力性の兆候を示していない場合、観察することができます。 </li></ol>肝細胞の単離4（1時間） <ol><li> Tオフ蠕動ポンプをURNとガラ​​ス皿に肝臓組織試料を配置します。氷冷ストップソリューション（ 表1）を用いて組織試料の外側を洗浄します。肝臓組織試料からカニューレを外します。カニューレが取り付けられていたエリアの中央に切開することにより、肝臓組織のサンプルを開くにはメスを使用してください。 Glisson&#39;sカプセルが無傷のままで注意しておいてください。 </li><li>組織試料の内部を洗浄した後、氷冷停止溶液で全体の組織サンプルをカバーしています。組織から細胞を解放するために穏やかに組織を振ります。 </li><li>細胞懸濁液を収集し、50mlのプラスチックチューブに視線漏斗（ガーゼ湿布を敷いたプラスチック製の漏斗）を介して、それをフィルタリングします。 500 mlの最終容量が消費されるまで、肝臓組織試料に対して、より停止溶液を加えます。 </li><li>遠心分離機50×gで、5分間、4℃で細胞懸濁液。後で非実質細胞の単離のために上清を収集します。 （ 図2のPBSで細胞ペレットを洗浄A）。 </li><li>遠心分離機50×gで、5分間、4℃で再び細胞懸濁液。上清を収集し、肝細胞インキュベーション培地中で再懸濁ペレット（ 表2、 図2B）。 </li><li>トリパンブルー染色を用いて得られた細胞懸濁液中の細胞数及び生存率を決定します。ノイバウアーカウントチャンバー内の生活と死細胞を数えます。以下の式を用いて細胞数、生存率およびPHHの収量を計算します。 収量（計数した細胞）を細胞懸濁液（ml）を計数した細胞のX希釈因子X量が10,000 X = 収量（肝細胞/（g肝臓組織試料））=（細胞懸濁液（ミリリットル）の収率（肝細胞/（mlの培地））×体積）/（肝臓組織試料の重量（g）） 生存率（％）= 100％X（生細胞数）/（総細胞数） </li></ol>肝細胞の5精製（1時間） 注：この精製工程が推奨され、生存能力場合70％未満です。 <ol><li>氷の上のすべての手順を実行します。密度勾配遠心5mlの密度勾配溶液を、15 mlのPBSを混合することにより25％の密度勾配を準備します。 </li><li>両層の明確な分離が（ 図2C）が達成されることを保証するために、25％の密度勾配層の上に慎重にゆっくりと肝細胞が豊富な細胞懸濁液のうち、合計で50澪セルの最大を入れてください。 1,250×gで、20分間、ブレーキなしで4°C（ 図2D）で遠心分離し、遠心分離に慎重にチューブを入れてください。 </li><li>残りの細胞懸濁液と間期における死細胞を吸引します。脂肪含有量に応じて、1つはまた、密度勾配液を吸引する可能性があります。 注：PHH低脂質含量を持つが密集し、ペレットと密度勾配を完全に吸引することができますを形成します。高脂質含量のPHHはより拡散してペレットを形成し、生存細胞の多くは、ペレット、上記密度勾配溶液中に残ることがあります。 </li><li>50 XG、5分、4℃で再びPBSと遠心分離と肝細胞ペレットを再懸濁します。ペレットをプール、再びPBSで洗浄し、肝細胞インキュベーション培地中に精製されたPHH再懸濁します。ステップ4.6で説明したように細胞計数を行います。 </li></ol>肝細胞の6.栽培<ol><li>例えば、ラット尾コラーゲン（コラーゲンタイプI）は、細胞外マトリックスでそれらをコーティングすることによってPHHの播種のための細胞培養皿を準備します。ラジャンらによって確立されたプロトコルに従って、ラット尾コラーゲンを準備します。17 </li><li> PBSで200：ラット尾コラーゲン原液1を希釈します。表面全体が覆われている培養皿への転送を100μl/ cm 2のラット尾コラーゲン溶液、世話。室温で20分間、細胞培養プラスチックをインキュベートします。残りのラット尾部コラーゲン溶液を吸引します。 </li><li>培養dishe上の肝細胞インキュベーション培地中の種子15×10 4肝細胞/ cm 2のラット尾コラーゲンでコーティングされたのです。少なくとも4時間、37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中で細胞を培養。 4時間後、肝細胞は、付着した培地を変更することができます。 </li><li>実験に応じて調査を行います。 48時間の培養時間は、細胞が単離プロセスから回復することを可能にすることをお勧めします。 </li></ol>非実質肝細胞の7単離（1.5〜2時間） <ol><li>遠心分離機残りの赤血球および肝細胞を排除するために72×gで、5分間、4℃で回収した上清（ステップ4.5および4.6）。