The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

高分子水性二相系の調製（ATPS） <ol><li>ポリエチレングリコール（PEG）（MW：35000）を0.5g秤量し、水性PEG相（w / v）の5％を10ml調製するための無菌の15mlの円錐形に完全増殖培地9.5 mlに追加します。 注：最初のポリマーを添加した後、培地の残量が円錐形の壁へのポリマーの付着を最小限にし、ポリマーがより速く溶解するのに役立ち、続いて円錐形に培地の半分を加える。 </li><li>デキストラン（DEX）の0.128グラム（MW：500,000）計量し、12.8％（w / v）の水DEX相から1ミリリットルを準備し、滅菌1.5ミリリットルのマイクロチューブに完全増殖培地の0.872ミリリットルに追加します。 </li><li>約1分間ボルテックス両方のソリューションは、媒体中にポリマーを溶解した。 </li><li>溶解および均質の混合物を確保するために、1時間37℃の水浴中で両溶液を保つ。浴からの溶液の汚染の可能性を回避するために、水位上記キャップを保つ水。 </li><li>無菌のプラスチック製シリンジにPEG相溶液を充填し、不純物を除去するために0.2μmの孔径のシリンジフィルターを介して通過する。 注：、PEG溶液を注射器を埋める円錐管の上にフィルタの挿入に入れて力を利用して、ゆっくりとフィルターを通してソリューションを押してください。これは、シリンジプランジャの移動​​に対する抵抗を経験することは正常です。解決策のいくつかは、フィルタに残るようにポリマー溶液のマイナー損失が発生しますが、ポリマー濃度は変化しません。 </li><li>ピペット10 DEX相溶液μlの別のチューブに培地10μl中に希釈は、6.4％（w / v）のDEX相溶液を生じた。 PEG相溶液を吸引し、100μlのペトリ皿にそれを分配する。 <ol><li> PEG相溶液中にDEX相溶液（w / v）の6.4％の0.5μLを分注する。顕微鏡下で視覚的にDEXの低下を観察することによって成功したATPSの形成を確認。ドロップ境界二つの安定、独立した水相の存在を示す、表示されたままにする必要があります。 </li></ol></li><li>使用するまで4℃で株式水性PEGとDEX相溶液を保管してください。 注：これは、ポリマー溶液が各実験の前に新たに調製し、貯蔵の24時間以内に使用されていることをお勧めします。 </li></ol>印刷癌の細胞スフェロイド2.準備<ol><li> 90％-100％のコンフルエントな単層への関心（ 例えば、MDA-MB-157乳癌細胞）の癌細胞を成長させる。 MDA-MB-157細胞では、10％FBS、1％グルタミン、および1％抗生物質を含むDMEMから構成される培地を使用する。 <ol><li> （製造業者のプロトコルに従って）細胞解離緩衝液を用いて細胞を回収し、15mlのコニカルに懸濁液を読み込む。 、173.3×gで5分間、それを遠心上清を除去し、細胞を再懸濁する完全増殖培地の1ミリリットル中。 </li></ol></li><li>ロードセル血球計数器上に、それらをカウントは、必要な数を計算する所望のスフェロイドの細胞密度の細胞。 T75フラスコで成長させたMDA-MB-157細胞のコンフルエントな単層は、通常は〜7×10 6個の細胞を提供します。 注：単一のスフェロイドを生成する液滴体積に必要な細胞密度は、細胞型に依存する。例えば22、MDA-MB-157細胞について×10 4以上1.5の密度は、0.3μlのDEX相滴あたりの推奨されるシングル回転楕円体の形成を確実に。 </li><li> 173.3×gで5分間再度遠心し、細胞および所望の細胞密度に懸濁液を濃縮するために、増殖培地の適切な容量で再懸濁します。 注：7×10 6個の癌細胞を回収した場合は、0.3μlのDEX相ドロップ1.5×10 4個の細胞密度のスフェロイドを形成するのに必要な細胞懸濁液の全体積は140μlであろう。しかし起因する次のステップでDEX相溶液で希釈し、細胞のみを再懸濁し、細胞培養培地70μlのを使用しています。 </li><li&gt; 12.8％の等量（w / v）の水性DEX相溶液を1.2に調製し、得られた細胞懸濁液に加える。 1.5×10 4細胞密度スフェロイドの例については、DEX相溶液の70μlの細胞懸濁液70μlに添加される。 </li><li>完全に細胞およびDEX溶液の混合の均一な分布を確実にするために、細胞懸濁液を混合する。ピペット上下に気泡形成を防ぐために静かに行うべきである。 </li></ol>共培養スフェロイドの印刷用3.準備<ol><li> 90％-100％コンフルエント単層に癌細胞（ 例えば、MDA-MB-157ヒト乳癌細胞）および支持細胞（ 例えば、ヒト線維芽細胞）を成長させる。 （製造業者のプロトコルに従って）細胞解離緩衝液を使用して、各細胞型を回収する。 <ol><li>各円錐から173.3×gで、かつ吸引上清で5分間、それらを遠心分離、円錐形の15ミリリットルに各サスペンションをロードします。完全なGの1ミリリットル中の各円錐形の細胞を再懸濁rowth媒体。 注：そのようなカルセインAM（生細胞染色）および核染料（ヘキスト社）のような蛍光染料は、2つの細胞型を区別するために使用することができる。 </li></ol></li><li>血球計数器上に別々に各細胞型をロードし、共培養スフェロイドにおける支持細胞に対する癌細胞の所望の比率は、各細胞型の必要数を計算するためにそれらを数える。 T75フラスコ中で増殖させたMDA-MB-157細胞および線維芽細胞のコンフルエントな単層は、通常はそれぞれ、〜7×10 6と〜6×10 6個の細胞を与える。 </li><li> 2つの細胞型の数の所望の比を与えるために、癌細胞懸濁液に支持細胞の懸濁液から正確なボリュームを追加する。例えば、1線維芽細胞に50癌細胞の比率を使用。 </li><li>遠心増殖培地の等量を含む最終濃度をもたらすのに適切な容量及び12.8％（w / v）の水性DEXで173.3×gで再懸濁した細胞で5分間混合し、細胞懸濁液を含有するコ​​ニカル（1.2で調製）相溶液。 </li><li>穏やかに懸濁液の均一性を確実にするために上下に得られた細胞懸濁液をピペット。 </li></ol> 96ウェルプレート中に腫瘍スフェロイドの4.印刷<ol><li>前の24時間、37℃で1％の実験コート非処理、丸底96ウェルプレート（w / v）のプルロニックに一日。このコーティングは、培養期間中、細胞付着を防止する。 </li><li> 96ウェルプレート（宛先プレート）の各ウェル中に濾過し、5％を50μl（w / v）の水性PEG相を分注する。 </li><li>ピペットを用いて、細胞懸濁液（それぞれ、モノ - 及び共培養のためにステップ2またはステップ3で調製）を混合し、384ウェルプレートの1列（ソースプレート）からの他のすべてのサスペンションの20μlを添加する。 </li><li>液体ハンドラと &quot;ホーム&quot;の座標を登録するペッティングヘッドをオンにします。その後、実験器具を確実にするために（4.6未満）以前に定義されたプロトコルをコンパイルし、パラメータが正しい定義されていますLY。この「ホーミング」のステップは、異なる液体ハンドラの異なる場合があります。 注：4.6のステップ·バイ·ステップを以下に示したプロトコルの流れは、関係なく、使用されるロボット液体ハンドラの同様であろう。しかし、プログラミングインターフェースは、異なるソフトウェアの使用に異なって見える場合があります。 </li><li> 図1に示すように液体ハンドラーのワークステーション上で定義された位置に、ソースプレート、目的プレート、ピペットチップボックスを配置する。 </li><li>以下のステップを含むプロトコルを実行します。 <ol><li>ロードワークステーション（ 図1）からピペットチップ（8チップ）を混合液体ハンドラのピペット操作ヘッドから樽の1列。 </li><li>ソースプレートのウェル中の細胞懸濁液（ 図1）を混ぜる。気泡形成を回避するために、ウェル中の細胞懸濁液の体積よりも小さい混合容積を選択する。 </li><li>空の廃棄物のヒントボックス（ 図1）にヒントを取り出します。 </li&gt; <li>負荷10μL分注ピペットチップとピペット操作ヘッドから樽の1列（ 図1）。 </li><li>吸引し、各ピペットチップにソースプレートからの細胞懸濁液0.3μlの（ 図1）。 </li><li>目的プレート（ 図1）の1列のウェルに細胞懸濁液を分注する。 