Name: isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells
Uploaded: 2014-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
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この作品は、（KAH）は健康グラントR01 AI088209の国立研究所によってサポートされていました。また、ミネソタフローサイトメトリーのリソースの大学に感謝します。

本研究では、成人（6 - 8週）の雌のC57Bl / 6マウスを用いた。マウスは、国立癌研究所から購入し、特定の病原体フリーの条件下で維持した。ミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、すべての動物実験を承認した。 楽器とバッファの調製<ol><li>酵素液の準備、アルブミンが豊富なバッファー（1×PBSの[Ca 2 + / Mgの2+を含まない]と0.5％ウシ血清（0.05％RPMI1640培地をリベラーゼTH及びDNアーゼIの100単位/ mlの[w / vの]）アルブミン及び2mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA]）、FACS緩衝液（1×PBSの[Ca 2 + / Mgの2 +を含まない]を含む1％ウシ胎児血清[FBS]、0.02％のNaN 3）、FACSバッファソーティング（1X PBS 10％FBSが供給された[Ca 2 + / Mgが2 +を含まない]、2％FBS）を含有する、およびRP10培地（RPMI-1640培地）。 </li><li> 10パニングプレートを準備します。 （0.01 mg / mlのGを40ml塗布液を調製しオート麦は、0.1MのNaHCO 3緩衝液中の抗ラットIgG）を、それぞれ100×15ミリメートルプレート、スワールに塗布液の4ミリリットルを追加し、4℃、CO / Nインキュベートする。抗体溶液を捨て2回1×5mlのPBSを用いてプレートをすすぎ、リンスの間で活発に渦巻く。 4℃で準備されたプレートを保管してください。 </li></ol>胸腺組織の2収穫<ol><li> CO 2チャンバー内でマウスを安楽死させる。 、解剖マットの上に仰向けに動物を入れてマットの上に足をピンと70％エタノールを噴霧して毛皮を濡らす。 </li><li>まっすぐにハサミで下顎への尿道口の上から出発して、皮膚を​​介して正中切開を行い、両側の膝に下向きに切開を延長。切開は「Y」逆さまのように見えます。両側のたるんだ皮膚を後ろに引き、そして解剖マットにそれをピン。 </li><li>次いで、肋骨を持ち上げ、鎖骨付近までそれぞれの側にリブをカット、剣状突起から横隔膜を穿刺鉗子は解剖マットにそれをピンと。胸腺はちょうど肋骨の下にあり、心の上にある二つの薄い白のローブ（ 図1）のように見えます。胸腺の周囲の結合組織を外し、緩やかに湾曲鋸歯状の鉗子で胸腺ローブのペアを引っ張って外します。 5ミリリットルのRPMI-1640を含む6ウェルプレートに胸腺葉を置きます。 </li></ol>胸腺間質細胞の調製<ol><li>周囲の脂肪と結合組織をトリミングし、新たに酵素液を調製5ミリリットルを含む6ウェルプレートの新しいウェルに胸腺葉を移す。細かいハサミで胸腺葉に小さな切開を行い、20分間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>組織解離のための5ミリリットルピペットを用いて3回 - 静かにピペットを上下に2を胸腺組織を消化。 10ミリリットルの酵素を中和するコールドアルブミンが豊富な緩衝液を含む50mlチューブに上清画分を収集する。氷上でコレクションチューブを保管してください。 2.5を追加します。残りの組織への溶解酵素溶液と15分間37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>凝集体を破壊するために3ミリリットルの注射器と、18G針で穏やかな機械的撹拌を実行します。コレクションチューブにプール上清。残りの組織に2.5ミリリットルの酵素溶液を加え、15分間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li> 3ミリリットルの注射器と25 Gの針で穏やかな機械的撹拌を繰り返し、プレートをさらに5インキュベート - 10分。 </li><li>完全消化した後、コレクションチューブに上清をプールする。遠心分離した細胞を収集するために8分間400×gで、4℃でコレクションチューブ。液体を吸引し、10mlのアルブミンが豊富なバッファ内のペレット化した細胞を中断し、100mmのメッシュを通してサンプルをフィルタリングする。血球計数器を用いて細胞を数える。その後、フローサイトメトリー分析（第4節）、またはTECの濃縮（第5節）を行う。 </li></ol>フローサイトメトリーによるのTECの4の同定</p&gt; <ol><li> 96ウェル丸底試験板に染色FACS緩衝液中に100μlあたり4×10 6細胞の最終濃度に細胞を調製し、氷上にプレートを保つ。細胞に（FACS緩衝液中10μg/ mlの抗CD16 / CD32抗体）を20μlのFcブロック溶液を加え、氷上で10分間細胞をインキュベートします。 400×gで、3分間、4℃でプレートをスピン。流しにダウン板面をフリックでウェルから液体を捨ててください。 </li><li> 100μlの抗体カクテル（抗CD45、-EpCAM、-MHCクラスII、および-Ly51抗体におけるペレット化した細胞を一時停止し、メーカーで異なる蛍光色素で標識したUEA-1レクチンは、FACSバッファ内の各抗体の最適な濃度をお勧めしますまたはテスト）し、暗所で20分間氷上で細胞をインキュベートする。補償のために、各個別の蛍光色素で1×10 6個の細胞を染色する。 </li><li>各ウェルにFACS緩衝液100μlを加え、400×gで、3分間、4℃でプレートをスピン。洗浄ステップ1を繰り返します時間、その後100μlのFACS緩衝液中で細胞を再懸濁。 300μlのFACS緩衝液で満たされた12×15mmの丸底FACSチューブに細胞を移す。フローサイトメーターでサンプルを取得し、FACS分析ソフトウェアを用いてデータを分析する。 TECゲーティング戦略は、 図2に示されている。 </li></ol>パンニングによるTECの5。エンリッチメント<ol><li> 5分間400×gで、4℃で（セクション3で調製した）胸腺細胞をスピンダウン。吸引した液体と15ミリリットルまたは50 mlコニカルチューブ中の1ml当たり2×10 8細胞の濃度でFACSソーティングバッファ内のペレット化した細胞を一時停止する。細胞懸濁液を2.5μg/ mlの最終濃度で抗CD90.2抗体（クローン30-H12）（または抗CD45）を追加し、30分間4℃で回転ミキサー上で穏やかに細胞をインキュベートする。インキュベーションに続いて、5で洗浄 - RP10培地の10倍の体積と400×gで、5分間、4℃でチューブを遠心する。 </li><li>吸引した液体とでペレット化した細胞を再懸濁1mlあたり1×10 7の濃度でRP10培地。各コーティングされたパン（ステップ1.3で調製）プレート、スワール5ミリリットルの細胞懸濁液を加え、室温で30分間インキュベートする。精力的に渦巻く;コニカルチューブに上清を移す。プレートをRP10培地を用いて2回すすぎ、収集チューブに上清をプールする。 </li><li> 400×gで、5分間、4℃でコレクションチューブを遠心。吸引した液体と5ミリリットルのRP10培地中でペレット化した細胞を懸濁します。 、新しいパンプレートに細胞懸濁液を追加旋回し、室温で30分間インキュベートする。細胞がプレートをすすぎ、コニカルチューブにそれらをプール収集します。 TECのが濃縮されると、5分間、4℃、400×gで細胞をスピンダウンし、バッファをソートする5ミリリットルのFACSで細胞を一時停止。 </li></ol>細胞選別によるのTECの6。精製<ol><li>血球計数器を用いて細胞を数え、FACSソーティングバッファ内の4×10 7細胞の濃度で細胞懸濁液を準備します。抗体デスを追加細胞溶液に4.4節でのcribed、30分間、4℃で回転ミキサー上で穏やかに細胞を培養する。染色の後、洗浄し、FACSソーティングバッファの1mlあたり10×10 6細胞の濃度に細胞を懸濁する。 </li><li>蛍光活性化セルソーティングを使用して、100μMのノズルを通してソートテックサブセット。ソートされた細胞は、RPMI-1640中30％（v / v）のFBS）に集められる。細胞選別は、5分間、400×gで、4℃で遠心分離を行って細胞および下流の分析のために準備される一度。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

