Name: orthotopic implantation and peripheral immune cell monitoring in the ii-45 syngeneic rat mesothelioma model
Uploaded: 2015-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model at JoVE.com

The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.

動物に関わるすべての手順は、科学的な目的のための動物の管理と使用に関する実践オーストラリアの規範の勧告に従って実施しました。この研究のためのプロトコルは、ロイヤル・ノースショア病院動物実験倫理委員会によって承認されました。女性のフィッシャー344ラット（F344、150〜200グラム）を標準条件（12時間の明/暗サイクルと食料と水を自由に）下カーンズ施設、Kolling研究所で維持しました。 注：すべての実験手順のフローチャートを図1に示されています。 移植用の細胞の調製<ol><li> RPMI 1640（RPMI）培地は、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充し、標準的な条件で増殖（37°、培養（クロシドライトアスベストの腹膜導入することによって誘導される、またIL-45としても知られる）は、ラット中皮腫II-45細胞株を5％CO 2でC加湿インキュベーター）。 Mainta75cm 2のフラスコに週二回、約1時50分で継代およびサブ培養することによってインチ</li><li> 37℃で細胞培養と暖かいアリコートための試薬を準備します。必要な試薬は、10％のFBS、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）および0.5％トリプシン-EDTAを用いて無血清RPMI培地（SFM）、RPMIが含まれます。 </li><li>約70〜80％コンフルエンスに移植のための培養細胞。これは、線形成長段階にある保証します。 </li><li> 、培地を捨て、滅菌PBS 5mlで1回洗浄した後、3 mlの0.5％のトリプシン-EDTAを添加することにより、収穫細胞。 </li><li>すべての細胞が非接着性になるまで約5分間インキュベーターにフラスコを返します。 </li><li>細胞は非付着したら、トリプシンを不活性化するために10％FBSを含むRPMIの3ミリリットルを追加します。 3分間300×gで細胞を収集し、遠心します。 </li><li> 3分間300×gで再びSFMと遠心の10mlに細胞ペレットを洗浄します。 </li><li>上記のようにSFMと遠心の10mlで再び洗浄細胞ペレット。 </li><li> SFM 10mlに細胞を再懸濁し、血球計または類似の機器を用いて細胞数を実行します。 </li><li> 100μlを注入する細胞の量を含むように細胞を希釈します。 注：腫瘍の成長は、100μlの100個の細胞という低用量で実証されているが、標準用量は100μl中500,000個の細胞です。 </li><li>プライミングおよび針のデッドボリュームによる損失を補償するために余分に移植されるように、ラットの数（ すなわち、100μL/ラット）、プラス少なくとも0.5ミリリットルのメディアで十分な細胞を準備します。 </li><li>余分なコントロールラット（ すなわち、100μL/ラット）、プラス少なくとも0.5ミリリットルに移植する（細胞なし）十分なSFMを準備します。 注：細胞とSFMが今移植のための準備ができています。彼らは、37 O℃に維持し、生存を維持するために、収穫の2時間内に移植されるべきです。 </li></ol>細胞の生体移植2.<ol><li>誘導室へのF344ラット（&gt; 13週齢）を配置し、1.4％イソフルラン吸入（または施設で使用されている方法）を使用して麻酔。ラットは（流れて1.4％イソフルランで）ノーズコーンに室から眠って動きそれであることが表示されたら、（腹ビュー）を上に向け、胸と背中の上に置きます。これは、内部​​の臓器が胸腔から離れて決済することができます。ラットが完全に麻酔をかけていることを確認するために制度的プロトコルに従って反射神経をチェックしてください。 </li><li>毛皮を除去する権利レジオの肋骨（胸）の領域を剃ります。 </li><li> 80％（v / v）のエタノールで剃っエリアを清掃してください。 </li><li>注射部位を特定します。右側に、頭蓋を開始する2番目の腺を見つけます。注射部位は、胸郭の尾の端から3番目と4番目の肋骨の間に、この0.5〜センチ近位です。 （ 図2A）。 </li><li>静かに再懸濁し、II-45細胞を混ぜます。