0.5mmのディスペンス高さより小さい1μlの/秒の分注流量を使用する。 </li><li>全体目的プレートに列ごとの印刷が完了するまで繰り返します4.6.6を通じて4.6.1を繰り返します。 </li></ol></li><li>注意深くステーション表面から目的プレートを除去し、CO 2を 37℃の湿潤インキュベーターに入れ、5％。細胞を含むDEX相滴の破砕を避けるために、培養器にそれを運ぶ際にプレートを水平に維持する。 </li><li> DEX相ドロップ内の回転楕円体への細胞の凝集を可能にするために24時間静置します。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 5。癌細胞スフェロイドの薬物治療以下のプロトコルは、4日間の薬物治療のためであり、これは、他の治療期間のために修飾することができる2日後に新鮮な薬物との更新を含むことに留意されたい。 <ol><li>視覚的に24時間後に、96ウェルプレート中のスフェロイド形成を確認する。各スフェロイドの最小および最大径を平均することによりスフェロイドの大きさを測定するための、画像井戸を必要に応じて。 </li><li>所定の溶解度の濃度で製造業者によって推奨される溶媒に溶解して、所望の薬物のストック溶液を調製する。例えば、2mg / mlの水中でのシスプラチンを溶解する。 注意：薬剤が光に敏感である場合には光からの薬剤の原液を保護します。 </li><li>連続希釈法を使用して、前の工程で調製したストック溶液から細胞培養培地で希釈した薬物濃度を準備。各希釈は二回、所望の濃度なされるべきである。 DILution比は、出発ストック濃度および所望の使用濃度に依存して変化する。 </li><li>各ウェルに前工程で調製薬剤溶液50μlを追加します。これはロボットまたは手動ピペット操作によって行うことができます。 注：各薬物濃度を、各ウェルに既に50μlの水性PEG相によって所望の濃度に半分に希釈される。 <ol><li>各濃度について、96ウェルプレート（N = 16）の2つの列からのスフェロイドを使用してください。 </li><li>対照ウェルでは、水性のPEG相の既存の50μlに新鮮な培養培地のわずか50μlを添加する。 </li></ol></li><li>光から保護し、37℃で48時間、5％CO 2、薬物とスフェロイド培養する。 </li><li>インキュベーションの48時間後に、所望の濃度の薬剤の新鮮な希釈物を調製し、各ウェルに、新鮮な薬物溶液50μlを添加することにより薬物を更新する。 注意：ウェルは既に第一の薬剤tから所望の薬物濃度を含むreatment。希釈化は生じないので、したがって、この更新段階では、各濃度が所望の濃度で調製する​​。 </li><li>光から保護し、37℃でさらに48時間、薬物および5％CO 2でスフェロイド培養する。 </li></ol> 6.スフェロイドにおける細胞生存率の分析<ol><li>新たな薬剤とのインキュベーションの48時間後（ すなわち 、薬物とスフェロイドの治療の合計時間は4日間）、手動ピペッティングによりつのウェル中の培地の総体積を測定する。 注：1ウ​​ェルの典型的なボリュームが（小さな減少は蒸発により発生した）〜140μLである。 </li><li>合計ウェル体積の10％の濃度で細胞生存性試薬（ 例えば、PrestoBlue）の体積を計算する。各ウェルに細胞生存性試薬のこのボリュームを追加する。 注：ウェルの140μLの既存のメディアのボリュームでは、15.6μlのはよく全体の10％の濃度になるようにする必要があります。これは次式で計算される9（140μL/ 9 = 15.6μl）をすることで、既存のメディアボリュームを分割する。 </li><li>光から保護し、37℃で6時間、各ウェルに添加し、細胞生存性試薬でプレートをインキュベートする。 </li><li>それぞれ、マイクロプレートリーダーでプレートを置き、560 nmおよび590 nmの励起および発光波長で蛍光シグナルを読み取る。 </li><li>同一の処理条件からの値を平均化した後、対照ウェルと処理したウェルからの蛍光シグナルを正規化することによりスフェロイド中の細胞の生存率パーセントを計算する。 </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

