この作品は、助成金CRUK 15043とCRUK 14251によってサポートされていました。 私たちは、技術支援や原稿の重要な読書のためのダニエルWetterskogおよびKa圭ホーに感謝。

応答マーカーの1。実験摂動と細胞標識（リバーストランスフェクションのsiRNA画面） <ol><li>無菌の組織培養フードピペットで無菌の、無地96ウェルプレートのウェル中に1×siRNAの緩衝液中で200nMのsiRNAを70μlの。無血清DMEM培地の40ボリュームにトランスフェクション脂質を希釈し、各ウェルsiRNAを含むに105μlずつ分注する。 注：無血清DMEMの10.5ミリリットルに262.5μlの脂質を希釈ウェル当たり脂質の2.6μLを提供し、siRNAの全体の96ウェルプレートに適しマスターミックスを生み出す。この段階で200 nMのsiRNAを開始濃度の使用は、ステップ1.3で20nmの作業濃度をお届けしますが、手順はそれに応じて調整開始濃度（ すなわち 、50 nMで）で、5 nMのダウン濃度の作業のために動作します。これらはオンターゲット応答の大きさを減少させることができるが、より低い使用濃度は、オンタージの増加につながる、オフターゲット偽陽性のスコアを減少させることができる偽陰性率をトン。 </li><li>室温で10分間穏やかに振動板を混ぜる。 350μlの中に生じた175μlのサブ分割する透明基材との不透明な、組織培養処理、96ウェルプレート上にターゲットごとに複製します。 </li><li> 50μlの脂質-siRNA複合体上に直接10％の血清を含有する150μlのDMEM中にウェルあたり8000細胞を分配することによってリバーストランスフェクション。使用HCT116ヒト結腸直腸細胞が安定的にCDK2活性5,8を報告GFPタグ付きマーカーを発現する。これ以上の混合は必要ありません。湿度を制御し、プレート「エッジ効果」を防止し、48時間37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターにプレートを配置し、滅菌、接着剤通気性の膜でプレートを密封する。 </li><li>メディアの小さな残留量がウェル内に残っている媒体は、吸引除去する。各ウェルに、4％緩衝ホルムアルデヒド100μlを加えることにより細胞を固定し、部屋トンで10分間ドラフト内でインキュベートemperature。 </li><li>プレートを吸引することにより、定着液を除去します。この時点で、週間まで4℃で暗所に100μlのPBS下で、100μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でプレートを3回洗浄した後、ストア密封することによって、実験を停止か、を続行細胞の透過化。 注：私たちは、固定後できるだけ早く処理プレートを推奨し、一般的には完全に処理プレートのストレージを好む。チメロ​​サール、アジ化ナトリウム、または商業的代替物として殺生防腐剤はmicoroganismal成長を防止するために添加することができる。ホスファターゼ阻害剤の添加は、リン酸化エピトープを維持するために役立ち、タンパク質修飾の状態を維持する他の手段は、当該アッセイの文脈において有用であり得る</li><li>プレートからPBSを除去し、透過処理溶液100μlを添加して細胞を透過性。振盪せずに室温で10分間インキュベートする。マルチチャンネルを使用して透過処理液を吸引annelピペット。このステップを3回繰り返します。 </li><li>室温で30分間、ウェルあたり100μlのブロック溶液を添加して細胞をブロックする。抗P-S780 RB1抗体を50μlのプローブ次に、プレートを吸引し、ブロック溶液を除去し、室温で暗所で2時間ブロック溶液中で500倍に希釈した。 </li><li> 5分間、プレート上の各時間溶液を残し、100μlのプレート洗浄溶液でプレートを3回洗浄する。プローブは、50μlの蛍光標識二次抗体と4℃で一晩暗所でのプレートは、クロマチン特異的DNA染料ビスベンズイミドの2μMで補充ブロック溶液中で1000倍に希釈した。 3回以前のように、店舗のプレートを洗浄し、4℃で暗所に100μlのPBSの下で、密封された。画像2週間以内のプレート。 </li></ol> 2.画像​​撮影·画像セグメンテーション<ol><li>個別の16を取るために20Xの目的で、共焦点または回転ディスク蛍光顕微鏡を使用して、ビットの、DNA色素、GFPおよび免疫染色の蛍光団に対応する3つのチャンネルでグレースケールTIFFイメージ。多くの非オーバーラップ画像セットをキャプチャし、画像にフレームを、ウェルあたり約1,000〜2,000細胞とここで言う。 </li><li>各ファイル名は「実験名&#39;、&#39;よくアドレス」、の順で「フレーム番号」と「チャネル識別子」、（ 図3）のユニークな組み合わせになるように体系的に画像ファイルに名前を付けます。例えばデータセットは、チャネル識別子として「青」（クロマチンDNA染色）、または「グリーン」（GFP）または「赤」（免疫染色されたフルオロフォア）を使用する。ウェルアドレス、フレーム番号およびチャネル識別子はさらに上の画像のメタデータと呼ばれる。紛らわしいウェルおよびフレームメタデータを避けるために、アンダースコア記号を使用してください。 </li><li>指定された順序でこれらのメタデータ要素を持つファイルに名前を付けます。これにより、後続のソフトウェア工程がカレことを保証する必要がある分析のための画像のCTLYグループを設定します。 </li><li>フリーウェアの携帯プロファイラをダウンロードしてインストールし、アクティブなPerlのコミュニティ版、R統計プログラミング環境とRStudio。インストール時にすべてのデフォルトオプションを受け入れ、アクティブPerlをインストールするPCのユーザーは、プロンプトが表示パス、ファイル拡張子の関連付け、スクリプトマッピングに関連するすべてのオプションを有効にする必要があります。アクティブPerlはMacユーザーのためのオプションですが、彼らはそれ以外の端末コマンドラインではなく、アイコンのクリックを使用してから、ステップ3.2でPerlスクリプトを実行する必要があります。 </li><li>セル·プロファイラソフトウェアを開き、「ファイル」をクリックし、[インポート]パイプライン」、次に「ファイルから」とファイル3_channels_pipeline.cppipe（ 図S1A＆S1B）を選択します。