ゆっくりと1 mlの＆に（対照ラットまたはSFM）細胞懸濁液を描きます＃160;取り付けられた針のない注射器。針が細胞の描画アップに接続されている場合は、細胞が、針注入ラインに沿って成長するための可能性があります。 23Gのx 1.25針を取り付けます。プライム針と任意の気泡を除去。 </li><li>注射器と針がプライミングされると、針軸の上に長さ20mmと直径5mmのスペーサーを配置します。これは、注入中の胸腔内に深く浸透する針を防ぐために使用されます。露出した針の約5mm、12 mmの任意の器官に損傷を与えることなく、リブを貫通するのに十分です。 </li><li>ゆっくりと、リブの間に針を挿入して血管が（何の血液が注射器に表示されないはずです）、その後、100μlの細胞やSFMを注入パンクチャーされていない保証するために、注射器に戻って描画します。 （ 図2B）。 </li><li>針を外し、ゆっくりと胸腔内のセルを広めるために左右にラットをロールバックします。 </li><li>ケージにラットを置き、回復のために確認してください。目Eラットは、1分以内に起きてもよく、周りに移動を開始する必要があります。 </li><li>新しい針を用いて各ラットについて、この手順を繰り返します。同じ針を再利用すると、針の注入ラインに沿って細胞の成長になります。 </li><li>毎日の動物の幸福を監視します。 </li><li>制度的動物倫理委員会によって支配されるよう倫理的に定義されたエンドポイントで、動物を安楽死させます。これらの実験におけるラットについての倫理的エンドポイントは、10％以上、又は呼吸困難の体重減少でした。 </li></ol> 3.尾静脈採血<ol><li>血液はすぐに後細胞移植を収集する場合は、麻酔したラットを保ちます。別の時点で血液をサンプリングした場合、1.4％イソフルラン吸入を用いてラットを麻酔。ラットが完全に麻酔をかけていることを確認するために制度的プロトコルに従って反射神経をチェックしてください。 </li><li>その側にラットを置き、外側尾静脈を探します。 </li><li> 80％エタノールで尾部を消毒し、0.5 mlのEDTA cをラベル付けollectionチューブ。 </li><li>血液を収集するには、常に（沿った道の約3分の1）、尾の尾方端から始まります。これは最初の試みが失敗した場合の尾の頭蓋最後にさらに試み近づくことができます。これは血液凝固を引き起こすことができるように尾側にリサンプリングすることはありません。 </li><li>横静脈に23Gのx 1.25針を平行に配置し、それが約10mm（ 図3A）を貫通するように浅い角度で静脈の中にスライドさせます。 </li><li>注意：静脈が正常にパンクしてきた場合、血液が針（ 図3B）の取り付け端に表示されます。 </li><li>一滴の血液は、針穿刺部位の尾に形成することになります。ラベル0.5ミリリットル（以下）のEDTA収集チューブにピペットと転送を使用して、この血液を収集します。免疫細胞アッセイ25μlのに十分です。出血が止まるまでサイトを穿刺する圧力とガーゼを適用します。 </li><li> PRするために、血液およびEDTAを混合するために血液チューブをフリックイベント凝固。採血と血液凝固を防ぐためにできる限り短く、EDTAと混合の間の時間をおいてください。 </li><li>複数のラットから血液を収集する場合、分析まで室温でラックにEDTA-血液サンプルを保存します。コレクションの2時間内のプロセスの血液。 </li></ol>ビーズベースの方法を使用した免疫細胞のプロファイリング4.サンプル調製注：この単一プラットフォーム方法は、各サンプルのビーズの既知の数を持っている市販の絶対計数管を使用することに依存しています。これらの管は、ビーズを放出する、サンプル調製中に溶解し、凍結乾燥ペレットを含みます。ビーズは、蛍光標識されたビーズ集団に対してゲーティングすることによって、絶対数を算出することができます。 <ol><li> EDTA全血試料は、数分間ゆっくりとロータリーミキサー上に配置することにより十分に混合することを確認します。各サンプルごとに1絶対計数管にラベルを付けます。ビーズを含むペレットは、Tの下に表示されるはずですチューブの底にある彼は、金属製のビーズホルダー。 </li><li>ラベル絶対計数管にEDTA全血25μlのを転送します。ビーズペレットは、血液の添加時に溶解します。 </li><li>各チューブに抗ラットT / B /ナチュラルキラー（NK）細胞カクテル20μlの、抗ラットCD8a PE10μlの、抗ラットCD4（ドメイン1）FITC及び抗ラット10μlの10μlのを追加CD45 PE / Cy7の（ 図4A）。フルオロフォアは 、表1に定義されています。 </li><li>抗体および細胞がチューブの底にあり、チューブの側面に貼り付けていない確実にするために遠心チューブに簡単に（300 XG）。渦は、混合し、室温で15分間インキュベートします。 </li><li>赤血球を溶解するには、10 mMトリス、0.15Mの塩化アンモニウム緩衝液（pH 7.5）と混合する渦の400μlを添加します。サンプルは半透明で曇りのない（ 図4BおよびC）が表示されたときに溶解は完了です。サンプルを溶解しないと、完全な増加につながりますDの背景とフローサイトメトリーで分析するときに誤ってカウントを上昇。 </li></ol>サンプルの5フローサイトメトリーの処理注意：フローサイトメーター4色に実行します。 <ol><li>取得モードと、図5に示すように8プロットで新しいテンプレートのソフトウェアを開きます。 </li><li>表1に記載されているものに機器の設定を調整し、蛍光ビーズをカウントするゲートR1（APC [FL-4] 対 FITC [FL-1]）、 図5Ai）を設定 。他のゲートは、この買収段階で同様に重要ではありませんが、分析のために必要とされます。このプロトコルで使用される絶対計数ビーズは蛍光色素を含み、青のチャネルで最も弱いもののいずれかのチャネルで検出することができます。 </li><li>調製した対照血液サンプル、渦を使用して、フローサイトメーター上にロードして、データ収集ゲートを調整することができるので、セットアップモードの低速（12μL/分）で動作します。 </li><li>買収に設定しますR1ビーズゲート10,000イベントを収集。 </li><li>データを記録するフォルダを設定し、取得メニューのファイル番号とラベルサンプルファイルを設定します。 </li><li>サイトメーター上で分析されるべきサンプルをロードし、メディアに流量を設定します（35μL/分）。同じ流速で各サンプルを実行します。流量が低い（12μL/分）または高（60μL/分）に変化させることが必要になることがありますが、中には、一般的に適切です。このレートでは、各サンプルを10,000ビーズイベントを取得するために、約90〜120秒かかります。 </li><li>サンプルがロードされるとすると、必ずイベントをR1ビーズゲートに登場されていることを確認するために散布図を見ます。最初は散布図にドリフトを引き起こすサンプル圧力のいくつかの不安定性がある場合もあります。これが安定するのを待ちます。 </li><li>安定したら、取得をクリックして、サンプルを実行することができます。サイトメーターサイトメーターを取得停止し、すべてのデータが保存され、R1 10,000ビーズイベントを取得完了したら。 </li><li>サンプルを削除し、TUを流す捨てますこと。サイトメーターは現在、次のサンプルの準備ができています。すべてのサンプルを実行してから、分析モードに進みます。 </li></ol>前記免疫細胞分析注：ゲーティング戦略とブール代数は、各細胞集団を定義するために使用されます。ブール代数は、単一の定義に複数の操作を可能にするロジックベースの分析方法です。フローサイトメーター（例えば、BD CellQuestソフト）の解析ソフトウェアは、ブール代数の使用を可能にします。方程式は、より具体的に各細胞集団を同定するために、セルを定義するのに役立つ重要な負の反応のために積極的に考慮するために使用されます。 「領域」は「ゲート」を定義するために使用されます。 （ - 、 表2に定義された+、*、）ゲートは代数演算子で接続多数の領域から構成することができ、一方の領域は、2次元空間を定義します。 <ol><li>分析モードにソフトウェアを切り替えます。分析テンプレートが一致するように生成されるべきです<strオング&gt;プロットとゲートを有する図5に示します。 </li><li>個別に個々のファイル（ すなわち、それぞれの個々のサンプル）を分析します。 表2で定義されるように設定し、ゲートR1 R9を介して、その後に（また、図5に示されている）は、各細胞型のためのアルゴリズムを設定します。 </li><li>ゲートとアルゴリズム（ 表2および図5）で定義された個々の細胞集団を計算するために、セルの統計カウンタを使用してください。アルゴリズムは、セル統計カウンタに自動的に細胞数を調整します。 </li><li>以下の式を使用して、細胞サブセットを計算します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53019/53019eq1.jpg" /> 注：細胞計数事象の数（例えば、CD4 T細胞のイベント）は、血液1μl当たりの細胞数を得るために上記の式を使用して列挙されています。例としては、 図5に示されています。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

本論文では、胸膜中皮腫のラット同系同所モデルと縦採血を介して疾患の進行をモニタリングするための簡単​​な方法を生成するための方法を詳述します。 II-45モデルは、アスベスト繊維13にフィッシャー344ラットを暴露することによって開発されました。この暴露は、中皮腫の病因のためのホスト - アスベストの免疫系の相互作用の真のダイナミクスを表し?...

悪性中皮腫（MM）は、膜（中皮）で形質転換された細胞から生じる攻撃的な悪性腫瘍であることライン肺や腹腔、心と内部生殖器官、および肺の空洞または胸膜1,2の最も一般的な原発腫瘍であります。アスベスト繊維への暴露は、全てのMMの80％を占め、およびアスベスト使用の禁止は、ほとんどの西洋諸国で数十年前に導入された一方で、地域社会での広範な使用は、致命的な遺産を残しています。世界保健機関（WHO）は、107,000人が世界的に死亡率が増加し続けると、アスベスト関連疾患から毎年死亡していると推定しています。新しい非職業入射波も浮上している、これは3のピークを迎えたとき、どのようなレベルでのほとんど理解があります。 全身化学療法が唯一の現実的な選択肢4のいずれかを表したとき、MMを持つ人々の大多数は遅く診断されています。最もeffecti化学療法と（シスプラチン5とともにペメトレキセド）現在の「標準治療」をVEのは、10年以上前に同定されました。しかし、この治療の失敗は避けられないと何の実績のある二行目のオプションは、12ヶ月の2の厳しい予後や生存期間の中央値の患者を残して、ありません。したがって、より効果的な治療が緊急に満たされていない必要性が存在します。臨床試験なしでの新しい治療法の数の検査にもかかわらず、実際に変化をもたらしました。これは、一般に、臨床的設定6-8に、異種移植マウスモデルにおいて行わ前臨床結果の低い（5％）転移に一部起因します。このようなモデルを忠実にしばしば機能する免疫系9の非存在下で、非生理的な場所で発生する腫瘍微小環境の複雑な側面を再現しません。 同系同所モデルはCよりもかなり現実的な腫瘍環境を作成します腫瘍が無傷の免疫系10,11で正しい生理場所で起こるようommonly皮下異種移植モデルを使用していました。ラットの大きなサイズは、特にシリアル血液は治療応答および毒性12を評価するために必要とされる描画薬物研究において、齧歯類疾患モデルとしての使用を強化します。さらに、疾患の進行をモニタリングすることにより（例えば、胸腔のように）腫瘍の場所に困難であるモデルにおいて、循環中に見出さ因子を用いて疾患の進行をモニターする能力は、非常に魅力的です。免疫コンピテントラットを用いた胸膜中皮腫の同系同所性モデルの生成について説明します。加えて、循環する免疫細胞を測定することにより、胸膜疾患の進行をモニタリングするための簡単​​で、比較的非侵襲性の方法も記載されています。