プール上清および回2細胞ペレット得るためにそれらを遠心：残りKCの沈降のためにHSC、LEC、一部はKCと650×gでの沈降のための300×gで、5分、4°C、7分、4°Cを。 </li><li>プールペレットおよびHBSS中で再懸濁それらの両方。密度勾配centrifための密度勾配溶液とPBSを混合することにより25％と50％の濃度勾配を作製ugation（25％の密度勾配溶液5 mlの密度勾配溶液を、15 mlのPBS、50％の密度勾配溶液の調製：10mL密度勾配溶液と10mlのPBS、 図2を参照）。 50％の密度勾配溶液層の上に慎重に25％の密度勾配溶液を置き。 </li><li>両層の明確な分離が達成されるようにして25％の密度勾配溶液層の上に慎重にゆっくりとNPCのサスペンションを置きます。 </li><li>遠心ブレーキなしで1,800×gで、20分間、4℃での密度勾配上での細胞懸濁液（ 図2.2）。 </li><li>最上層から吸引し、死細胞と細胞の破片。 NPCは、25％と50％の密度勾配層（ 図2）との間の相間に配置されています。 NPCを収集し、HBSSと遠心機で上記の二重遠心分離工程（ステップ7.2。）を適用し、細胞懸濁液を、それらを洗ってください。 </li></ol>クッパー細胞の8分離（アドヒアランス分離工程）（1時間） <ol><li>ステップ4.6で説明したようにNPC画分中のKCのための細胞数を実行します。 （懸濁液中のKCの外観について図3Bを参照してください）。遠心分離培地（ 表2）を播種クッパー細胞における上記の二重遠心分離工程（ステップ7.2）と再懸濁NPCとNPC画分。 </li><li> 5×10 5 KC / cm 2の密度で、プラスチック製細胞培養容器のKCを含有する画分をシードします。 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中で20分間KC培養物をインキュベートします。プライマリKCは時間の短い期間（ 図2.3）内の細胞培養プラスチックに付着します。 </li><li>主にLECとHSCからなる、ない付着NPCを含む上清を収集します。プールLEC（セクション9を参照）、HSCの後の分離のための上清（セクション10を参照）。 HBSSで接着KCを洗浄し、37℃、5％CO 2でクッパー細胞培養培地（ 表2）でそれらを養います加湿インキュベーターで2。 </li></ol>内皮細胞の9分離（1.5時間） <ol><li>遠心分離機300×gで、5分間、4℃で回収した上清（ステップ8.5）。 PBSでペレットを洗浄。 300×gで、5分で遠心分離した後、4℃の星細胞/内皮細胞の分離媒体中で細胞を再懸濁し、ステップ4.6で説明したように、残りのすべてのセルに対して細胞計数を行います。 </li><li>免疫標識のためのMACS-KITからブロッキング溶液を20μlおよびCD31マイクロビーズの20μlを添加、1ミリリットル星状細胞/内皮細胞の分離媒体中1×10 7澪細胞を再懸濁し、4℃で15分間、得られた懸濁液をインキュベート℃の温度（ 図2.4）。 </li><li>磁気活性化細胞選別システムMACS（ 図2.5）のためmanufacturer&#39;sプロトコルに記載されているように、HSCは別にLEC。磁気保持CD31陽性LECを溶出し、星状Cでそれらを一時停止エル/内皮細胞培養培地（ 表2）。 </li><li>ステップ4.6で説明したようにLECのための細胞計数を行います。ラット尾コラーゲンでコーティングした細胞培養容器で1.25×10 5細胞/ cm 2の密度でシードLEC（ステップ6.1参照）。加湿インキュベーター中、37℃で、5％CO 2で細胞を養います。 </li></ol>星細胞の10分離（0.5時間） <ol><li>非標識のHSCは、MACS手順の間に分離カラムを通過します。 （ステップ9.5、 図2.5を参照）HSC画分を収集します。ステップ4.6で説明したように細胞計数を行います。 </li><li>星細胞/内皮細胞培地（ 表2）（ステップ6.1参照）ラット尾コラーゲンでコーティングした細胞培養容器中で5×10 4細胞/ cm 2の密度でHSCを播種し、37℃、5％でそれらを養います加湿インキュベーター中のCO 2。 </li></ol><img alt= &quot;表1&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; 表1： 灌流および分離ソリューション。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> 表2： 文化との分離媒体。