ファイルには記述されているファイル名規則から画像ファイルのメタデータを解釈するためのソフトウェアのために必要な命令が含まれています。細胞プロファイラは今番目から核DNAと抗体の強度を抽出し、画像を関連ESEとセル毎に検出（ 図4および5）は、細胞質強度に対する核の比率を計算するためにGFPチャネルを使用する。 </li><li>細胞プロファイラウィンドウの左下隅にあるボタン「表示出力の設定]をクリックします。新しい画面の上部にある[既定の入力フォルダ」と「デフォルト出力フォルダ」というラベルの付いたテキストボックスがある。当時の一つは、これらのボックスの右にあるフォルダのアイコンをクリックして、（S1C図 ）をそれぞれ抽出したデータ、の分析のための画像ファイルの場所と目的地を選択します。 </li><li>細胞プロファイラの左下隅に「分析イメージ」ボタンを押すと、画像解析を開始します。画面の下部にデータ抽出、「ストップ分析」と「一時停止」ボタンの残り時間を観察する。必要な便利である、任意の時点で「一時停止」ボタンを選択して、分析を一時停止した場合分析される画像を見たときに（ステップ2.8参照）。 </li><li>必要に応じて、プログラムウィンドウ（ 図S1D）の左端のパネルに目をアイコンをクリックすると、画像解析ステップのいずれかのためのウィンドウを開きます。画像分割を実行するために、細胞プロファイラで現在の設定は、（これらの設定を変更する上でのアドバイスについては、図1および考察を参照のこと）に適していることを確認するために「IdentifyPrimaryObjects」ウィンドウと「セカンダリ」のものを観察し、「第三紀Objectsの。 </li><li>分析が完了したときに表示されるメッセージボックスで「OK」をクリックします。その結果、すべてのデータファイルは、コンマ区切り値（.csv）にファイル（ 図S2A）として保存されている場所」のデフォルトの出力フォルダ」に移動します。 </li></ol> 3.データの抽出<ol><li>中に含まれている新しいファイル&#39;Nuclei.csv&#39;を検索細胞プロファイラーからの出力。このファイルには、蛍光核抗体の強さ、核DNA強度とGFP-CDK2レポーター比の値（ 図6A＆S2A）のための個々のセルデータが含まれています。 注：別の研究室は、独自のアッセイの性質に合わせて、このタイプのデータを処理するであろう。現在のデータのために提案、提供Perlスクリプト」2_gate_classifier.pl」を使用して抗体データとGFP-CDK2レポーター値に応じてそれぞれの処理条件から細胞のゲーティングである。 </li><li> 「Nuclei.csv「データファイル（ 図S2A）と同じフォルダに提供されるPerlスクリプトファイル&#39;2_gate_classifier.pl&#39;をコピーする。 Perlスクリプトのアイコンをダブルクリックして、プロンプトが表示されたとき、細胞はゲートされ、最終的に抗体のためのゲートの値されるべきで、ファイルの「.CSV」ファイル名が続くデータファイルの完全な名前を入力します蛍光とGFP-CDK2レポーターデータ。 注：主にゲート設定を決定し、データの分析のためにこれらを適用する方法が代表的なデータセクション及び図6に、以下に議論される（データ提供利用「0.004」をそれぞれ「1.5」を、分析する）。 「perlの2_gate_classifier.pl &#39;：Macユーザーは次のように入力して、ターミナルコマンドラインからPerlスクリプトを実行する必要があります。 </li><li>各ウェルからの各セルは両方のゲート（ 図6C）に対して実行する方法を示し、サブ母集団のラベルを元の細胞プロファイラデータから生の個々の細胞アッセイ値を組み合わせ、新しく作成したファイルを確認します。 </li><li> RStudioソフトウェアを開くことによって、個々の細胞亜集団のラベルを使用して、各実験条件についてのデータをプロットします。 「ファイル」と「ファイルを開く」をクリックし、提供「analysis.r」ファイルを選択します。 図6Bをプロットするためのコマンドを観察し、 <sRStudio（ 図S2B）の左上のウィンドウで·チョン&gt; 7と8。左上のウィンドウでは、線5,6上の二重引用記号の間に、ゲートされたデータを含むフォルダのコンピュータアドレスを入力します。 （ &quot;：/分析フォルダ/分析出力C」と「nuclei_gated.csv」など 、）は、それぞれドライブ文字とファイル自体の名前を含めます。 注：RStudioは、与えられたコンピュータ上で初めて使用されている場合は、Rグラフィックパッケージ &#39;ggplot2&#39;を最初にインストールする必要があります。これは、このステップは、冗長になるの後RStudioの新規インストールのための一度だけのステップです。 「ggplot2」をインストールするには、RStudioの右下にウィンドウの上に「パッケージ」と呼ばれるタブをクリックし、この下に表示される「パッケージのインストール」ボタンをクリックします。新しいウィンドウが表示されます。 &#39;パッケージの中にタイプ&#39; ggplot2 &#39;（省略さ引用）この新しいウィンドウでペース、最後にステップ3.6から継続して、ウィンドウを閉じる必要ggplot2機能をインストールし、メインRStudioウィンドウに戻り「インストール」ボタンをクリックしてください。 </li><li>ハイライトラインRStudioの左上のウィンドウで17を1、それから「ファイル名を指定して実行]ボタンをクリックします。これはR（ 図S2C）に実験データ、しきい値およびウェル場所の詳細を入力します。 Rは今一時的にプロットするための関連データを保持します。 </li><li> 17行の下に残りのコードの個々のブロックをハイライト表示し、以前のように「ファイル名を指定して実行」ボタンをクリックすることで、対応するプロットを作成します。 RStudioの右下隅にウィンドウにプロットを観察し、「エクスポート」ボタン（ 図S2D）をクリックすることにより、フォーマットの数を保存します。 </li><li> RStudioを閉じながら、プロンプトが表示されたら、「保存しない」をクリックします。これはそうでなければ、データを保持するRStudioの次の使用上の混乱を防ぎます前のセッションから。 </li></ol>

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	<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).</li><li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images.">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11 (2013).</li><li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening.">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li><li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content,+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888.">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692 (2011).</li><li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response.">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692 (2012).</li><li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution.">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li><li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+siRNA+screening.">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li><li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in.">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pRB+phosphorylation.">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li><li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside.">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li><li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+imaging+in+fixed+cells.">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li><li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible. , 1-363 (2011).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 978-970 (2009).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない

記載されたワークフローは、siRNA、その後のマーカー検出を用いた細胞のウェル摂動する手順を構成し、最終的に得られた蛍光顕微鏡画像から定量的データの抽出を容易にするために、ソフトウェアでサポートされている一連のステップの使用。アプローチは、多くの細胞ベースのアプリケーションにおいて幅広い実用的用途を有する個々の細胞の核および細胞質強度値の送達に焦点を当てている。ここで使用される例示的なデータは、G1期の細胞周期の通過のための2つの蛍光アッセイは、試験され、バック核DNA含有量のより直接的な生物物理学的測定値に相関されたsiRNAの画面の設定で生成された。 それは個々の細胞の同定を可能にし、得られた「核マスクが「対応cytoplasmiを識別するための出発点として機能するように、画像の核DNAに蛍光DNA染色の使用は、画像分割プロセスに不可欠なステップであるC領域。安定的に細胞内で発現されたGFPタグCDK2の記者は、まだこのコンパートメントは描写することが可能な細胞質中のバックグラウンドシグナルよりも一貫して高い変数を提供します。同じ分析パイプラインは、他の適当な蛍光連結記者や摂動に対する応答を使用してタンパク質転位事象の分析に適用可能であるべきである。また、細胞質特異的蛍光色素を用いてGFP-CDK2レポーターを代入すると、このアルゴリズムの代替的な使用は、細胞質の次元画像中の細胞の相対的な大きさを測定することを可能にする。 ここで説明する画像分割戦略の別の設計考慮事項は、DNAの定量化のための統合された強度値を提供するセルプロファイラを使用することである。核DNAの染色データに対する強度値の積分核のサイズの可能なバリエーションを可能と見られる定量化プロファイルの近い一致を表すヨウ化プロピジウムのためのFACSデータを染色した。しかし、積分強度は、抗原の蛍光の平均強度によって例示平均濃度は、細胞コンパートメント内でより生物学的に関連するタンパク質の集積総量（および関連蛍光）よりもタンパク質の機能を評価するための適切な手段を提供することができない。したがって、強度値は、P-S780 RB1及びGFPのデータのために使用したことを意味する。データ評価の2つのモードを変更するオプションが（平均または統合）細胞プロファイラソフトウェアの「ExportToSpreadsheet」パネルに記載されています。 3_channels_pipeline.cppipeファイル内の解析設定は、例えば、データセット内の画像のために最適化される。このプロトコルを使用して新しいイメージのセットの分析は、ファイル名が命名規則は、上記（ 図3）に記載採用することを必要とします。また、感度は、バックグラウンド核DNA染色としきい値の明るさに応じた値新しい画像セットにおける強度は、Cellプロファイラの設定内で調整する必要があるかもしれない。 DNA染色は、様々な画像セグメンテーションマスクを作成するための保持に重要な役割を考えると、このチャネルの正しい感度設定の適用は、細胞プロファイラソフトウェアと新たな画像データの解析に成功の鍵である。提供される細胞プロファイラ設定ファイル（3_channels_pipeline.cppipe）は、新しいデータに分析を適合させるための最も頻繁に有用なパラメータに関する注意事項が含まれています。これらのノートは、Cellプロファイラーのメインウィンドウで、画面上部のテキストボックスにあり、感度の設定を変更し、分析するチャネル数を調整する上でのガイダンスが含まれています。新たな画像データの設定をテストするために、プロトコルのセクション2.8で起訴されたように、プロトコルステップ&#39;...オブジェクトを識別する」をそれぞれについて「目」のアイコンを開く]をクリックして画像解析時の画像分割を観察する必要があるかもしれない（ 図S1D </strong&gt;）。核マスクが正しくDNA染色の画像から特定された場合、特に、「IdentifyPrimaryOjects &#39;を介して画像データの視覚化は、表示される。 「IdentifyPrimaryOjects」モジュールのセル·プロファイラソフトウェアページで閾値補正係数である。この値の試行錯誤調整はほとんどの核認識エラーを修正します。値は、各画像のバックグラウンド強度に対するDNAのチャネルのバランスをとる。閾値補正係数値の周りの1、これよりも大きいが、より厳しい（クリアな画像のために良い）で、1未満（染色と背景の少ないコントラストの画像に適した）寛大ですヒンジ。 細胞プロファイラからの個々のセルデータの生の出力は、他の研究者のニーズに合わせて様々な方法で分析することができる。ここに示したデータanから生物学的な傾向を抽出することを支援するために、セルごとに測定されたパラメータのうちの2つにゲートを適用するためのPerlスクリプトの使用である追加の測定で識別部分集団のD許可相互参照。それは、Cellプロファイラの枠組みの中でゲーの要素を含むことも同様に可能ではあるが、ここで使用される代替ルートは、大規模なデータセットを評価する必要がある場合には特に、より高い柔軟性とスピードを提供します。現在のプロトコルの後の画像取得の段階で最も遅い段階は、Cellプロファイラソフトウェアの実行されています。ここで細胞プロファイラは、必要に応じて反復的に異なるゲート値で、より迅速に、その後のPerlスクリプトを再分析することができ、未ゲーテッド生データセットを生成するためにゲートをかけることなく実行されます。すべての研究は、このように適切なゲート値はデータの任意のセットで、潜在的に時間をかけての試薬と異なる場合があり、事前に知っているわけではありません。したがって、適切なゲートバリューを識別するために、陽性対照およびモデル摂動細胞について細胞プロファイラから得られた生データ配信を示すヒストグラムを生成することをお勧めです興味のあるパラメータのためのES。 Perlスクリプトは、Cellプロファイラからのデータの厳密に定義された列構造を受け入れるために、ユーザーが「ExportToSpreadsheet」設定を用いて細胞プロファイラによってパラメータ出力の数を変更する場合は、作業を停止することが書かれています。ノートはPerlのスクリプトファイル内に含まれる設定の変更を実装するのに役立ちます。これらはテキストエディタでスクリプトを表示する表示するには、好ましくは、プログラマのテキストエディタ（ 例えば 、http://www.activestate.com/komodo-edit）カラーコードPerlの要素に設定されています。これらのノートは、データフォーマットの変化に適応するためのスクリプトを調整する場所を示す。 Perlスクリプト、（analysis.r）提供R-コードファイルと同様に、画像解析データから数値をプロットするための命令を含む、使用および適応に追加したメモを参照し、テキストエディタやRStudioソフトウェアで読み取ることができます。これらのノートは、正規表現とPerlについての詳細を補足することができる&lt;&gt; 12（商標）、それぞれ、データは、読み込みアノテートしてプロットされている方法の基礎を形成し、どちらもR用ggplot2 13パッケージ。 蛍光顕微鏡を用いて新たな研究と同様のオープンソースの出版物に寄託生データは、ここに記載されるような分析方法に適している。高コンテンツデータの本質は、任意の観察者の研究関心に応じて、異なる分析的な強調を持つ再帰的な分析に適しています。データの求められることができる質問はもともと使用されるプローブによって制限されていますが、画像データは、多くの場合、意味のある、それを生成した研究の範囲を超えて再分析することができます。

ここで紹介する作品は、個々の細胞と定義された細胞内領域を同定する接着細胞の蛍光顕微鏡画像のアルゴリズム誘導内訳を実行するために自由に利用できるソフトウェアセルプロファイラの使用が記載されている。このアプローチは、画像セグメンテーションと呼ばれる（セグメント化オブジェクトと呼ぶ）は、各細胞または細胞内領域に局在蛍光標識マーカーを定量することによって画像化された細胞のその後のマルチパラメトリック分析が可能になる。このワークフローは、高含有量の分析を可能にするための基礎を構成し、さらに開発され、マルチパラメータに合わせて変更する、個々の細胞は特殊な高コンテンツ器具または独自のソフトウェアにアクセスすることなく、実験室で分析することができるツールとして役立つことを意図している。本稿に付属ファイルについて分析を生成するために、関連する原画像データ、アルゴリズム設定支持スクリプトのテストセットを含む。提供アルゴリズム設定fはまたは細胞プロファイラは、他の研究からの画像データの利用を可能にするために必要であるかもしれないものの調整例のデータセットとディスカッションセクションの詳細のために最適化される。 定量的データは、Cellプロファイラを使用して抽出された後、別の研究室は、生データ内の個々のセルの値によって提示された情報を使用する方法のための異なる要件を有していてもよい。ここに示されているゲートは、各アッセイのために生データに適用されることにより、一つのアプローチである。これらのゲートを使用して、データがゲートによって定義された応答を受けた細胞の亜集団と異なる処理を結ぶ傾向の可視化を可能にする、応答のバイナリ条件に変換される。ゲートは、それぞれの関連測定のための適切な陰性および陽性対照について得られたデータ分布の観察に基づいて設定されている。ゲートの使用は、生、細胞ベースの測定を管理する方法のほんの一例である。また、ここに示した核DNA強度の使用である私にゲートされたデータと組み合わせて、連続した範囲の値としての生の形でasurements。画像解析データを管理するための他のアプローチは、調査の性質に応じて、考慮されるべきである。部分集団に細胞を割り当てるためのゲートを用いて統計的選択肢が2報告されており、パラメータの多数にわたって高いコンテンツデータを要約するための戦略の系統的比較は3に報告されている。 6 -画像データの高含有量分析は、薬物応答の細胞研究における用途が見出されている、遺伝学および4シグナリング環境ストレスを逆転。高含有量の分析の利点は、蛍光顕微鏡データのアルゴリズム的解析は、定量的および空間的なパラメータは、個々のセル7で同時に考慮されることを可能にするという事実から生じる。このように、複数のアッセイのための細胞の結果は、アッセイdの相互参照、差動動作することができefined細胞亜集団は、形態学的な変数を考慮を含むことができ、実験条件およびアッセイ内で追跡することができる。戦略、ここで説明する解析ワークフローは、他の高含量のアプローチのように、個々のセルへの相互参照された多重化データを配信することが可能である。蛍光顕微鏡画像を生成する画像の数千までの低スループットは従来の蛍光ベースの顕微鏡検査で生成された画像の数の範囲のデータの分析に適用可能な高含量の方法スーツ研究自動化ハイコンテンツスクリーニングプラットフォームを用いて製造。 ワークフローは、別のアッセイは、核蛍光マーカー強度またはそれぞれの蛍光レポータータンパク質の細胞質/核移行、のいずれかの点で測定されるデータ例をここに図示されている。これらのアッセイは、EACに応じて、別々にまたは組み合わせて考慮することができるという点で、ワークフローが柔軟であるhは異なる研究者によって研究課題を与えられた。例えばデータは、RNA干渉（RNAi）実験（ 図1）の一部として製造される。低分子干渉RNAオリゴヌクレオチド（siRNA）は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）の活性の二つの蛍光レポーターのための変化をもたらすHCT116ヒト結腸直腸癌細胞中の特定のタンパク質をノックダウンするために使用される。セリン780（P-S780のRB1）における核網膜芽細胞腫タンパク質のCDK6依存性リン酸化は、抗体染色によって評価される。同じ細胞では、CDK2活性（GFP-CDK2レポーター）の緑色蛍光タンパク質タグ付きレポーターはCDK2活性の非存在下でレポーターは細胞質に核及びCDK2活性シャトル上に存在する細胞質比にその核によって評価される8。加えて、各細胞の核DNAは細胞を同定し、同様に画像内の核の境界線を定義するための手段として機能するDNAインターカレート色素、ビスベンズイミドを用いて染色されDNAの存在量のsaの尺度は、（ 図2）細胞の細胞周期位置に関する情報を提供する。 CDK6およびCDK2の活性は、細胞周期5のG1からS期への細胞の通過として検出可能であるような、個々の細胞内の2つのレポーターの間の緊密な一致が予想されるように、互いに9,10成功し。ここで使用されるデモデータセットを例として分析siRNAの効果は、CDK6、網膜芽細胞腫タンパク質（RB1）及び非標的化ネガティブコントロール（ 表1）を標的とする。 CDK6のノックダウンは、P-S780のRB1エピトープの減少および細胞周期のG1期における細胞の蓄積の両方を引き出すべきである。 RB1のノックダウンは、リン酸化S780抗体の特異性のための試薬対照として役立つ。ホルマリン固定された11からの蛍光顕微鏡画像は、蛍光染色されたHCT116組織培養細胞は、アルゴリズムの画像解析のために使用される。得られた数値データは、その後に使用されるクロスリファレンス記者や、異なるノックダウン状態の影響を評価。 このタイプの分析によって生成されたデータの潜在的な大きさは通常の解析ツールへの課題を提示することができます。例えば、個々のセルデータは、いくつかの表計算ソフトを収容するよりも大きくすることができる。大きなデータセットの分析を支援するためのデータの単純な、高度に反復的な、教師の処理を行うのPerlスクリプトが含まれる。 Perlスクリプトは、特定のファイルの命名規則（ 図3）で画像ファイルを処理する際に細胞プロファイラ、によって生成される出力ファイルのために特別に書かれた、と分析に使用するウェル当たりのフィールド変数番号を可能にしている。これは、細胞亜集団5の動向を追跡するためにゲート個々の細胞アッセイデータに頻繁に重要であり、ここに示されている各アッセイタイプについて、所定の設定ゲートに基づいて、各セルは、フラグにPerlスクリプトを使用することである。また、オプションのPerlスクリプトも含まれていますその実現、個々のウェル（または条件）のためのデータの結果を要約：セットのゲート内の細胞の割合と生の検定スコアの平均値を。応答はすべて、またはウェル内の細胞の大部分に影響を与える場所データを表示するの後者の、より均質な方法は、有効である。上述のように、そのような評価は、応答が、集団内の細胞のサブセットに限定される個々のセルデータゲーティングによってもたらされるものよりもあまり有用である。 記載されたワークフローの有用性は、siRNA又は説明マーカーアッセイによって摂動に限定されるものではない。研究は、siRNAの組み合わせ、化学阻害剤および放射線治療を用いて組織培養実験およびCDK6以外のマーカーの評価及びCDK2活性5に対する応答をアッセイするためにこのアプローチを使用している。 概念的には、実験的な戦略は、生物学的に有用な細胞内領域が多様に自動的に登録されることを可能にする蛍光顕微鏡画像中に存在する個々の細胞である。このように、このアプローチは、集団ではなく、個々のセルに焦点技術によって見逃され得る生物学的情報を明らかにし、定量的、多重化されたデータを得ることができる。軽微な変更で、説明されたアプローチおよび分析ワークフローは、任意の蛍光ベースのアッセイ出力および細胞生物学的応答、DNA含有量の定量的評価、核または細胞質の蛍光またはこれらの間のマーカーの往復の定量のための定量的な、個々のセルのデータを得ることができる二つの区画個別にまたは多重化方式では重要である。パブリッシングの要件はますます公然とアクセス可能な生データの提出に向けて傾向があるように、このようなここに記載されているような顕微鏡画像解析のためにアクセスし、無料ツールに精通も公開されたデータを再分析するために探してラボへの直接対象としています。

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	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AllStars negative control siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1027280</td>
			<td style="width:167px;">Negative control siRNA.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">CDK6 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">RB1 siRNA</td>
			<td style="width:103px;">Dharmacon/ Custom synthesis</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Antisense sequence: 5&#39; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5x siRNA buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:167px;">To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nulcease-free water (non-DEPC)</td>
			<td style="width:103px;">Applied Biosystems</td>
			<td>AM9937</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of siRNA buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hiperfect</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right">301705</td>
			<td style="width:167px;">Transfection lipid.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">41966052</td>
			<td style="width:167px;">Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">96 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:103px;">Falcon</td>
			<td align="right">3072</td>
			<td style="width:167px;">Plain, 96-well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Packard Viewplate</td>
			<td style="width:103px;">Perkin Elmer LAS</td>
			<td align="right">6005182</td>
			<td style="width:167px;">96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Breathable membrane</td>
			<td style="width:103px;">Alpha Labs</td>
			<td style="width:119px;">LW2783</td>
			<td style="width:167px;">Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-1CS</td>
			<td style="width:167px;">10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100PC</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;">Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;">For plate wash solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-P-S780 RB1 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Abcam</td>
			<td>ab32513</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AlexaFluor647 Anti-rabbit</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td>A21245</td>
			<td style="width:167px;">Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Permeabilization solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plate wash solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Tris-buffered saline containing 0.1 % Tween-20.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Block solution</td>
			<td style="width:103px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Profiler 2.1</td>
			<td style="width:103px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Active Perl Community Edition</td>
			<td style="width:103px;">ActiveState</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">R programming environment</td>
			<td style="width:103px;">The R Foundation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.r-project.org</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rstudio</td>
			<td style="width:103px;">Rstudio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