<table><tbody><tr><td>EDTA Collection tube (0.5 ml)</td><td>Greiner Bio One GmbH</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Rat T/B/NK Cell cocktail</td><td>BD Pharmingen</td><td>558509</td><td>anti-Rat CD3&amp;nbsp; APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)</td></tr><tr><td>anti-RAT CD8a PE&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>200608</td><td>(IgG1vClone G28)</td></tr><tr><td>anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>203406</td><td>(IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; Clone OX-38)</td></tr><tr><td>anti-Rat CD45 PE/Cy7&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>202214</td><td>(IgG&lt;sub&gt;1 &lt;/sub&gt;Clone OX-1)</td></tr><tr><td>TruCount Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>340334</td><td>Box of 50 absolute counting tubes</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>foetal bovine serum (FBS)</td><td>Scientifix</td><td>FBS500-S (lot# 010101-1)</td><td></td></tr><tr><td>trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Medicago AB</td><td>09-9400-100</td><td></td></tr><tr><td>23Gx1&amp;frac14; Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>302 100</td><td></td></tr><tr><td>Fischer 344 Rat</td><td>Animal Resources Centre, Perth Australia</td><td>F344</td><td></td></tr><tr><td>I.S.O (Isoflurane USP)</td><td>Veterinary Companys Australia (VCA)&amp;nbsp;</td><td>B7058</td><td></td></tr><tr><td>II-45 Rat Mesothelioma line</td><td>Zurich University</td><td></td><td>Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC</td></tr><tr><td>FACSCalibur 4 color</td><td>Becton Dickinson</td><td>342975</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCL</td><td>SIGMA</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride</td><td>SIGMA</td><td>9718</td><td></td></tr><tr><td>Anaesthetic Machine (The stinger)</td><td>Advanced Anaesthesia specialists</td><td>#00449</td><td></td></tr></tbody></table>

orthotopic implantation and peripheral immune cell monitoring in the ii-45 syngeneic rat mesothelioma model

このようなワクチンおよび免疫チェックポイント阻害剤として癌の免疫ベースの治療に関心の巨大な盛り上がり、一括前臨床試験のための免疫適格同所モデルの必要性を指し、治療応答における腫瘍微小環境の役割の理解を増加これらの新しい治療法の。本論文では、胸膜悪性中皮腫の同所性免疫能のラットモデルを確立する方法を示しています。同所性モデルで監視疾患の進行は、腫瘍の内部の位置によって混乱されます。縦方向に疾患の進行およびこれと他の癌のラットモデルにおける免疫細胞の循環に及ぼす影響を監視するために、単一のチューブは、全血が記載されているだけで25μLを必要とするフローサイトメトリーアッセイ。総リンパ球、単球および好中球、ならびにT細胞サブセット、CD4およびCD8、B細胞およびナチュラルキラー細胞：これは7免疫パラメータの正確な定量化を提供します。別の潜水艦これらのパラメータのETSは、中皮腫モデルにおける疾患の進行をモニタリングするための最大の有用性を有するリンパ球の比率に好中球で、異なる状況やモデルにも有用です。この単一チューブ法を用いて、免疫細胞の循環レベルの分析はまた、免疫系の治療に対する応答をモニターし、治療の成功または失敗を引き起こす根底にあるメカニズムを理解することを助けることができます。

II-45細胞を用いた胸膜中皮腫の同所性モデルを生成するために、本論文で使用した方法には、ラットは、注入法のために死んでいないで、再現性と迅速な時間枠内で中皮腫に屈した動物をもたらしました。 1×10 3個の細胞が完全に浸透モデル（100％生着）に必要な最小数であると判断した移植細胞の数の滴定。ラットに移植された細胞の異なる数は、疾患の重症度に影響を与えるよう...

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II-45 同系ラット中皮腫モデルにおける同所性移植と末梢免疫細胞モニタリング |医学 |ビデオ

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

免疫適格ラットの胸膜腔にII-45中皮腫細胞の移植による胸膜悪性中皮腫の同所性ラットモデルの生成が示されています。 25μlの血液試料から、これらの動物において7の免疫細胞サブセットを分析するためのフローサイトメトリー方法も記載されています。

II-45同系ラット中皮腫モデルにおける同所移植と末梢免疫細胞の監視

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

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9.1K ビュー.  Royal North Shore Hospital, University of Sydney. 免疫適格ラットの胸膜腔にII-45中皮腫細胞の移植による胸膜悪性中皮腫の同所性ラットモデルの生成が示されています。 25μlの血液試料から、これらの動物において7の免疫細胞サブセットを分析するためのフローサイトメトリー方法も記載されています。 

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Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

エンジニア心臓組織の移植後免疫反応の評価（EHT）のための生物発光イメージング

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

生物工学

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all gynecologic malignancies among US women 1,2,3. Serous tumors are the most widespread forms of ovarian cancer and 4,5 the Tg-MISIIR-TAg transgenic represents the only mouse model that spontaneously develops this type of tumors. Tg-MISIIR-TAg mice express SV40 transforming region under control of the Mullerian Inhibitory Substance type II Receptor (MISIIR) gene promoter 6. Additional transgenic lines have been identified that express the SV40 TAg transgene, but do not develop ovarian tumors. Non-tumor prone mice exhibit typical lifespan for C57Bl/6 mice and are fertile. These mice can be used as syngeneic allograft recipients for tumor cells isolated from Tg-MISIIR-TAg-DR26 mice.
Objective: Although tumor imaging is possible 7, early detection of deep tumors is challenging in small living animals. To enable preclinical studies in an immunologically intact animal model for serous ovarian cancer, we describe a syngeneic mouse model for this type of ovarian cancer that permits in vivo imaging, studies of the tumor microenvironment and tumor immune responses.
Methods: We first derived a TAg+ mouse cancer cell line (MOV1) from a spontaneous ovarian tumor harvested in a 26 week-old DR26 Tg-MISIIR-TAg female. Then, we stably transduced MOV1 cells with TurboFP635 Lentivirus mammalian vector that encodes Katushka, a far-red mutant of the red fluorescent protein from sea anemone Entacmaea quadricolor with excitation/emission maxima at 588/635 nm 8,9,10. We orthotopically implanted MOV1Kat in the ovary 11,12,13,14 of non-tumor prone Tg-MISIIR-TAg female mice. Tumor progression was followed by in vivo optical imaging and tumor microenvironment was analyzed by immunohistochemistry.
Results: Orthotopically implanted MOV1Kat cells developed serous ovarian tumors. MOV1Kat tumors could be visualized by in vivo imaging up to three weeks after implantation (fig. 1) and were infiltrated with leukocytes, as observed in human ovarian cancers 15 (fig. 2).
Conclusions: We describe an orthotopic model of ovarian cancer suitable for in vivo imaging of early tumors due to the high pH-stability and photostability of Katushka in deep tissues. We propose the use of this novel syngeneic model of serous ovarian cancer for in vivo imaging studies and monitoring of tumor immune responses and immunotherapies.

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

To study in vivo tumor growth and tumor microenvironment, we used a syngeneic and orthotopic mouse model of ovarian cancer in immunocompetent animals. We transduced a mouse tumor cell line (MOV1) with Katushka fluorescent protein (MOV1KAT) and here we show its orthotopic implantation in ovary and in vivo imaging.