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The authors declare that they have no competing interests.

公開されたプロトコルは、同時にヒト肝組織の同じサンプルから高品質と純度で、純粋なPHHやNPC、すなわちKC、HSCおよびLECを分離する技術が記載されています。 （ダムらによってレビュー。）ヒト組織を用いて行ったものの細胞集団18-20と単離手順のいずれか一方のみをカバーする肝細胞の単離を扱う出版物の大半はまれである21。ヒトの肝臓への動物組織（ ...

ヒト肝組織は非常に複雑であり、2つの異なる細胞エンティティ、実質細胞と非実質細胞（NPC）から成ります。肝実質細胞は肝細胞と胆管を含みます。肝細胞は、全肝細胞の60〜70％を表し、代謝、肝機能のほとんどを占め、 例えば、胆汁酸および因子合成、生体内変化とエネルギー代謝2,3を補完します。 より小さいNPC画分は、全肝細胞の30〜40％を構成します。 NPCは、異なる細胞集団、すなわち、クッパー細胞（KC）、肝内皮細胞（LEC）と肝星細胞（HSC）が挙げられます。この異種細胞画分は、肝臓の生理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしています。さらに、NPCは、肝硬変4などの慢性肝損傷、急性肝障害を仲介する、 例えば、薬剤誘発性肝障害（DILI）に参加するだけでなく、。 近年では、時間UMAN肝細胞はますます不可欠な研究開発薬物試験の、薬剤開発および肝疾患における新たな生化学的経路の同定になっています。 インビトロ試験のためにPHHの単一栽培は依然として「ゴールドスタンダード」として考えられている5。現在の同型肝臓モデルの主な制限は、数日4内の脱分化と肝細胞の機能の喪失です。 3次元（3D）培養技術の確立は、これらの制限は、4,6を補償することができることを示しています。しかし、現代の3D培養技術は、アクション7のすべての肝毒性のモードを表示することができません。既存のin vitroモデルで不足しているNPC集団は、in vivoでの状況にこの矛盾の可能性のある理由として議論されています。それにもpathophyにおける異なる肝細胞集団との間の細胞間コミュニケーションは、生理的恒常性において中心的な役割を果たしていることが示されましたsiologicは8を処理します 。したがって、科学的な関心は、NPCとそれらの細胞間相互作用にますます焦点を当てています。共培養および組織工学システムにおけるそれらの意図的な使用はできるだけin vivoでの状況に近いですインビトロ肝モデル8,9の高い需要のためのソリューションである可能性があります。 現在、主な課題は、PHHとNPCの明確に定義された部分が含まれている標準化されたヒト肝共培養モデルの開発です。その結果、非常に異種肝細胞の分離技術が必要とされ、それらは、純粋な細胞集団を得るために最適化されなければなりません。 PHH分離のための標準化されたプロトコルが10を存在するが、人間のNPCの標準化された単離は、まだ開発中です。ほとんどの公開されたNPCの分離プロトコルは、非ヒト細胞11,12を用いた実験に基づいています。ごく少数の出版物は、人間のNPCの分離プロセスを記述し、ほとんどがカバーのみ単一の細胞型11〜16の単離のための方法。細胞分離のために活用されている最も重要な細胞特性が大きさ、密度、付着挙動、および表面タンパク質の発現です。これらの特性に基づいて、我々は実験生物学と医学 1で以前に出版されたPHH、KC、LECとHSCを単離するために簡略化されたプロトコルを開発しました。そのため、この技術において幅広い関心が、この記事の目的は、より簡単な技術を再現することができますビデオを含む、肝細胞の単離プロセスのためのより詳細なプロトコルを提供することでした。プロトコルはまた、収量と生存能力の評価のためだけでなく、特定の免疫染色を用いて同定および純度評価のための品質管理方法を含みます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;General Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipettes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-incubator</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urine Beaker</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>perfusor syringe 50 ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>Bottle Top Filter</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture plate</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td><td>24 well</td></tr><tr><td>serological pipettes</td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td></tr><tr><td>pipette tips</td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &amp;micro;l, 200 &amp;micro;l, 1,000 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Isolation Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>water bath</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltic pump</td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>circulation thermostat</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fine scales</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chner funnel</td><td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic funnel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>silicone tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cannulae with olive tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass dish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scalpel</td><td>Feather</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Optic Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell lifter</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical Drape</td><td>Charit&amp;eacute; Universit&amp;auml;tsmedizin Berlin</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>compress</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>sterile surgical gloves</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>Tissue glue</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>glass bottle</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Separating Solution</td><td>Biochrom</td><td>L6145</td><td>Density 1.124 g/ml</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>without Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&amp;nbsp;</td><td>13CKP151&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49,361,000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media Equipment&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution 1&amp;nbsp;M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>without L-Glutamine</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4%</td></tr><tr><td>William&amp;rsquo;s E&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>with GlutaMAX&amp;trade;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>Human-Insulin</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-Acetyl cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment for Immunostainings&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R&amp;amp;D Systems, USA</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>polyclonal</td></tr><tr><td>CK18</td><td>Santa Cruz</td><td>K2105</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG1-PE</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 4%</td><td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells

肝実質細胞のほかに、肝臓は非実質細胞（NPC）、すなわちクッパー細胞（KC）、肝臓内皮細胞（LEC）と肝星細胞（HSC）で構成されています。初代ヒト肝細胞（PHH）の二次元（2D）培養物は、依然として薬物代謝および肝毒性のin vitro試験のための「ゴールドスタンダード」とみなされます。それはPHHの2D単作が脱分化と機能の損失に苦しんでいることはよく知られています。最近、肝NPCは、肝臓（病態）生理学およびPHH機能の維持に中心的な役割を果たしていることが示されました。現在の研究は、2Dの単一栽培の限界を克服するための3D-と共培養モデルによるインビボ組織構造の再構築に焦点を当てています。以前に我々は、ヒト肝細胞を単離する方法を公開し、実験生物学および医学1における細胞培養での使用のために、これらの細胞の適合性を調べました。このテにおいて幅広い関心に基づいて、この記事の目的をchniqueすることは、この手法を簡単に再現できるようになります、ビデオ、などの肝細胞の単離プロセスのためのより詳細なプロトコルを提供することでした。 ヒト肝細胞は、二段階EGTA /コラゲナーゼP灌流技術により外科的介入のヒト肝組織サンプルから単離しました。 PHHは、50×gで最初の遠心分離によってNPCから分離しました。密度勾配遠心分離工程は、死細胞の除去のために使用しました。個々の肝細胞集団は、特定の細胞の性質、細胞選別手順を使用して濃縮されたNPCの画分から単離しました。 PHH分離のほかに、私たちはさらなる培養のためのKC、LECとHSCを分離することができました。 まとめると、提示されたプロトコルは、1つのドナー組織サンプルから高品質と量のPHHとNPCの単離を可能にします。精製された肝細胞集団へのアクセスは、人間の李のようなin vivoでの作成 ​​が可能性があります版モデル。

接着特性およびMACSの使用と組み合わせクリーンアップ手順として密度勾配遠心分離を用いて実質および非実質画分への分離は、成功したPHHとNPCの分離につながります。 PHHとNPCは、高品質と量で単離することができる。 図1は、肝灌流および消化のための機器の代表的なセットアップを示しています。プロテアーゼのタンパク質分解活性を減少させるため?...

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Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

protocol-for-isolation-primary-human-hepatocytes-corresponding-major

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

36.9K ビュー.  Charité University Medicine Berlin. A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

ビデオ: Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

発生生物学

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

免疫・感染学

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally infected chimpanzees, most in vitro models require several hundreds to thousands of viral genomes per cell in order to initiate a transient infection. Additionally, static 2D cultures of primary human hepatocytes (PHH) allow only short-term studies due to their rapid dedifferentiation. Here, we describe 3D liver-on-a-chip cultures of PHH, either in monocultures or in cocultures with other nonparenchymal liver-resident cells. These offer a significant improvement to studying long-term HBV infections with physiological host cell responses. In addition to facilitating drug efficacy studies, toxicological analysis, and investigations into pathogenesis, these microfluidic culture systems enable the evaluation of curative therapies for HBV infection aimed at eliminating covalently closed, circular (ccc)DNA. This presented method describes the set-up of PHH monocultures and PHH/Kupffer cell co-cultures, their infection with purified HBV, and the analysis of host responses. This method is particularly applicable to the evaluation of long-term effects of HBV infection, treatment combinations, and pathogenesis.

The goal of this protocol is to provide a step-by-step guide to perform 3-D &#34;liver-on-a-chip&#34; infection experiments with the hepatitis B virus.

初代肝細胞とクッパー細胞 B 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

生物学

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

生物工学

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

医学

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

多パラメータ灌流制御による原発性ラット肝細胞の単離

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

要約

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この動画の章

新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

初代肝細胞とクッパー細胞 B 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化

ラット肝細胞の単離及び初代培養

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリマウス肝細胞の分離

二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離

マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善

多パラメータ灌流制御による原発性ラット肝細胞の単離

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非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリマウス肝細胞の分離