スフェロイドは、より良い腫瘍生理学および薬効を理解し、抗癌薬の発見のための有用なツールを提供するための現実的なモデルを提示する。そのようなアプリケーションは、非常に、標準実験器具、液体ハンドリングツールおよびスクリーニング装置を必要とする単純な回転楕円体の生成および保守技術の恩恵を受ける。水性二相系ドロップ相内に自然に凝集体の癌細胞の使用は、効率的?...

細胞ベースのアッセイを開発し、新たな抗癌薬の発見のための重要なツールを提供する。1,2は、歴史的に、癌細胞の単層培養物は、癌細胞の特定の型に対する候補化合物の有効性を調査するために使用されてきた。標準培養プレートで単層培養のメンテナンスの容易さ、試薬の添加のための商業のロボットのツールを標準プレートの互換性、および化学物質に対する細胞応答の下流分析のためのスクリーニング装置では、2Dの文化に魅力的なツールをレンダリングする主要な利点があります薬物試験のために3残念ながら、単層細胞アッセイは、多くの場合、薬剤の開発及び発見非常にコストのかかる処理を行う、生体内での化合物の有効性を予測することができない。4,5製薬企業および学術単位で多大な投資と努力にもかかわらず、唯一〜1％臨床試験中の抗がん剤は、承認されたのしたがって、7。 インビボでの 2D培養癌細胞の複雑な3D環境との間の6視差が単層培養システムの主要な欠点である。過去20年間のFDAによって、より密接に似ている設定において腫瘍細胞に対する候補化合物のスクリーニング3次元腫瘍環境は、新規な化学療法薬の開発を促進することができる。8 癌細胞スフェロイドは、 インビトロで 、関連する3D腫瘍モデルを提示する。9,10スフェロイドは、スピナーフラスコのような技術を使用して非接着性表面上または懸濁液中の癌細胞の自発的または誘導されたアセンブリを介して形成するコンパクトなクラスタ、液体オーバーレイ、微細加工されたマイクロある良くアレイ、マイクロフルイディクス、および懸滴11-16スフェロイドは、中心ゾーンにキージオメトリおよび酸素の制限された輸送を含む、固形腫瘍の特徴、栄養素、薬物化合物を模倣する。それ故に、彼らはより密接に薬物responを再生成それ固形腫瘍の単層培養物と比較して17〜19本の著しい利点にもかかわらず、スフェロイドは、日常的に、癌細胞に対する化合物のスクリーニングのために使用されていない。市販のロボット工学およびスクリーニング/イメージングツールと互換性があり、標準的なハイスループット設定で均一なサイズのスフェロイドを製造する難しさは、医薬品開発パイプラインに回転楕円体の文化の取り込みを妨げる。カスタム材料とプレートが最近、このニーズに対応するために市販されるようになってきたが、コストの考慮事項は、その普及を阻止する。 新しいハンギングドロッププラットフォームと微細加工されたマイクロウェルを使用し、高スループットで一貫性のあるサイズのスフェロイドを生産する能力を持つ二つの主要な技術。13,16,20しかし、両方のアプローチは、特別なプレートと製作するのに費用およびエンドユーザーのための不便なデバイスを必要とする中核研究センターおよび製薬産業、ほとんどの主要EFで新しい抗癌薬の発見のための砦がなされる。ドロッププレートをぶら下げの最近のデザインの細胞含有液滴の安定性のいくつかの改善にもかかわらず、プレートの唯一の他のすべての穴はまだ滴の拡散/マージを回避するために、培養中に使用されます。16。これはかなり実験的なスループットが低下します。薬物添加と更新は手動またはロボットピペッティングでは困難であり、このプレート構成は、プレートリーダーのような従来のスクリーニング装置と容易に互換性がないため、スフェロイドは生化学分析のための標準的なプレートに転送する必要がある。21マイクロウェルはまた、ソフトリソグラフィーを使用して製作制御されたサイズのスフェロイド生産を可能にする。13,20しかし、標準ペッティングツールと、このプラットフォームの非互換性は、単一の処理条件にすべてのスフェロイドを暴露、異なる薬剤化合物/濃度の個々のスフェロイドの治療を防ぎます。したがって、この方法は、高に適していない複数の化合物/濃度の同時試験を必要とスループット化合物スクリーニング。 これらの障害を克服するために、標準的な96ウェルプレート中で一貫してサイズの癌細胞スフェロイドの高スループット生産のための新しい技術が開発されている。22,23アプローチは（ポリエチレングリコールポリマー水性二相系（ATPS）に基づいている相形成ポリマーとしてPEG）およびデキストラン（DEX）。24 ATPSs最近、新規な細胞の様々な高度に水性媒体中の細胞に細胞微細及び生物学的試薬の局所的な送達を可能にするために生物学的用途に利用されている。25-32を形成する回転楕円体、癌細胞は、水性DEX相と混合し、得られた懸濁液のサブマイクロリットルの滴を十分に浸漬水PEG相溶液を含む中にピペットされる。低下はスフェロイドの形成を容易にするために、浸漬相境界細胞から​​の非混和性のままである。インプortantly、高度に水性の浸漬段階は、回転楕円体の細胞に栄養を提供し、メディアオスモル濃度及び薬物濃度の変動の変化を引き起こすいくつかの他のアッセイに共通のメディア蒸発の周知の問題を最小限に抑える。この技術は、回転楕円体の生産と、標準96ウェルプレート中で、市販の試薬ピペッティング·ツールを使用して薬物治療を可能にする。重要なことには、スフェロイドの細胞応答の分析は、標準的な生化学アッセイおよびプレートリーダーを使用して、同じプレートで行われる。ロボット液体ハンドリングへのアプローチのATPSと適応での作業のしやすさは、モノカルチャーと共培養の両方のハイスループットの生成が簡単な実験技術をスフェロイドなります。この新しいアプローチは、改良された試験のスループットと試験化合物とのReduの費用対効果（数が増加して薬剤の開発と発見のプロセスに癌細胞スフェロイドの統合に向けた大きな前進となりますCED試薬消費量）と効率（）ハンズオン時間を短縮する。 ATPSアプローチを用いて、96ウェルプレート中の癌細胞スフェロイドのロボットの生産のための詳細なプロトコルを以下に記載する。また、得られたスフェロイドおよび商業生化学的アッセイを用いて細胞応答の下流の分析の薬物治療の詳細が提示される。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents and Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol, MW: 35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (10 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (70 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom 96-well plates</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

ロボット液体ハンドラのワークステーションは。 図1に示すペッティングヘッドとセクション4.6でスフェロイドのロボットの印刷に使用されるすべてのステーションは、ラベル付けされている。画像は、先端の箱のための2つの異なるステーション（1混合するためのヒントのセットと、細胞懸濁液水性DEX相混合の/調剤を吸引するための第二のセット）の使用を示している。全体の...

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K ビュー.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

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Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

がん研究

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

マイクロウェルプレートを用いてサイズ制御の腫瘍球、多数の生産

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

生物工学

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

生化学

FLIMベースの代謝および低酸素分析のための多細胞スフェロイド形成

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

著者スポットライト:蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いた代謝および酸素化分析のためのスフェロイド形成法の標準化(英語)

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産

要約

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治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ

マイクロウェルプレートを用いてサイズ制御の腫瘍球、多数の生産

がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)