のための免疫担当マウスにおける漿液性卵巣癌の同所性モデル in vivoで</em腫瘍免疫応答の>腫瘍イメージングとモニタリング

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

免疫・感染学

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without the ability to target a specific or well-delineated tumor volume. The delivery of radiation was achieved using fixed radiation sources or linear accelerators producing megavoltage (MV) X-rays. These devices are unable to achieve sub-millimeter precision required for small animals. Furthermore, the high doses delivered to healthy surrounding tissue hamper response assessment. To increase the translation between small animal studies and humans, our goal was to mimic the treatment of human glioblastoma in a rat model. To enable a more accurate irradiation in a preclinical setting, recently, precision image-guided small animal radiation research platforms were developed. Similar to human planning systems, treatment planning on these micro-irradiators is based on computed tomography (CT). However, low soft-tissue contrast on CT makes it very challenging to localize targets in certain tissues, such as the brain. Therefore, incorporating magnetic resonance imaging (MRI), which has excellent soft-tissue contrast compared to CT, would enable a more precise delineation of the target for irradiation. In the last decade also biological imaging techniques, such as positron emission tomography (PET) gained interest for radiation therapy treatment guidance. PET enables the visualization of e.g., glucose consumption, amino-acid transport, or hypoxia, present in the tumor. Targeting those highly proliferative or radio-resistant parts of the tumor with a higher dose could give a survival benefit. This hypothesis led to the introduction of the biological tumor volume (BTV), besides the conventional gross target volume (GTV), clinical target volume (CTV), and planned target volume (PTV).
At the preclinical imaging lab of Ghent University, a micro-irradiator, a small animal PET, and a 7 T small animal MRI are available. The goal was to incorporate MRI-guided irradiation and PET-guided sub-volume boosting in a glioblastoma rat model.

In the past, small animal irradiation was usually performed without the ability to target a well-delineated tumor volume. The goal was to mimic the treatment of human glioblastoma in rats. Using a small animal irradiation platform, we performed MRI-guided 3D conformal irradiation with PET-based sub-volume boosting in a preclinical setting.

PET や MRI 誘導照射ラットの神経膠芽腫モデルのマイクロ照射器を使用して

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

がん研究

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, including genetically engineered models as well as transplantation models. However, genetically engineered mouse models are time-consuming and expensive, whereas some orthotopic transplantation models are difficult to reproduce. Here, a non-invasive intratracheal delivery method of lung tumor cells as an alternative orthotopic transplantation model is described. The use of mouse lung adenocarcinoma cells and syngeneic graft recipients allows studying tumorigenesis under the presence of a fully active immune system. Furthermore, genetic manipulations of tumor cells before transplantation makes this model an attractive time-saving approach to study the impact of genetic factors on tumor growth and tumor cell gene expression profiles under physiological conditions. Using this model, we show that lung adenocarcinoma cells express increased levels of the T-cell suppressor programmed death-ligand 1 (PD-L1) when grown in their natural environment as compared to cultivation in vitro.

Here we describe a minimally invasive syngeneic orthotopic transplantation model of mouse lung adenocarcinoma cells as a time- and cost-reducing model to study non-small cell lung cancer.

PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop better therapeutic strategies, understanding tumor microenvironmental factors that contribute to the treatment resistance is important. A major impediment to understanding disease mechanisms and improving therapy has been a lack of murine cell lines that resemble the aggressive and metastatic nature of human HNSCCs. Furthermore, a majority of murine models employ subcutaneous implantations of tumors which lack important physiological features of the head and neck region, including high vascular density, extensive lymphatic vasculature, and resident mucosal flora. The purpose of this study is to develop and characterize an orthotopic model of HNSCC. We employ two genetically distinct murine cell lines and established tumors in the buccal mucosa of mice. We optimize collagenase-based tumor digestion methods for the optimal recovery of single cells from established tumors. The data presented here show that mice develop highly vascularized tumors that metastasize to regional lymph nodes. Single-cell multiparametric mass cytometry analysis shows the presence of diverse immune populations with myeloid cells representing the majority of all immune cells. The model proposed in this study has applications in cancer biology, tumor immunology, and preclinical development of novel therapeutics. The resemblance of the orthotopic model to clinical features of human disease will provide a tool for enhanced translation and improved patient outcomes.

Here we present a reproducible method for developing an orthotopic murine model of head and neck squamous cell carcinoma. Tumors demonstrate clinically relevant histopathological features of the disease, including necrosis, poor differentiation, nodal metastases, and immune infiltration. Tumor-bearing mice develop clinically relevant symptoms including dysphagia, jaw displacement, and weight loss.

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival compared to surgery alone. To address this problem, the aim of the study is to refine a lesser-known model of OS in rats with a comprehensive histologic, imaging, biologic, implantation, and amputation surgical approach that prolongs survival. We used an immunocompetent, outbred Sprague-Dawley (SD), syngeneic rat model with implanted UMR106 OS cell line (originating from a SD rat) with orthotopic tibial tumor implants into 3-week-old male and female rats to model pediatric OS. We found that rats develop reproducible primary and metastatic pulmonary tumors, and that limb amputations at 3 weeks post implantation significantly reduce the incidence of pulmonary metastasis and prevent unexpected deaths. Histologically, the primary and metastatic OSs in rats were very similar to human OS. Using immunohistochemistry methods, the study shows that rat OS are infiltrated with macrophages and T cells. A protein expression survey of OS cells reveals that these tumors express ErbB family kinases. Since these kinases are also highly expressed in most human OSs, this rat model could be used to test ErbB pathway inhibitors for therapy.

Here, a syngeneic orthotopic implantation followed by an amputation procedure of the osteosarcoma with spontaneous pulmonary metastasis that can be used for preclinical investigation of metastasis biology and development of novel therapeutics is described.

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and has no cure. Laser interstitial thermal therapy (LITT) is a Food and Drug Administration (FDA)-approved treatment for GB and is used in patients who may not be candidates for conventional surgical resection. While the clinical efficacy of LITT has been established, research beyond clinical case studies and case series is limited and hindered by the lack of an established animal model. This protocol uses C57BL/6 mice and syngeneic CT2A glioma cancer cell line to closely recapitulate human GB&#160;while also using a 1064 nm Neodymium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Nd:YAG) laser, such as is used in one of the two FDA-approved LITT systems, providing excellent pre-clinical relevance. The successful establishment of this LITT murine model will provide a valuable platform for investigating the unique features of LITT ablation and its effects on the tumor microenvironment, potentially leading to improved therapeutic strategies.

Glioblastoma is a devastating form of primary brain cancer, and laser interstitial thermal therapy is emerging as a promising alternative to conventional surgical resection for inoperable glioblastoma. This protocol describes an optimized pre-clinical mouse model that can be used to study treatment effects or adjuvant and combinatorial treatments.

神経膠芽腫のレーザー間質性温熱療法のための免疫適格マウスモデル

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

ラット間膜の血管新生アッセイ

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

生物学

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. MPM development is mainly associated with asbestos. Treatments provide only modest survival since the median survival average is 9&#8211;18 months from the time of diagnosis. Therefore, more effective treatments must be identified. Most data describing new therapeutic targets were obtained from in vitro experiments and need to be validated in reliable in vivo preclinical models. This article describes one such reliable MPM orthotopic model obtained after injection of a human MPM cell line H2052/484 into the pleural cavity of immunodeficient athymic mice. Transplantation in the orthotopic site allows studying the progression of tumor in the natural in vivo environment. Positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) molecular imaging using the clinical [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18F]FDG) radiotracer is the diagnosis method of choice for examining patients with MPM. Accordingly, [18F]FDG-PET/CT was used to longitudinally monitor the disease progression of the H2052/484 orthotopic model. This technique has a high 3R potential (Reduce the number of animals, Refine to lessen pain and discomfort, and Replace animal experimentation with alternatives) since the tumor development can be monitored non-invasively and the number of animals required could be significantly reduced.
This model displays a high development rate, a rapid tumor growth, is cost-efficient and allows for rapid clinical translation. By using this orthotopic xenograft MPM model, researchers can assess biological responses of a reliable MPM model following therapeutic interventions.

This article describes the generation of an orthotopic mouse model of human pleural mesothelioma by implantation of H2052/484 mesothelioma cells into the pleural cavity of immunocompromised athymic mice. The longitudinal monitoring of the development of intrapleural tumors was assessed by non-invasive multimodal [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography imaging.

アチミックマウスにおけるヒト胸膜中皮腫の正形細胞モデルのPET/CTによる移植とモニタリング

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...