プロトコルでは、重要なステップは、胸腺間質細胞（第3節）とのTECの濃縮（第4節）の製造である。ことを強く新鮮な酵素溶液を毎回用意し、組織をできるだけ早く扱われることをお勧めします。プールされた胸腺、酵素溶液の容量を最適化する胸腺の数に応じて必要とされる。任意の組織残留物は、処理後に残っている場合、より多くの酵素溶液及びインキュベーション時間の延長を添加?...

初期のT細胞の開発で、骨髄の造血幹細胞由来の多能性前駆細胞が胸腺の皮質に補充される、T細胞系列へのコミットメントを受け、T細胞前駆体1になる。非常に変化したT細胞受容体1と前駆細胞の大きなプールを形成し、皮質では、T細胞前駆体のCD4とCD8ダブルネガティブ（DN）胸腺細胞が膨張し、未成熟CD4およびCD8ダブルポジティブ（DP）胸腺細胞に分化する。 DP細胞の選択MHC拘束性サブセットは、CD4またはCD8シングルポジティブ（SP）胸腺細胞になる胸腺の髄質に移行し、機能的に有能な成熟T細胞へのような正の選択2-と呼ばれるイベントを差別化するだけ6。これとは対照的に、自己反応性胸腺細胞のクローンは、負の選択を受け、自己寛容のための制御性T細胞に変換するか、まだ明らかでない目的のために上皮内リンパ球に転用、アポトーシスによって取り除かれる3,7-10。 胸腺は、胸腺間質細胞は、これらの多様なT細胞の発生運命5,11,12のための信号を提供するユニークな微小環境を形成している。皮質のTEC（cTECs）および髄質のTEC（mTECs）、樹状細胞、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞、神経堤由来の周皮細胞および他の間葉系細胞を13〜15を含む-胸腺間質細胞は、胸腺上皮細胞（TECの）から構成されている。これらの中でも、TECは、T細胞の発達1,2,16,17のさまざまな段階で重要である。しかし、TECのを隔離するための確実な方法がないことは、それらの機能16の包括的な理解を妨げている。特に、皮質の前駆細胞を囲む三次元網目構造を形成cTECsは、まだ明らかでない理由のために正の選択13,18,19のために必須である。初期の研究は、主に形態学的および組織学的ツール13に頼ること、のTECの不均一性や役割などの手掛かりを提供</suP&gt;。最近のTECサブセットのユニークな役割は、マウスモデル12,20における遺伝的アプローチによって対処された。 TECのを単離するための堅牢で再現性のある方法がcTECsが正の選択をサポートする方法のTECサブセットの公正な特性評価、TEC機能の定量的および定性的評価、およびメカニズムの解明を達成することが基本である。 ため、彼らは無傷の器官において形成胸腺内のTECの希少性とタイトな相互作用のために、TECはの単離は困難なされています。ここで説明するプロトコルは、以前の発見、現在利用可能な試薬、技術、および胸腺構造および間質組成物の知識に基づいている。ほぼ20年前に、いくつかの手順は、トリプシン、コラゲナーゼとディスパーゼを含むさまざまな酵素が消化中に使用された胸腺組織21-27を 、脱凝集することが報告された。 Gray ら 。彼らprecedure 28のものの酵素を比較し、改善されたメタを報告した広く使用されている20,30になった酵素カクテル29の多段消化し ​​たOD。しかし、この方法は、長い準備時間と同じでもマウスのコホート29,30でのTECの可変の最終細胞数および割合で複雑 ​​な消化工程および結果を含む。数年前、リベラーゼ研究グレード酵素、高度にコラゲナーゼを精製し、中性プロテアーゼは、胸腺組織解離30で使用され始め含有する。ここでは、マウスの胸腺組織からの生のTECの高い数を出し最適化された機械的分離手順リベ消化ベースのプロトコルを記載している。 。 解離した間質細胞を濃縮するために、以前の研究では、密度勾配または磁気ビーズ分離21,29のいずれかを使用している。しかし、両方の方法は、胸腺ストローマ細胞、cTECs 29の特に人口の特定の集団から失わ厳しい引き起こす。細胞傷害性除去とパニング技術<s&gt; 31,32まで広く免疫学分野12,31に枯渇またはリンパ球を分離するために使用されている。これらの技術の比較後、私たちはTECのを濃縮するための現在のパン·プロトコルを確立した。濃縮手順の間に緩やかな条件が少ない細胞死および公正な増加TECの回復につながる。 セクション3に記載される単離され胸腺細胞懸濁液を直接TECサブセット及び樹状細胞の同定および特徴付けのためにフローサイトメトリー分析に適用することができる。第4節では、サイトメーター多パラメーターフローを使用して、TECのサブセットを識別するための簡単​​で便利な方法を説明しています。精製されたcTECsまたはmTECs、TEC濃縮と手順をセルソーティングを得ようとした実験については、セクション5と6に記載されています。