接着性の哺乳動物組織培養モデルにおける細胞の挙動を支配する制御機構を理解することにおける進歩は、単一細胞分析のモードにますます依存するようになってきている。細胞集団からのバイオマーカーの平均値を反映して、複合データを配信する方法は研究され、生物学的システムの不均一性を反映した亜集団のダイナミクスを失う危険性があります。これを踏まえて、従来の手法により置き換えられている、またはハイコンテント顕微鏡による評価を可能にするために開発された細胞アッセイの、より洗練された形でサポート。これらのアッセイは、潜在的にプロプライエタリソフトウェアパッケージに付属することで使用可能な蛍光バイオマーカーの大量の画像を生成、細胞あたりのマルチパラメトリック測定が可能になります。しかしながら、比較的高い資本コストと、これらのデバイスの多くのoverspecializationは多くの研究者に彼らのアクセス可能性を妨げてきた。 ここに記述されているほとんどの蛍光顕微鏡からの画像との使用に適した個々の細胞の特定の細胞内領域からの複数の蛍光標識強度の定量化のために普遍的に適用可能なワークフロー。このワークフローの鍵は、これらのイメージ内の個々の細胞を区別定義された細胞内領域に分割して、これらの領域に固有の蛍光マーカー強度値を提供するために自由に利用可能な細胞プロファイラソフトウェア1の実装です。画像データから個々のセルの強度値の抽出は、このワークフローの主な目的であり、接着性ヒト細胞におけるG1チェックポイントレギュレータのsiRNAスクリーニングからの制御データを解析して説明する。しかし、ここに提示ワークフローは、細胞摂動の他の手段からのデータの分析に適用することができる（ 例えば 、化合物スクリーニング）このようにして、蛍光ベースの細胞マーカーの他の形態とは、研究室の広い範囲のために有用であるべきである。

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Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

蛍光標識された細胞の多重化された画像ベースの分析を可能に柔軟インフォマティクスワークフローがある発表。ワークフローは、核と細胞質のマーカーを定量化し、これらの区画の間のマーカー座を計算します。手順は、96ウェルフォーマットで、間接免疫蛍光法によってマーカーを検出するためのsiRNAで信頼性の高い方法論を用いた細胞の摂動のために提供される。

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

workflow-for-high-content-individual-cell-quantification-fluorescent

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K ビュー.  UCL Cancer Institute. 蛍光標識された細胞の多重化された画像ベースの分析を可能に柔軟インフォマティクスワークフローがある発表。ワークフローは、核と細胞質のマーカーを定量化し、これらの区画の間のマーカー座を計算します。手順は、96ウェルフォーマットで、間接免疫蛍光法によってマーカーを検出するためのsiRNAで信頼性の高い方法論を用いた細胞の摂動のため?...

ビデオ: Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

生物学

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts whose expression is associated with insecticide resistance phenotypes in Anopheles gambiae mosquitoes. The application can be used online or downloaded and used locally by anyone. The local application can be modified to add new insecticide resistance datasets generated from multiple -omics platforms. This guide demonstrates how to add new datasets and handle missing data. Furthermore, IR-TEx can be completely and easily recoded to use-omics datasets from any experimental data, making it a valuable resource to many researchers. The protocol illustrates the utility of IR-TEx in identifying new insecticide resistance candidates using the the microsomal glutathione transferase, GSTMS1, as an example. This transcript is upregulated in multiple pyrethroid resistant populations from C&#244;te D&#39;Ivoire and Burkina Faso. The identification of co-correlated transcripts provides further insight into the putative roles of this gene.

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx explores insecticide resistance-related transcriptional profiles in the species Anopheles gambiae. Provided here are full instructions for using the application, modifications for exploring multiple transcriptomic datasets, and using the framework to build an interactive database for collections of transcriptomic data from any organism, generated in any platform.

IR-TEx:マラリアベクトルアノフェレスガンビア用に設計されたビッグデータトランスクリプトミクスのためのオープンソースデータ統合ツール

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

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