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse EpCAM</td><td>eBioscience</td><td>XX-5791-YY*</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC II</td><td>eBioscience</td><td>XX-5321-YY*</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly51</td><td>eBioscience</td><td>XX-5891-YY*</td><td>Clone 6C3</td></tr><tr><td>UEA-1</td><td>Vector Laboratory</td><td>FL-1061</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Flow cell sorter</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

胸腺は、Tリンパ球の開発のための重要な器官である。 T細胞のコミットメント、正の選択および負の選択：胸腺ストローマ細胞、胸腺上皮細胞（TECは）は、T細胞発生の複数の段階において特に重要である。しかし、胸腺内のTECの機能は完全には理解されたままになります。記事では、機械的破壊及び酵素消化の組み合わせを使用して、新鮮なマウスの胸腺からTECサブセットを単離するための方法を提供する。方法は、胸腺間質細胞および胸腺細胞を効率的に細胞 - 細胞および細胞 - 細胞外マトリックス接続から解放されると、単一細胞懸濁液を形成することを可能にする。単離された細胞を使用して、マルチパラメータフローサイトメトリーのTECおよび樹状細胞の同定および特徴付けにも適用することができる。のTECは、胸腺では珍しいな細胞集団であるため、私たちも豊かにし、胸腺細胞、胸腺で最も豊富な細胞型を枯渇させることによりTECのを浄化する効果的な方法について説明します。 Folloの細胞生存率の損失はTECの精製の間に最小限に抑えることができるように、翼濃縮を、時間を選別細胞を減少させることができる。精製された細胞は、リアルタイム-PCR、ウェスタンブロット及び遺伝子発現プロファイリングなど、さまざまな下流の分析に適している。プロトコルは、TEC機能の研究と同様にin vitroでのT細胞再構成の開発を推進していきます。

このプロトコルを使用して、胸腺器官成体マウス（セクション2）から除去し、得られた細胞懸濁液を3章で概説されるように胸腺細胞懸濁液を調製した胸腺細胞、造血由来間質細胞および非造血間質細胞から成っていた。 CD45は胸腺細胞とマクロファージや樹状細胞などの造血間質細胞の両方で発現し、造血汎マーカーである。対照的に、TECは、造血起源のものではなく、CD45 15を発現...

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Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

ここでは、単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞（のTEC）を精製するための効率的な方法を記載する。プロトコルは、通常のT細胞の発生、胸腺機能不全、およびT細胞再構成のための胸腺機能の研究のために利用することができる。

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K ビュー.  University of Minnesota. ここでは、単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞（のTEC）を精製するための効率的な方法を記載する。プロトコルは、通常のT細胞の発生、胸腺機能不全、およびT細胞再構成のための胸腺機能の研究のために利用することができる。 

ビデオ: Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

発生生物学

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

生物学

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

免疫・感染学

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

単離と異なる高齢マウス胸腺移植片の移植。

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

単離とマウスリンパ球の活性化

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

胸腺および骨髄からの間質細胞単離の最適化

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

著者スポットライト:シングルセルシーケンシングのための間質細胞単離を用いた造血研究の推進

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

造血器官からの間質細胞の単離

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the thymic cortex induce early T cell development and positive selection of cortical thymocytes. In contrast, medullary TECs (mTECs) in the thymic medulla attract positively selected thymocytes from the cortex and establish self-tolerance in T cells. A variety of molecules, including DLL4 and beta5t expressed in cTECs, as well as Aire and CCL21 expressed in mTECs, contribute to thymus function supporting T cell development and selection. Flow cytometric analysis of functionally relevant molecules in cTECs and mTECs is useful to improve our understanding of the biology of TECs, even though current methods for the preparation of single-cell suspensions of TECs can retrieve only a small fraction of TECs (approximately 1% for cTECs and approximately 10% for mTECs) from young adult mouse thymus. Because many of these functionally relevant molecules in TECs are localized within the cells, we describe our protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse TECs and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric AnalysisMechanisms

We describe protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the ...

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

要約

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胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

単離と異なる高齢マウス胸腺移植片の移植。

EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

単離とマウスリンパ球の活性化

造血器官からの間質細胞の単離

造血器官からの間質細胞の単離

造血器官からの間質細胞の単離

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis